仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测_张新慧.pdf

56|2023 年第 43 卷第3期 总第302期|猪 业 篇试验研究仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及仔猪副猪嗜血杆菌的分离鉴定及耐药性检测耐药性检测张新慧，陈鸿真张新慧，陈鸿真(驻马店农业学校，河南 驻马店 463000)(驻马店农业学校，河南 驻马店 463000)副猪嗜血杆菌病是由副猪嗜血杆菌引起的猪的一种传染性呼吸道疾病。该病常见临床症状为纤维素性胸膜炎、呼吸困难及关节炎等；副猪嗜血杆菌病具有较高的感染率和致死率，给养猪业造成严重的经济损失1-2。在养猪生产过程中，副猪嗜血杆菌病可通过不同途径感染不同年龄段的猪，尤其是 4 8 周龄仔猪，且经常与猪圆环病毒病、猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征等免疫抑制性病毒病混合感染，导致动物死亡加快，给临床诊断带来一定的困难3-4。仔猪副猪嗜血杆菌病已经成为多个国家和地区猪群中普遍流行的疾病之一，不同的国家与地区流行的仔猪副猪嗜血杆菌血清型具有差异性，导致疫苗制备存在一定的困难5-6。由于抗菌药在临床的广泛应用，导致副猪嗜血杆菌产生了严重的耐药性，给该病的临床治疗带来了一定的困难，同时也严重危害着人们的健康7。本试验通过细菌分离培养、形态学观察、生化试验和 PCR 方法对副猪嗜血杆菌进行分离鉴定、致病性和耐药性分析，以期为该地区仔猪副猪嗜血杆菌合理用药及防控提供参考。1 材料与方法1.1 病料2023 年 2 月，采集某规模化猪场中因呼吸道疾病致死的仔猪鼻腔、肺脏、胸腔积液等组织或黏液样本 4 份。1.2 细菌分离与培养在无菌条件下，将采集的鼻拭子、肺脏、胸腔积液等病料样本接种于巧克力培养基上，在 37 恒温培养箱(5 CO2)培养 12 18 h后，挑取培养基上单个的典型菌落，革兰染色，置于显微镜下观察其形态。1.3 细菌生化特性鉴定挑取培养基上典型菌落，接种于胰酪大豆中图分类号：S855.1+2 文献标志码：A 文章编号：1001-0769(2023)03-0056-04摘 要：本试验采用细菌分离培养、形态学观察、生化试验和 PCR 方法对采集的患呼吸道病死亡的仔猪鼻拭子、肺脏、胸腔积液等病料进行副猪嗜血杆菌分离鉴定；采用人工感染小鼠试验和纸片扩散法(Kirby-Bauer，简称 K-B 法)分别检测分离株的致病性和耐药性。结果分离到 1株副猪嗜血杆菌，并命名为 HS-1 株；分离株 HS-1 能引起小鼠发病与死亡，且死亡率为 100为致病性副猪嗜血杆菌；分离株 HS-1 对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松等 6 种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶等 8 种药物耐药，以期为该地区仔猪副猪嗜血杆菌合理用药及防控提供参考。关键词：副猪嗜血杆菌；致病性；药敏试验；仔猪作者简介：张新慧(1968 )，女，高级讲师，主要从事畜牧兽医专业教学工作|2023年第43卷第3期 总第302期|57 猪 业 篇试验研究胨(tryptone soy broth，TSB)液体培养基中。在 37 恒温培养箱中震荡培养 12 18 h 后，用无菌的 TSB 液体培养基将菌液浓度调整为0.5 个麦氏浊度，按照革兰阳性菌的生化试剂盒说明书对分离菌株进行生化试验鉴定。1.4 细菌 PCR 鉴定参 照 杜 炎 斌 等4报 道 的 方 法，设 计副猪嗜血杆菌分离株鉴定引物。