长读长测序技术在肿瘤领域中的应用：进展与挑战_杨谨衔.pdf

海军军医大学学报2023 年 4 月第 44 卷第 4 期http:/Academic Journal of Naval Medical University,Apr.2023,Vol.44,No.4 385 中青年学者论坛 收稿日期 2022-12-05 接受日期 2023-02-15作者简介 杨谨衔，硕士生 E-mail:*通信作者（Corresponding author）.Tel:[phone],E-mail:wenwen_文 文 海军军医大学（第二军医大学）第三附属医院实验诊断科主任，国家肝癌科学中心课题组长，研究员、教授、博士生导师。师承王红阳院士，主要从事肝癌发生、发展的机制及肝癌分子标志物与分子分型的研究。近 10 年来主持国家新药创制科技重大专项课题、传染病防治重大专项子课题、国家自然科学基金等多个科研项目，获得国防科技卓越青年科学基金资助。入选上海市青年科技启明星计划、上海市浦江人才计划、海军军医大学（第二军医大学）领航人才计划。以第一作者或通信作者（含共同作者）在Cell、Hepatology、Cancer Research等SCI收录期刊发表论文 20 余篇，论文他引频次共计 700 余次；获国家发明专利授权 3 项；参编学术专著 4 部。兼任全军生物技术专业委员会委员、上海市医学装备协会实验医学专业委员会委员，担任Journal of Cancer Research and Clinical Oncology杂志副主编。DOI：10.16781/j.CN31-2187/R.20220923长读长测序技术在肿瘤领域中的应用：进展与挑战杨谨衔1,2,3，陈淑桢2,3，王红阳2,3，文 文1,2,3*1.海军军医大学（第二军医大学）第三附属医院实验诊断科，上海 2004382.海军军医大学（第二军医大学）国家肝癌科学中心，上海 2004383.海军军医大学（第二军医大学）第三附属医院国际合作生物信号转导研究室，上海 200438摘要 相较于目前普遍应用的二代测序（NGS）技术，长读长测序（LRS）技术是一种能够连续读取数百万个碱基对的测序技术。本文回顾了单分子实时测序技术、牛津纳米孔测序技术和新型单分子LRS 技术在肿瘤领域的研究应用。LRS 技术能够更精确地检测肿瘤基因组变异，包括结构变异、拷贝数变化、基因融合等。除基因组变异检测外，LRS 技术还为描绘转录组图谱、表观遗传修饰图谱提供了有效手段。LRS 技术可以有效弥补 NGS 技术的部分技术瓶颈，深入揭示生物大分子在健康和疾病状态下的复杂性状，为更好地理解肿瘤的发生与发展机制、制定治疗策略和开发药物提供新的理论基础。此外，本文还展望了LRS 技术在肿瘤领域临床应用中的潜在价值。关键词 长读长测序；单分子测序；纳米孔测序；肿瘤中图分类号 R 730文献标志码 A文章编号 2097-1338(2023)04-0385-09Application of long-read sequencing in oncology:progress and challengesYANG Jin-xian1,2,3,CHEN Shu-zhen2,3,WANG Hong-yang2,3,WEN Wen1,2,3*1.Department of Laboratory Medicine,The Third Affiliated Hospital of Naval Medical University(Second Military Medical University),Shanghai 200438,China2.National Center for Liver Cancer,Naval Medical University(Second Military Medical University),Shanghai 200438,China3.International Cooperation Laboratory on Signal Transduction,The Third Affiliated Hospital of Naval Medical University(Second Military Medical University),Shanghai 200438,China Abstract Compared to the commonly used second-generation sequencing(NGS),long-read sequencing(LRS)is capable of continuously reading millions of base pairs.This article reviews the recent progress in the applications of single-molecule real-time sequencing technologies,Oxford nanopore sequencing technologies and novel single-molecule LRS technologies.LRS technologies facilitate the detection of genomic variations,including structural variations,copy number changes,gene