正交设计优化银杏总内酯的提取工艺_潘雨婷.pdf

2023 年 第 7 期 化学工程与装备 2023 年 7 月 Chemical Engineering&Equipment 13 正交设计优化银杏总内酯的提取工艺正交设计优化银杏总内酯的提取工艺3 3 潘雨婷，马 荣，丛景香（辽宁科技大学化学工程学院，辽宁 鞍山 114051）摘 要：摘 要：银杏总内酯是银杏提取物中的重要活性部位，具有重要的药理作用。利用正交设计实验优化银杏总内酯的超声酶法提取工艺条件。考察酶用量、pH 值、提取时间和提取温度对银杏总内酯提取效果的影响。在所选范围内，提取总内酯的最佳条件为：0.1 g 原料的酶用量为 9 mg，溶剂为 pH 值为 5.1 的水溶液，提取温度 45，提取时间 40 min。关键词：关键词：银杏总黄酮；提取；响应面法 通讯作者：通讯作者：丛景香 银杏树又名白果树，是地球上生长的最古老的植物之一。银杏在我国分布较广，它因集食用、药用、材用及美化环境于一体，而受到各族人民的喜爱，被誉为“中国国树”，其种植面积也不断扩大。银杏中含有多种化学成分1，如萜内酯类、黄酮类、聚戊烯醇、酚类、生物碱和多糖等等，其中内酯类成分生物活性较强，在银杏中含量相对较高，它的研究越来越受到重视。银杏内酯类成分具有活血通络、改善脑营养、抗氧化、抑制癌细胞增长、治疗中枢神经损伤等多种药理作用2，3。银杏内酯类化合物作为药用和保健用原料，市场需求量不断增大。目前，随着研究的深入和需求量的增加，需要更加有效的提取分离银杏内酯类化合物。常用的提取分离方法有溶剂萃取法、色谱法、超临界流体萃取法、酶预处理法等4，5。本文在使用超声酶提取银杏总内酯的工艺条件下，使用正交设计实验进一步优化并确定了银杏总内酯的最佳提取工艺，为更有效的获得银杏内酯类成分提供参考。1 仪器与试剂 1 仪器与试剂 1.1 试剂 银杏提取物（西安瑞鸿生物科技有限公司），纤维素酶（杭州生物科技有限公司），标准品银杏内酯 A、B、C（Sigma公司），二次蒸馏水（自制），甲醇（分析纯，北京化工厂），乙醇（分析纯，北京化工厂）1.2 仪器与材料 LC-10ATVP 高效液相色谱仪（岛津公司），SPD-10AVP紫外检测器（岛津公司），876-1 型真空干燥箱（南通科学仪器厂），电子天平（0.1mg210g，Startorius），SB2200超声器（上海申波超声公司）2 方法与结果 2 方法与结果 2.1 HPLC 检测条件 流动相为体积比 45:55 的甲醇:水溶液。固定相为 5m ODS（安捷伦色谱柱，1504.6 mm）。检测波长 220 nm，洗脱流速 1 mL/min，每次进样体积均为 2 L。2.2 单因素实验 以提取银杏黄酮后的剩余物作为原料，以银杏内酯A、B、C的色谱检测峰面积百分比之和为目标函数，依次考察纤维素酶的用量、提取溶剂的pH值、超声提取时间和提取温度对银杏总内酯提取效果的影响。2.2.1 酶用量对总内酯提取结果的影响 准确称取银杏提取物原料0.1 g，5份，分别放入5个试管中，依次加2、4、6、8、10 mg的纤维素酶，各试管分别加入pH=4.5的乙醇溶液10 mL，盐酸调节酸度值，在40 恒温水浴的情况下，超声提取30 min，取出用滤纸过滤，进行HPLC分析检测。得到银杏总内酯峰面积和酶用量的关系如图1所示，随着酶用量的增加，银杏总内酯峰面积百分比逐渐增加，当酶用量为8 mg时，提取得到的总内酯峰面积最高。之后，增加酶用量，总内酯含量下降，为此选择0.1 g原料加入酶用量为8 mg时进行提取比较适宜。2.2.2 pH 值对总内酯提取结果的影响 同上称取0.1 g银杏提取物原料5份，放入5个试管中，依次加入纤维素酶8 mg，依次加入10 mL乙醇溶液，用少量盐酸分别调节成pH=4.1，4.3，4.5，4.7，4.9的提取溶剂，在40 下超声提取，提取时间为30 min，取出后用滤纸过滤，进行HPLC分析检测。图2为总内酯的峰面积和pH值的关系曲线，随着pH值的增加，银杏总内酯峰面积百分比呈现先增加，后降低再增加的趋势。当pH为4.9时，银杏总内酯峰面积百分比最大，为此选择pH为4.9的溶剂进行提取比较适宜。2.2.3 提取时间对总内酯提取结果的影响 同上称取0.1 g银杏原料5份，分别放入5个试管中，依次加入纤维素酶8 mg，加入10 mL乙醇溶剂，用盐酸调节成pH=4.9，在40的情况下提取，提取时间分别为20 min，30 min，40 min，50 min及60 min，提取结束取出用滤纸过滤，DOI:10.19566/35-1285/tq.2023.07.01514 潘雨婷：正交设计优化银杏总内酯的提取工艺 进行HPLC分析检测。银杏总内酯的峰面积和提取时间的关系如图3所示。