引物序列为 F1：5-TACGGCTACCTTGTTTTG-3；F2：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGG-3，由深圳华夫基因股份有限公司合成，提取分离株 HS-1 的基因组 DNA，以提取的基因组 DNA 为模板，进行 PCR 鉴定。1.5 致病性试验在无菌条件下，挑取巧克力培养基上单个的典型菌落，接种于 TSB 液体培养基中，在37 恒温培养箱中震荡培养至对数生长期，利用菌落计数法对 HS-1 株进行计数，用 TSB液体培养基将菌液浓度调整至 107 CFU/mL。攻毒组和对照组分别为 5 只昆明系小鼠，攻毒组小鼠腹腔注射剂量为 0.25 mL/只，对照组小鼠腹腔注射 0.25 mL/只 TSB 液体培养基，在试验期间观察小鼠发病情况，并对死亡小鼠进行细菌学鉴定，试验期为 6 d。1.6 药敏试验药敏试验参照美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的要求对分离株进行药敏试验和耐药性结果判断。2 结果2.1 细菌分离培养疑似副猪嗜血杆菌的 HS-1 株在巧克力培养基上培养，利用革兰染色镜检观察其形态学(图 1)。HS-1 株培养特性和形态学与伯杰氏细菌鉴定手册中报道的副猪嗜血杆菌的培养特性和形态学基本一致。2.2 细菌生化鉴定结果生化特性结果显示，HS-1株硝酸盐还原酶、接触酶为阳性，分解葡萄糖、果糖；氧化酶试验、吲哚试验、脲酶试验、甲基红(Methyl red，MR)试 验 及 Voges-Proskauer(VP)试 验 为 阴性，不分解甘露醇。与伯杰氏细菌鉴定手册中报道的副猪嗜血杆菌的生化特性基本一致，HS-1 株生化特性鉴定结果为副猪嗜血杆菌。2.3 细菌 PCR 鉴定对分离的HS-1株进行PCR鉴定。结果显示，PCR 扩增出大约为 822 bp 的目的条带(图 2)。对 HS-1 株的 PCR 产物进行测序，其测序结果与 GenBank 中的副猪嗜血杆菌基因序列同源性为 98.9 99.0，表明 HS-1 株为副猪嗜血杆菌。2.4 致病性试验攻毒组的 5 只小鼠在攻毒后 2 3 d 出现了精神沉郁、采食量减少、呼吸困难等临床症58|2023 年第 43 卷第3期 总第302期|猪 业 篇试验研究状，攻毒的小鼠相继出现死亡，第 6 天 5 只小鼠全部死亡，对照组小鼠无临床症状，健康存活。剖检攻毒组小鼠，采集病料组织，分离得到了副猪嗜血杆菌。致病性试验结果表明，HS-1 分离株为致病性副猪嗜血杆菌。2.5 耐药性分析采用纸片扩散法(Kirby-Bauer，简称 K-B法)检测 HS-1 株对常用抗菌药的耐药性，判定结果为耐药(R)、敏感(S)、中敏(I)(表 1)。由表 1 可知，分离的 HS-1 株对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松、多西环素、替米考星、氟苯尼考 6 种药物敏感；对阿莫西林、氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶、多黏菌素、恩诺沙星、环丙沙星、大观霉素、林可霉素 8 种药物耐药。说明分离的 HS-1 株对临床中常用的药物具有不同的耐药性。3 讨论近几年，随着规模化养殖业的迅速发展，猪的饲养量呈现逐年增多的趋势，但副猪嗜血杆菌病作为养猪业常见的传染性疾病，可感染不同年龄段的猪，尤其是仔猪，具有发病急、高死亡率等特点，严重危害着我国养猪业的发展1-4。副猪嗜血杆菌广泛存在于饲养环境中，可以通过多种途径在不同猪群之间传播，尤其是猪免疫力下降时更容易引发副猪嗜血杆菌病7-8。