fusions,etc.Moreover,LRS technologies provide an effective tool for profiling transcriptome and epigenetic modification.LRS can also solve part of the technical bottleneck of the NGS and help to reveal the complexity of biological 海军军医大学学报 2023 年 4 月，第 44 卷 386 macromolecule in health and disease conditions,which may provide a new theoretical basis for better understanding the mechanisms of carcinogenesis and malignant progression,subsequently leading to development of novel therapeutic strategies and drugs.Besides,this review outlines the potential advantages of the application of LRS in clinical practice of oncology.Key words long-read sequencing;single-molecule sequencing;nanopore sequencing;neoplasmsAcad J Naval Med Univ,2023,44(4):385-393目前，二代测序（second-generation sequencing，NGS）技术凭借其高通量、高准确性与低成本等优势在基因组测序市场占据主导地位。该技术将基因组打断为小片段，在对每个片段进行测序后生成一小段 DNA 序列，即读长（reads）1。但是，这种方法会导致基因组数据高度碎片化，产生不完整甚至错误的组装。近年来，对读长的更高需求加速了长读长测序（long-read sequencing，LRS）技术的发展。与短读长测序技术相比，LRS 技术无须将 DNA片段化便可进行测序，能够跨越整个重复序列并实现连续和完整的组装。随着测序通量和准确性的提升，LRS 技术可以测定上万至几兆碱基的连续序列，技术成熟度稳步提升。目前常使用的LRS 技术主要有美国太平洋生物科技公司（Pacific Biosciences，PacBio）研发的单分子实时（single molecule real-time，SMRT）测序系统和牛津纳米孔科技有限公司（Oxford Nanopore Technologies，ONT）研发的纳米孔测序技术，它们均能跨越基因组中高重复性的区域，实现核酸分子更精确、完整的检测，从而识别基因组中大片段的变异和更多的转录本。1 LRS技术原理1.1 SMRT测序技术 SMRT测序技术采用了一种拓扑环状的 DNA 分子模板，称为 SMRTbell。该模板由两端带有单链发夹式接头的双链 DNA 插入物组成。组装好的 SMRTbell与 DNA 聚合酶结合，并被装载到包含多达 800 万个零模波导孔（zero-mode waveguide，ZMW）的 SMRT CELL 芯片上2。在测序反应过程中，聚合酶围绕SMRTbell进行反应，用荧光标记的脱氧核苷三磷酸合成新生链。在每次掺入后，激光将会激发荧光基团，并利用相机记录荧光信号（图 1A）。2019 年，PacBio 开发了循环共识测序（circular consensus sequencing，CCS），该方法通过从单个模板分子的多次检测中得出共有序列，从而实现高碱基准确度3，在长度约为 13 kb 的序列中碱基准确度超过 99%。但该测序过程需要约 10 g DNA样本，在检测样本量有限的微小肿瘤或早期肿瘤中应用困难。此外，这种测序方式虽然准确性较高，但是并未摆脱对光学系统的依赖；同时由于边合成边测序的基本技术原理，仪器的体积比较大，搬运和携带仍然比较困难。1.2 纳米孔测序技术 2012 年，ONT 公布了首个高通量测序平台MinION。该测序平台先将测序接头与马达蛋白连接于双链DNA分子上，当双链DNA分子进入嵌在合成生物膜上的纳米孔后，马达蛋白即解开DNA双链，带负电荷的DNA在电场力与马达蛋白作用下以可控的速率通过纳米孔。DNA分子在纳米孔中穿过时会造成电流的扰动，通过记录电流序列变化，根据电子信号产生的差异识别不同的碱基，从而实现实时分析DNA链中的序列；该技术建库起始量低至 2 g4（图 1B）。MinION 和 PromethION 是 ONT 最常用的 2 种纳米孔测序仪，MinION 是一种纳米孔型便携式测序仪，最初商业化设备的读取长度约为 10 kb，单个流通池（flowcell）的吐量约为 5 Gb5。PromethION 增加了每个流通池的孔数，并支持运行多个流通池，最多可同时运行 48 个流通池，测序数据量可超过 100 Gb6。基于纳米孔测序原理的测序仪具有设备体积小巧、便携性好、适用于条件受限的特殊场景等特点。近年来，国产纳米孔测序仪也逐步走向市场。齐碳科技有限公司推出了国内首个具有完全自主知识产权的纳米孔测序仪 QNome-3841，该产品实现了生物芯片、集成电路等核心组件 100%国产化。