限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓...因应激诱导蛋白1表达的影响_李慧红.pdf

动物营养学报，（）：限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白 表达的影响李慧红 罗朋娜 焦静娅 张怀勇 陈 文 黄艳群（河南农业大学动物科技学院，郑州）摘 要：本试验旨在研究限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白（）表达的影响，并分析二者的相关性。试验：分别选取不同生长发育阶段（、胚龄和、日龄，）爱拔益加（）肉鸡各个组织样，检测 的时空表达特性；试验：选取 日龄肉鸡 只，分为对照组（）、能量限饲组（）和 蛋白质限饲组（），饲喂至 日龄，分别随机选取 只，采集胸肌组织，探究不同限饲处理对 表达的影响；试验：选取 日龄肉鸡 只，分为喂食组（正常饲喂，）和禁食组（禁食 ，），测定血糖浓度后采集胸肌组织，检测 的表达变化；试验：分别对鸡只进行外源腹腔注射葡萄糖（日龄，体重，）、丙酮酸钠（日龄，体重，）和胰岛素（日龄，体重，），测定血糖浓度后采集胸肌组织，检测 的表达变化。最后进行 相对表达量与血糖浓度相关性分析。结果表明：）在 胚龄，在肝脏中相对表达量最高，显著高于其他组织（）；在 胚龄和 日龄时，在胸肌中相对表达量最高，显著高于其他组织（）；在 日龄时，在胰腺中相对表达量最高，显著高于其他组织（）。）能量限饲组的胸肌中 相对表达量高于对照组（），蛋白质限饲组的胸肌中 相对表达量极显著低于对照组（）。禁食组的血糖浓度极显著低于喂食组（），胸肌中 相对表达量极显著高于喂食组（）。）胰岛素处理极显著降低了 时血糖浓度（），同时极显著上调了 时胸肌中 相对表达量（）；丙酮酸钠处理极显著降低了 时血糖浓度（），同时极显著上调了 时胸肌中 相对表达量（）。）胸肌中 相对表达量与血糖浓度呈极显著负相关（，）。由此可见，具有明显的时空表达特性，限饲和外源刺激可不同程度影响胸肌中 的表达，且胸肌中 相对表达量与血糖浓度呈极显著负相关。关键词：外源刺激；限饲；基因表达；胸肌；血糖中图分类号：文献标识码：文章编号：（）收稿日期：基金项目：国家自然科学基金（）作者简介：李慧红（），女，河南信阳人，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖。：通信作者：黄艳群，教授，博士生导师，：是一类高度保守的应激诱导蛋白。在哺乳动物中，该家族由 个成员组成：应激诱导蛋白（）、应激诱导蛋白（）和应激诱导蛋白（）。大量的研究发现，家族具有 个主要生物学功能：）可以作为抗氧化剂，通过增强机体对各种环境应激的适应能力来减少活性氧（）的产生 和 积累，进而延缓机体衰老；）可通过激 期李慧红等：限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白 表达的影响活磷酸腺苷活化蛋白激酶（）和抑制营养传感蛋白复合物（）来抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物（），从而防止心血 管 疾 病、肿 瘤 和 糖 尿 病 等 代 谢 性 疾 病 的发生。（也称）在机体中广泛存在，且在骨骼肌中相对表达量最高，具有防止肌肉萎缩、增强机体耐力的作用。有研究表明，的缺乏会增强肥胖诱导的胰岛素抵抗和糖尿病的进展。等研究发现，抗癌药物顺铂可通过抑制 的表达来诱导机体产生胰岛素抵抗，最终导致机体发生型糖尿病。等发现身体健康的人体内 和 的相对表达量要明显高于型糖尿病患者。上述研究结果显示 家族与机体的糖代谢有关，但是研究对象主要集中在人、小鼠等哺乳动物，关于鸡 的研 究 却 少 有 报 道。因 此，本 试 验 通 过 探 索 在肉鸡中的时空表达特性，分析了外源胰岛素、葡萄糖、丙酮酸处理以及禁食、能量限饲、蛋白质限饲处理对 表达的调控特性，以揭示鸡 的时空表达规律和外源刺激对 表达的效应，为后续深入研究鸡 的生物学功能和家禽葡萄糖稳态调控的分子机制提供参考。