随着提取时间的增加，银杏总内酯峰面积百分比呈现先增加，后降低的趋势。当提取时间为50 min时，银杏总内酯峰面积百分比最大，为此选择原料的提取时间为50 min比较适宜。图1 酶用量对总内酯提取的影响 图2 pH值对总内酯提取的影响 图1 酶用量对总内酯提取的影响 图2 pH值对总内酯提取的影响 2.2.4 提取温度对总内酯提取结果的影响 同上称取5份大黄原料，固定酶用量、pH值和提取时间为上述最佳值，分别在温度为35、40、45、50、55 条件下提取，过滤提取液并检测结果。所得总内酯的峰面积百分比和提取温度的关系见图4，在不同提取温度下，随着提取温度的增加，银杏总内酯峰面积百分比呈现先增加，后降低的趋势。当温度为45时，银杏总内酯峰面积百分比最大，为此选择0.1 g原料在温度为45 时进行提取比较适宜。图3 提取时间对总内酯提取的影响 图4 提取温度对总内酯提取的影响 图3 提取时间对总内酯提取的影响 图4 提取温度对总内酯提取的影响 综上所述可得出单因素选择提取银杏总内酯的条件为：0.1 g原料的酶用量为8 mg，溶剂为pH值为4.9的水溶液，提取温度45，提取时间50 min。2.3 正交试验 2.3.1 正交试验设计与结果 根据单因素实验结果，设计响应面法优化银杏总内酯实验方案，选用L9（34）正交表继续优化酶用量A、pH值B、提取温度C、提取时间D各因素对银杏总内酯提取效果的影响，各因素水平表见表1，具体实验方案、结果及极差分析见表2。表 1 四因素三水平表 表 1 四因素三水平表 水平因素 A 酶用量/mg/0.1g 原料 B pH 值 C 提取温度/D 提取时间/min 1 9 4.7 40 45 2 8 4.9 45 50 3 7 5.1 50 55 潘雨婷：正交设计优化银杏总内酯的提取工艺 15 表 2 正交实验结果及极差分析表 表 2 正交实验结果及极差分析表 序号 A B C D 峰面积百分比/%1 1 1 1 1 37.16 2 1 2 2 2 36.01 3 1 3 3 3 36.12 4 2 1 2 3 32.99 5 2 2 3 1 35.68 6 2 3 1 2 33.33 7 3 1 3 2 33.54 8 3 2 1 3 37.28 9 3 3 2 1 37.51 I 36.43 34.56 35.9236.78 II 34.00 36.32 35.5034.29 III 36.11 35.65 35.1135.46 R 2.43 1.76 0.812.49 表 2 的结果表明：对于考察指标，因素 D 对总内酯提取的影响最大，其次为 A、B，因素 C 影响最小。即各因素的影响次序为：DABC，优化得到的最佳方案为：A1B2C1D1。图 5 是各因素水平对总内酯提取的影响趋势图。同样可以很清楚地知道各因素水平的影响效果，得到银杏总内酯的最佳提取工艺，即 0.1 g 原料的酶用量为 9 mg，溶剂为 pH 值为4.9 的水溶液，提取温度 40，提取时间 45 min。图 5 各因素水平的影响趋势图 图 5 各因素水平的影响趋势图 2.3.2 实验验证结果 重复三次最佳方案条件下的实验，分别得到银杏总内酯峰面积百分比依次为38.36%、37.98%、38.54%。银杏内酯提取指标的相对误差RSD在1%以内，表明该实验的重现性良好，因此本文优选的最佳实验方案为A1B2C1D1。3 结 论 3 结 论 超声酶法提取银杏总内酯的过程中，各因素中提取时间、pH值对提取结果的影响最为明显，其次是提取温度，考察范围内酶用量对提取影响最小。通过正交试验优化得到提取银杏总内酯的最佳超声酶提取工艺条件：0.1 g原料的酶用量为9 mg，溶剂为pH值为4.9的水溶液，提取温度40，提取时间45 min。致 谢 致 谢 感谢辽宁科技大学大学生创新创业训练计划项目（离线二维液相色谱分离银杏活性成分的研究 项目编号 117）对本研究提供的支持。参考文献 参考文献 1 吴平,姚芳,祁兴普,等.银杏全资源主要成分与功能活性J.食品工业科技,2022,43(09):447-455.2 朱梦莹,任佳妮,沈娜,等.银杏外种皮化学成分、生物活性和资源利用的研究进展J.华西药学杂志,2022,37(05):587-593.3 王刚,姚明江,徐立,等.银杏内酯类成分治疗缺血性脑卒中药理作用机制的研究进展J.中药药理与临床,2021,37(02):216-220.4 蔡琳,杜瑜,彭鹏.银杏中银杏内酯提取方法及其药理作用的研究进展J.安徽化工,2022,48(03):18-19+22.5 冯自立,赵正栋,孙茜,等.正交实验优化酶解预处理提取银杏叶黄酮和内酯的工艺J.应用化工,2019,48(05):1119-1121.