课题2-土壤中分解尿素的细菌的分离与计数.doc

课题2土壤中分解尿素的细菌的分离与计数三维目标1.研究选择培养基对微生物的选择作用，熟悉常见选择培养基的种类。2.学会用固体培养基对微生物进行计数，培养严谨求实的科学实验态度。3.继续熟悉微生物培养的基本操作过程，能根据菌落特点简单地识别常见微生物。学法指导学习本节课之前首先要收集有关尿素的知识，然后要回顾上节课学习的有关微生物培养和培养基的有关知识；学习选择培养基时要多考虑一些常见的选择培养基，如青霉素选择培养基、高浓度食盐选择培养基等，这样有助于充分理解选择培养基的作用机理；统计菌落数目时，一定要对样品充分稀释，并且要进行多组实验，然后去掉明显不合理的组别，对剩余实验组求平均值，这样能使结果更准确。整个实验过程中一定要注意无菌操作，这是实验成败的关键，也是同学们最容易忽视的问题。颜色指示法常用于菌种的鉴定，要熟悉常见菌种的鉴定方法，如常用伊红美蓝培养基鉴别大肠杆菌。重点掌握对土样的选取和选择培养基的配置。诱学导入材料：尿素含氮量46，是固态氮肥中含氮量最高的一种氮肥。尿素施入土壤后，以分子态溶于土壤溶液中，并能被土壤胶体吸附，吸附的机理是尿素与粘土矿物或腐殖质以氢键相结合。尿素在土壤中经土壤微生物分泌的脲酶的作用，水解成碳酸铵或碳酸氢铵。碳酸铵很不稳定，所以施用尿素应深施盖土，防止氮素损失。尿素是中性肥料，长期施用对土壤没有破坏作用。尿素适用于各种土壤和各种作物，它可以作基肥和追肥。因为尿素的含氮量高，在水解过程中施肥点附近NH+4浓度剧增，使土壤中pH在短期内升高12个单位，故会影响种子发芽或幼苗根系的生长，严重时使种子失去发芽能力。问题：作为重要的氮肥，尿素在土壤中只有被分解才能被植物吸收，土壤中能分解尿素的微生物有哪些呢？怎样分离呢？导入：不能分解尿素的微生物不能在氮源为尿素的培养基上生长，据此可以分离能分解尿素的微生物。旁栏思考题1想一想，如何从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数？答：统计某一稀释度下平板上的菌落数，最好能统计3个平板，计算出平板菌落数的平均值，然后按课本旁栏的公式进行计算。2为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？答：这是因为土壤中各类微生物的数量（单位株/kg）是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。练习1提示反刍动物的瘤胃中含有大量的微生物，其中也包括分解尿素的微生物。由于瘤胃中的微生物多为厌氧菌，接触空气后会死亡，因此分离其中能分解尿素的微生物除了需要准备选择培养基外，还应参照厌氧菌的培养方法进行实验设计。筛选菌株1.PCR技术是一种在体外将少量DNA大量复制的技术，PCR技术的原理是如果DNA片段两端的序列是已知的，那么采用PCR就可以很容易地将此DNA片段从整个DNA分子中扩增出来。进行PCR需要一段寡聚核苷酸链作为引物，它们各自与要扩增的靶DNA片段末端互补，引物与模板DNA相结合并沿模板DNA延伸，以扩增靶DNA序列。PCR技术需要使用耐高温的DNA聚合酶，这种酶要能够忍受93 左右的高温。深化升华：PCR的过程由三个基本反应组成（热）变性、复性、延伸，这样构成一个循环的复制，新合成的DNA链又可以作为模板进行下一轮复制，重复3步操作。DNA片段呈2的指数增长，在12小时内可完成2530次的循环，扩增的DNA片段数可增至106107倍。2.选择培养基是指允许特定种类的微生物生长，同时抑制或阻止其他种类微生物生长的培养基。统计菌落数目1.直接计数法这种方法是指利用特定的细菌计数板或者血细胞计数板，在显微镜下计算一定容积样品中微生物的数量。计数板是一块特制的载玻片，上面有一个面积为1 mm2和高0.1 mm的计数室，该计数室又均分成400个小格。测量时将稀释的样品滴加在计数板上，盖上盖玻片，然后在显微镜下数出每个小格所含的细菌的平均数，再按下面的公式求出每毫升样品所含的细菌数。每毫升原液所含的细菌数每小格平均细菌数4001 000稀释倍数要点提示：此方法的缺点是分不清活菌和死菌。2.间接计数法稀释涂布平板法，常用来统计样品中的活菌数，此法是根据微生物在固体培养基上所形成的一个菌落是由一个细菌繁殖而成的现象进行的，也就是说一个菌落就代表一个细菌。计数时先将待测样品进行一系列的稀释，再取一定量的稀释菌液接种在固体培养基上，使其较均匀地分布，经过一段时间的培养后，统计菌落数目，即可求出原液中的细菌数。疑点突破 这种方法计算出的为活菌数目，但是该数目往往比实际数目要小，原因是如果稀释的倍数不够大，很可能出现两个或者更多的细菌在一起共同形成一个菌落的情况，在最后计算时，我们却是按照一个细菌来计算的。联想发散 还可以用红细胞法来测量细菌的数目。该法要求先将数目已知的红细胞与已经稀释的菌液混合均匀，然后在显微镜下观察一滴菌液，计算出红细胞和细菌的数目比例，然后根据其比例推算出细菌的数目。由于这种方法偶然性较大，所以可以多观察几个视野，然后取平均值。