材料与方法 试验材料 试验动物 选取爱拔益加（）肉鸡种蛋 枚进行孵化，出壳后随机分配在 层笼养架进行单笼饲养，每个笼子 只鸡。鸡只自由采食，自由饮水。光照时间为 ，第 周控制鸡舍温度为 ，以后每周温度递减 ，按照鸡的常规免疫程序进行免疫，试验期 ，饲粮的配制参考鸡饲养标准（）。根据以下试验设计方案饲养至相应日龄，随机选取相应数量鸡只展开试验。试验设计及样品采集 试验：分别于、胚龄挑选 枚种蛋，、日龄挑选 只肉鸡，采集其心脏、肝脏、肌胃、腺胃、胸 肌、腿 肌、大 脑 和 胰 腺 组 织 样 品，用 于 鸡 的时空表达特性分析，所有采集的组织样品置于液氮中速冻后于 冰箱保存备用。试验：日龄时随机挑取 只肉鸡，分为对照组（）、能量限饲组（）和 蛋白质限饲组（），饲粮组成及营养水平参考本实验室前期研究。于 日龄时每组各屠宰 只鸡，采集胸肌组织，采集组织样品置于液氮中速冻后于 冰箱保存备用。试验：日龄时随机选取 只肉鸡，分为禁食组（）和喂食组（），禁食组禁食（禁食期间自由饮水），喂食组自由采食、自由饮水。禁食和喂食结束后翅下采血，用血糖仪测定鸡只血液葡萄糖（以下简称血糖）浓度并屠宰，采集胸肌组织样品置于液氮中速冻后 保存保存备用。试验：）日龄时随机挑选 只肉鸡，禁食 后，葡萄糖组（）鸡只腹腔注射葡萄糖溶液（），生理盐水对照组（）鸡只注射同等量的生理盐水，分别测定注射后、和 的血糖浓度，组分别于注射后 和 采集胸肌组织（）。）日龄时随机挑选 只肉鸡，禁食 后，丙酮酸钠 组（）鸡 只 注 射 丙 酮 酸 钠 溶 液（），生理盐水对照组（）鸡只注射等量的生理盐水，分别测定注射后、和 的血糖浓度，组分别于注射后（基础状态）和 采集胸肌组织（）。）日龄时随机挑选 只肉鸡，禁食 后，胰岛素组（）注射胰岛素溶液（），磷酸盐缓冲液（）对照组（）注射等量 溶液，试验所用胰岛素用 进行稀释（胰岛素），分别测定注射后、和 时的血糖浓度，组分别于在注射后（基础状态）、和 采集肉鸡胸肌组织（）。所有组织样品置于液氮中速冻后 保存保存备用。试验方法 提取与 合成 采用 法提取肉鸡各组织的总，利用 琼脂糖凝胶电泳检测 质量，分光光度计 测 定 浓 度 及 吸 光 度（）值。参 照 （）（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）说明书进行 的反转录。反转录过程分为 步，第 步首先去除基因组：、，用 补动 物 营 养 学 报 卷充至 ，于 孵育 。第 步合成：第 步的混合液 、于 孵育 ，孵育。得到的 保存于 备用。实时荧光定量（）检测基因的表达根 据 中 和 肌 动 蛋 白（）序列，采用 软件设计引物，通过生工生物工程（上海）股份有限公司合成引物，引物序列如表所示。用作内参基因。在通过 测序验证引物的可靠性后，采用 检测鸡 在不同发育阶段、不同组织和不同处理中的相对表达量。反应体系为 ：（），上、下游引物各 ，组织 模板 ，水。反应程序：；，共 个循环。每个反应体系均设置 个生物学重复和 个技术重复，运用 法分析所得数据。表 引物序列 引物名称 登录号引物序列（）退火温度 预期长度 应激诱导蛋白：肌动蛋白：数据分析 试验数据采用 软件进行分析，对包含 个以上处理的数据采用单因素方差分析，并进行 氏法多重比较；对包含 个处理的数据采用独立样本 检验进行分析，对 相对表达量与血糖浓度进行 相关性检测。以 作为差异显著判断标准，作为差异极显著判断标准。结果采用 软件制图。结 果 的时空表达特性 为了探究 的时空表达特性，本研究利用 检测 在肉鸡不同发育阶段的组织表达情况。结果表明，在所检测的组织广泛表达，但在不同发育时期具有明显不同的表达模式。在胚胎发育早期（胚龄），在肝脏中相对表达量最高，显著高于其他组织（），而在胸肌、肌胃和大脑中相对表达量较低，显著低于其他组织（）（图）。在胚胎发育后期（胚龄），在胸肌中相对表达量最高，显著高于其他组织（），其次是腿肌和心脏，而在腺胃中相对表达量最低（图 ），在胸肌中相对表达量约是腺胃中的 倍。在 日龄时，在胸肌中相对表达量最高，显著高于其他组织（），在肌胃中相对表达量最低（图）。在 日龄时，在胰腺中相对表达量最高，显著高于其他组织（），在肌胃中相对表达量最低（图）。