本试验从患呼吸道病死亡的仔猪鼻拭子、肺脏、胸腔积液等病料中分离得到 1 株致病性副猪嗜血杆菌 HS-1 株，通过药敏试验结果显示，分离株HS-1对头孢噻呋、头孢噻肟、头孢曲松等 6 种药物敏感，对阿莫西林、氨苄西林、磺胺间甲氧嘧啶等 8 种药物耐药。说明分离的副猪嗜血杆菌对常用抗菌药产生严重的耐药性。因此，在临床防治副猪嗜血杆菌中应进行药敏试验，选择敏感的药物进行交替使用，应注意副猪嗜血杆菌病的疫苗免疫，同时配合环境的消毒，提高其治疗效果。参考文献1 肖敏，刘建，卢昌，等副猪嗜血杆菌的分离鉴定与灭活疫苗的初步研制 J动物医学进展，2022，43(8)：35-402 赵自亮，田宇森，庄鸿琨，等副猪嗜血杆菌与 PCV3|2023年第43卷第3期 总第302期|59 猪 业 篇八眉猪种质资源保护与选育八眉猪种质资源保护与选育闫红军闫红军(杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)(杨凌职业技术学院，陕西 杨凌 712100)我国是世界上畜禽遗传资源丰富的国家之一。多样化的地理生态环境，长期的自然选择和人工选育，造就了众多体型外貌各异、经济性状各具特色的畜禽遗传资源。2020 年 5 月，国家畜禽遗传资源委员会在发布的公告中指出，我国畜禽遗传资源品种达 897 个，其中地方品种猪 83 个，培育品种(含家猪与野猪杂交后代)和配套系猪 38 个。这些丰富的畜禽遗传资源是畜禽育种事业和畜牧业持续健康发展的物质基础，是我国国家安全和经济产业发展的重要保障。随着社会经济的发展，人们对畜禽遗传资源认识的深入，特色畜禽遗传资源的保护与开发利用日益受到政府相关部门的重视和全社会的关注。党的十八大以来，习近平总书记高度关心我国种业安全和发展，曾在多个场合反复强调“要下决心把我国种业搞上去，抓紧培育具有自主知识产权的优良品种，从源头上保障国家粮食安全。”“种源安全关系到国家安全，必须下决心把我国种业搞上去，实现种业科技自立自强、种源自主可控。”八眉猪，头狭长，耳大下垂，额部有纵行“八”字型皱褶，被毛黑色，故名八眉，属脂肪型地方猪种，具有适应性强、抗逆性强、耐粗饲、母性强、产仔多、肉质细嫩、脂肪沉积能力强等特点，遗传性状稳定，在长期近亲交中图分类号：S813.22 文献标志码：A 文章编号：1001-0769(2023)03-0059-04摘 要：八眉猪作为西北地区宝贵的畜种资源，具有肉质好、抗逆性强、耐粗饲的特点，是生产特色猪肉的种源基础。20 世纪八九十年代，由于消费市场对瘦肉的追求，八眉猪等部分地方猪种陷入濒危状态。为加强对八眉猪遗传资源保护与开发利用的技术指导，笔者在调研八眉猪分布与数量的基础上，分析了八眉猪种质资源保护存在的问题，提出了今后保种目标、内容、方法以及选育措施，为八眉猪种质资源保护提供可行性方案。关键词：八眉猪；种质资源；保种；选育遗传育种混合感染的实验室诊断及分析 J中国动物检疫，2022，39(12)：18-253 范春梅湖南省部分家庭猪场呼吸道疾病流行病学调查分析 J中国猪业，2020，15(5)：80-834 杜炎斌，袁丽英，东笑，等英德市某规模化猪场副猪嗜血杆菌分离鉴定及药敏试验 J动物医学进展，2022，43(6)：32-365 冯建远，吴廷瑛，郭旋，等广西规模化猪场呼吸道病原菌调查及耐药性分析 J中国猪业，2020，15(2)：66-696 陈超群，陈佳莉，周萱仪，等-内酰胺类药物对副猪嗜血杆菌流行病学临界值的建立及耐药性的测定 J畜牧兽医学报，2021，52(11)：3234-32457 王庆云安阳地区副猪嗜血杆菌分离株的耐药性与耐药基因检测 J动物医学进展，2021，42(4)：131-1348 王同兆，张付贤，雷连成1 株副猪嗜血杆菌血清 4型的分离鉴定及耐药性分析 J中国畜牧兽医，2022，49(3)：1096-1105