今是科技有限公司推出了国内首款中通量纳米孔测序仪 Gseq500，单芯片测序单元数量达到 50 万个。此外，普译生物科技有限公司正在进行具有自主知识产权的纳米孔蛋白优化以及中高通量纳米孔基因测序仪的产品开发。387 第4期 杨谨衔，等 长读长测序技术在肿瘤领域中的应用：进展与挑战1.3 新型单分子 LRS 技术 上述 2 种测序技术是目前较为成熟的LRS技术，随着研究人员对测序原理的改进，新的能够分析经过修饰的核酸分子的单分子LRS 技术应运而生。单管长片段测序（single-tube long fragment read sequencing，stLFR-seq）是由华大智造科技股份有限公司自主研发的基于 DNBSEQ 测序平台的一种长片段读取技术。stLFR-seq 利用 Tn5 转座酶将带有分子标签的杂交序列插入 DNA 中，以对每个长 DNA分子进行编码，实现读取长度达 10 000300 000 bp 的序列；该技术建库起始量低至 1 ng7（图 2A）。转座酶关联长读长测序（transposase enzyme-linked long-read sequencing，TELL-seq）是一种使用 NGS 技术获取远程区域信息的方法8，该方法 使用转座酶来片段化 DNA 并添加条形码，帮助 NGS 技术重新组装 DNA 片段，让短读长数据产生超 LRS 效果，等价读长可达 20 000200 000 bp（图 2B）。与 PacBio 和 ONT 测序方法相比，TELL-seq 的碱基准确度更高，所需的 DNA 样本量更少，人类基因组 DNA 仅需 5 ng。但 TELL-seq 需要根据目标基因组进行复杂的生物信息学分析，以对获得的碎片信息进行精确注释。通过 NGS 平台使用测序技术对转座酶可及性染色质进行单细胞测定的技术，即 scATAC-seq（single-cell assay for transposase-accessible chromatin using sequencing），是一种成熟的对单个细胞内开放染色质区域进行检测的方法。然而，由于基于 NGS 技术，scATAC-seq 对检测基因组结构变异存在困难。北京大学汤富酬团队开发了一种基于 LRS 技术的转座酶可及性染色质单细胞测定方法，即scNanoATAC-seq（single-cell assay for transposase-accessible chromatin on nanopore sequencing platform）9，该方法可以实现同时检测单个细胞内的可及性染色质和结构变异（图 2C）。图 1 PacBio SMRT 测序技术与 ONT 纳米孔测序技术工作原理Fig 1 Schematics of PacBio SMRT and ONT nanopore sequencing procedureA:A schematic diagram of PacBio SMRT sequencing.A SMRTbell template consists of a double-stranded region flanked by 2 hairpin loops.The DNA template is replicated by polymerase chain reaction(PCR),then sequenced by PacBio SMRT.Bases can be identified by different fluorescence colors and intensities.B:A schematic diagram of ONT nanopore sequencing.A single-stranded DNA molecule is ligated with adapters and motor proteins so it can pass through the nanopore.Changes in electrical current or tunneling currents are used to read off the chain of bases.PacBio:Pacific Biosciences;SMRT:Single molecule real-time;ONT:Oxford Nanopore Technologies;SMRTbell:Single molecule real-time bell;dNTP:Deoxyribonucleoside triphosphate;a.u.:Absorbance unit.