由图 可见，在胸肌中，在 胚龄时相对表达量最低，显著低于其他时间点（）；在 胚龄时相对表达量最高，显著高于其他时间点（）；在 和 日龄时相对表达量显著低于 胚龄时（），显著高于 胚龄时（）。由图 可见，在腿肌中，在 胚龄时相对表达量最低，显著低于 胚龄时（）；在 胚龄时相对表达量最高，显著高于 胚龄时（）；在 和 日龄时相对表达量显著高于 胚龄时（）。由图 可见，在胰腺中，在 日龄时相对表达量最高，显著高于其他时间点（）。外源胰岛素、丙酮酸钠和葡萄糖对肉鸡血糖浓度和 表达的影响由图、图 和图 可见，对照组的血糖浓度随时间无明显变化，稳定在约 左右。胰岛素组的血糖浓度几乎呈线性下降，且在 时达到最低，极显著低于 对照组（），在 时血糖浓度仍然极显著低 期李慧红等：限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白 表达的影响于 对照组（）。丙酮酸组的血糖浓度先呈直线式逐渐上升，且在 时血糖浓度最高，极显著高于生理盐水对照组（），之后开始逐步缓慢下降。葡萄糖组的血糖浓度先升高，在 时血糖浓度最高，极显著高于生理盐水对照组（）；之后血糖浓度开始下降，并在 时 血 糖 浓 度 基 本 恢 复 至 基 础 状 态（左右），此时葡萄糖组的血糖浓度与生理盐水对照组无显著差异（）。数据柱标相同小写字母表示差异不显著（），不同小写字母表示差异显著（）。图 同。（），（）图 的时空表达分析 图 在鸡只不同发育时期的胸肌、腿肌和胰腺中的表达 ，基因的时空表达结果显示，在骨骼肌中优势表达，骨骼肌又是葡萄糖代谢的重要场所，因此本研究选取胸肌为研究对象，进一步分析外源处理对肉鸡 表达的影响。由图 、图 和图 可见，在 时，胰岛素组的胸肌中 相对表达量极显著高于 对照组（）；时胸肌中 相对表达量极显著高于 和 时（）。在 动 物 营 养 学 报 卷时，丙酮酸钠组的胸肌中 相对表达量极显著高于生理盐水对照组（）；时胸肌中 相对表达量极显著高于 时（）。与生理盐水对照组相比，葡萄糖组的胸肌中 相对表达量在 和 时均无显著差异（）。：胰岛素组；：对照组；：葡萄糖组；：生理盐水对照组；：丙酮酸钠组。：；：；：；：；：表示差异显著（），表示差异极显著（）。图 同。（），（）图 外源胰岛素、丙酮酸钠和葡萄糖对血糖浓度和胸肌中 基因表达的影响 ，禁食和限饲对 表达的影响 由图 可见，禁食 后，禁食组的血糖浓度为 ，而喂食组 的 血 糖 浓 度 为 ，禁食组的血糖浓度极显著低于喂食组（）。由图 可见，禁食组的胸肌中 相对表达量极显著高于喂食组（）。进一步利用实验室构建的限饲群体，分析能量限饲和蛋白质限饲对 表达的影响，由图 和图 可见，能量限饲组的胸肌中 相对表达量高于对照组（），而 蛋白质限饲组的胸肌中 相对表达量极显著低于对照组（）。胸肌中 相对表达量与血糖浓度的相关性分析 基于以上试验研究，对胸肌中 相对表达量与血糖浓度进行了相关性分析。由图 可见，胸肌中 相对表达量与血糖浓度呈极显著负相关（，）。讨 论 组织表达特性分析是研究基因功能的重要手段之一，基因的差异表达与生物学功能密切相关。本研究发现肉鸡 呈现了明显不同的时空表达特性，在胚胎发育后期及出壳后的骨骼肌中高表达，而这个阶段正是肉鸡肌肉快速发育的阶段，这提示 在肉鸡肌肉发育中的潜在重要功能。等通过转录组测序（）技术研究发现，卢宁鸡 的不同可变剪接体在不同发育阶段的腓肠肌中差异表达。期李慧红等：限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白 表达的影响 等使用 微阵列方法研究发现，经历过断奶后严重营养不良的肉牛骨骼肌中 的相对表达量减少了 倍。等研究发现，可以通过靶向 调控 信号通路，从而影响鸡成肌细胞增殖和凋亡，并参与成肌细胞分化。这些研究结果均提示该基因在鸡肌肉发育方面具有重要的调节作用。图 禁食和限饲对胸肌中 表达的影响 图 胸肌中 相对表达量与血糖浓度的相关性分析 在患有肥胖症小鼠的肌肉和脂肪等组织中表达上调，而 的敲除会降低机体对葡萄糖的耐受性，诱导机体产生胰岛素抵抗和肝脂肪变性，这表明应激诱导 家族在控制糖脂代谢方面可能具有重要的生物学功能。