海军军医大学学报 2023 年 4 月，第 44 卷 388 图 2 新型单分子 LRS 技术的工作原理Fig 2 Workflow of novel single-molecule LRS technologiesA:Workflow of stLFR-seq.The Tn5 transposase inserts a hybridized sequence with a molecular tag into the DNA to encode each long DNA molecule.Then PCR products are collected and quantified,followed by MGISEQ-2000 DNB-based library preparation and sequencing.B:Workflow of TELL-seq.TELL beads and barcodes are used to fragment DNA,and then Illumina sequencing is performed after PCR amplification and library construction.C:Workflow of scNanoATAC-seq.Unfragmented DNA is tagged by Tn5 transposase.Single nuclei are sorted into lysis buffer containing inner barcode.After performing PCR with outer barcode primers,long reads are sequenced by ONT PromethION 48.LRS:Long-read sequencing;stLFR-seq:Single-tube long fragment read sequencing;TELL-seq:Transposase enzyme-linked long-read sequencing;scNanoATAC-seq:Single-cell assay for transposase-accessible chromatin on nanopore sequencing platform;PCR:Polymerase chain reaction;DNB:DNA nanoball;ONT:Oxford Nanopore Technologies.由于测序方式和 DNA 样品制备的差异，每种LRS 技术均可以产生不同类型的长读长数据，它们的长度和准确性都有差异。表 1 总结了长读长数据集的特征，并就每种测序数据类型的相对长度和精度等与 Illumina NGS 数据进行了比较10-13。2 LRS 技术在肿瘤研究中的应用2.1 基因组变异检测2.1.1 结构变异检测 结构变异是肿瘤基因组不稳定性的重要标志，包括易位、大片段缺失、扩增和倒位。结构变异通常是通过驱动易位和扩增使癌基因激活，驱动缺失和倒位使抑癌基因失活。因此高灵敏检测肿瘤特异性突变，包括小的变异（如单碱基替换）及大的变异（如结构变异），对于指导肿瘤患者早期检测、复发监测和靶向治疗等至关 重要。（1）基于 LRS 检测癌细胞基因组的结构变异：NGS 的诞生为研究基因组微小变异提供了便 389 利工具，但对于较大结构变异，NGS 技术的短片段（300 bp）检测仍有很大的局限性。重复区域（包括着丝粒、端粒和其他重复元件）包含人类基因组一半以上的序列（56%），单端测序在不同位置重复出现的序列片段中识别出相同的信息会导致该序列比对时产生歧义14，而 LRS（测序长度达 20 000 bp）可以跨越这些重复区域进行片段 识别。表 1 长读长与短读长测序技术的比较10-13Tab 1 Comparison of long-and short-read sequencing technologiesSequencing technologyCost per lane of a cell/USDCost per million reads/USDRuntime/hMaximum throughput read/kilo-readAverage read/bpMaximum read/bpRead accuracy/%Error profilePacBio Sequel (maximum 8 cells)1 0252 05010-2050020 00050 000 83-91/99.9(CCS)HomopolymersPacBio Sequel (maximum 16 cells)2 05041010-304 00030 000130 000 83-91/99.9(CCS)HomopolymersONT Flongle824000.1-1220030 00060 00096-99HomopolymersONT MinION6156150.1-481 00050 00023 000 00096-99HomopolymersONT GridION(maximum 5 FCs)615615481 00050 00023 000 00096-99HomopolymersONT PromethION(maximum 48 FCs)1 435256726 00030 000330 00096-99HomopolymersIllumina NovaSeq S4(2150 bp PE,maximum 4 lanes)5 1262.6442 000 00025029099.9Low-quality endsIllumina MiSeq(2300 bp PE,maximum 2 lanes)2 0501035620 00055059099.9Low-quality endsPacBio:Pacific Biosciences;ONT:Oxford Nanopore Technologies;FC:Flow cell;PE:Paired-end;USD:United States dollar;CCS:Circular consensus sequencing.