等发现与非糖尿病受试者相比，敲除二型糖尿病（）患者肝脏中的胰岛素降解酶抑制剂（）会使机体内的胰岛素发生累积，降低机体内的血糖浓度，上调 的表达。等模拟太空飞行小鼠的试验发现，与地面对照组相比，微重力小鼠的胰岛素敏感性显著降低，并且通过对小鼠的背最长肌组织转录组测序发现 表达上调，表明其可能与胰岛素抵抗有关。时空表达研究显示在鸡只不同发育阶段的胰腺组织均可检测到 的表达，且在 日龄的胰腺组织高表达，提示了鸡 的胰岛素敏感性及其在糖代谢上的潜在作用。骨骼肌被认为是维持哺乳动物葡萄糖稳态的主要部位，胰岛素可通过促进骨骼肌葡萄糖的吸收进而降低血糖浓度。本研究发现，胸肌中 相对表达量与血 糖 浓 度 呈 极 显 著 负 相 关，胰 岛 素 处 理 后 肉鸡的血糖浓度降至最低，而 的表达在 时显著上调，显示外源胰岛素在一定程度上通过促进鸡胸肌 的表达，进而影响肉鸡的血糖浓度。禁食、限饲、外源注射葡萄糖和丙酮酸钠试验可通过影响内源胰岛素的分泌进而影响糖代谢。骨骼肌可通过糖酵解将葡萄糖分解为丙酮酸，反过来，丙酮酸经过糖异生途径生成葡萄糖，葡萄糖由血液运往肌肉，经糖降解途径转变成丙酮酸，由此形成循环。本研究发现，骨骼肌中 动 物 营 养 学 报 卷对外源葡萄糖刺激不敏感而对丙酮酸敏感，表明 是鸡骨骼肌丙酮酸敏感型而非葡萄糖敏感型基因，提示鸡骨骼肌 可能通过调控丙酮酸代谢进而参与血糖调控。禁食可使机体血糖浓度降低，而降低胰岛素剂量可降低低血糖发生的机率。本研究发现，禁食、能量限饲和的蛋白质限饲也以明显不同的方式显著影响了鸡胸肌中 的表达，禁食、能量限饲产生了与外源胰岛素刺激相似的效应，降低了血糖浓度，上调了胸肌中 的表达，而 蛋白质限饲则显著降低胸肌中 的表达，显示不同限饲模式对鸡 的表达具有明显不同的效应。本研究从多个角度探究了不同外源刺激对鸡抗氧化基因 表达的效应，可为后续深入研究鸡 的生物学功能和家禽葡萄糖稳态调控的分子机制提供参考。结 论 呈现明显的时空表达特异性，并在胚胎发育后期和出生后的胸肌中高表达。外源刺激与限饲处理可不同程度地改变胸肌中 的表达，且胸肌中 相对表达量与血糖浓度呈极显著负相关。参考文献：王星，韩薇应激诱导蛋白 的研究进展医学综述，（）：，（）：（）刘佳秋，韩薇 调控机制研究进展中国循证心血管医学杂志，（）：，（）：（），（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：田雪，高宇 在糖脂代谢相关疾病中的研究进展中国动脉硬化杂志，（）：，（）：（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：期李慧红等：限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白 表达的影响 ，：王焕杰，杜鹏飞，张吉昌，等注射胰岛素对不同品种鸡血糖浓度和采食情况的影响动物营养学报，（）：，（）：（）杨苏亮，李敏，夏梦芳，等不同限饲方法对爱拔益加肉鸡生长性能、屠宰性能及骨骼性状的影响动物营养学报，（）：，（）：（）方霞 参与肝脏糖脂代谢调控及其机制研究博士学位论文重庆：重庆医科大学，：，（）康凌宇，倪忠，武俊明，等实时荧光定量 技术在生物饲料中的应用 中国饲料，（）：，（）：（），：许花芬，冯琼，李春蕾支气管哮喘患儿基质金属蛋白酶、自噬相关基因 和自噬相关基因 的表达及其与肺功能的相关性实用临床医药杂志，（）：，（）：（），（）：，：，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（），（）：，：，（）：，（），（）：晁碧辉，宋万明，李瑶兰，等生物素对动物糖、脂代谢的影响及其作用机制动物营养学报，（）：动 物 营 养 学 报 卷 ，（）：（），（）：牛美丽有氧运动联合膳食控制对 型糖尿病大鼠骨骼肌糖代谢的影响硕士学位论文扬州：扬州大学，：，（），？，（）：，（）：，：，（）：，（）：期李慧红等：限饲与外源刺激对肉鸡血糖浓度及抗氧化基因应激诱导蛋白 表达的影响，：（责任编辑 武海龙）（，）：（），：（）（，），；：，（），（）（），；：，（，）（，），；：（，），（，）（，），：），（）；，（）；，（）（），（）（），（）（），（）；（），（）（，），（）：；