针对结构变异的 LRS 策略通常分为 3 种：全面覆盖测序、混合覆盖测序和混合测序15。全面覆盖测序方法指所有样本都以中到高覆盖率进行测序；混合覆盖测序方法指一部分样本以中到高覆盖率进行测序，其余样本使用低覆盖率进行测序；混合测序方法指一部分样本以中到高覆盖率进行测序，其余样本进行短读长测序。不同策略对群体中常见或罕见变异的检测能力会产生影响，具体见表 2。表 2 不同 LRS 策略对结构变异检测能力的影响Tab 2 Impact of different LRS strategies on ability to detect structure variationSequencing strategySequencing depthAdvantage and disadvantageWhole coverageAll samples were tested for LRS(coverage40)(de novo assembly to detect structure variation)Comprehensive detection of structure variation and identification of rare variantsMixed-coverageKey samples were tested for LRS at high-coverage(30)and the remaining samples at low-coverage(5)High sensitivity and cost-effectiveHybrid10%-20%of all samples were tested for LRS(coverage30)and the remaining samples for short-read sequencing(coverage20)Allele frequencies of identifying structure variation but omission of rare variantsLRS:Long-read sequencing.Hu 等16和 Aganezov 等17利用 ONT 和PacBio 平台对乳腺癌样本进行了全基因组测序。研究结果表明，即使在相对较低的覆盖率（25 30 倍）下，LRS 不仅可以检测到单核苷酸变异区域，也可以实现更准确且灵敏的结构变异检测，并且不同 LRS 方式产出结果的一致率达 90%95%。利用 LRS 技术检测结构变异在临床应用中也有巨大潜力。研究人员利用 MinION 技术评估了胰腺导管腺癌细胞系的结构变异类型，包括单纯的缺失、易位、倒位及易位和倒位的组合，也对1100 稀释度的 PCR 扩增产物进行检测，结果提示 MinION 技术对检测患者的特异性结构变异具有可行性，且每个样本的测序深度仅需要 500 读长即可快速得到检测结果18。（2）基于 LRS 的基因组结构变异快速鉴定可用于癌症监测：循环肿瘤 DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）来源于肿瘤细胞，已被证明与肿瘤负荷呈线性正相关，且在癌症复发出现临床症状前几个月即可被检出19。液体活检可用于检测第4期 杨谨衔，等 长读长测序技术在肿瘤领域中的应用：进展与挑战海军军医大学学报 2023 年 4 月，第 44 卷 390 体液（如血液）中的肿瘤成分，是一种对患者损伤小、可接受度高的肿瘤负荷动态监测方式20。在液体活检中检测 ctDNA 中的代表性结构变异，可用于高灵敏度检测和量化 ctDNA21，因此，准确、及时地检测血液中包括结构变异在内的肿瘤相关改变对于患者从早期预警到监测复发均具有重要作用。鉴于测序速度快、体积小和成本低等优点，LRS 可能成为早诊、复发或疗效监测过程中癌症相关结构变异检测的理想方式。为了能够快速和高效地识别一组特异性体细胞结构变异，用于 ctDNA 监测，Valle-Inclan 等22利用纳米孔测序的长读长和快速测序能力开发出一种能够准确选择纳米孔测序数据体细胞结构变异模型的算法，该算法仅用 3 d 时间即可检出卵巢癌和前列腺癌患者体细胞结构变异，同时，应用该算法的 DNA 样本需求量可以进一步减少到 80 ng。2.1.2 拷贝数变化（copy number alteration，CNA）检测 CNA 是人类基因组变异的一种常见形式，已被证实与许多病理变化相关，包括罕见的基因组疾病23、神经系统疾病24和癌症25。在癌症中，体细胞 CNA 促进了基因组的变异，具有诊断、预后和治疗意义26。CNA 信息可通过染色体分析、核型分析及荧光原位杂交27等方法检测，然而，这些方法均存在灵敏度或准确度不高等局限性。NGS能够从短读长测序数据中显示出高准确度 CNA 信息来提高灵敏度和准确度28，但此类方法成本较高，应用场所局限于大型、资源丰富的临床中心。Martignano 等29利用低覆盖率纳米孔测序检测来自癌症患者的血浆核酸分子的 CNA，仅用 200 万读数就完成了对 6 例肺癌患者和 4 名健康受试者的全基因组分子核型检测，并发现了常见的与肺癌相关的 CNA。这是纳米孔测序成功应用于血浆 DNA 拷贝数分析的案例，展现出 LRS 对患者高效、无创检测的潜力。2.1.3 基因融合检测 基因融合是由于染色体倒位、串联重复、区段缺失或易位事件造成不同的、独立的基因或基因片段发生合并的过程，在癌症中较为常见。例如，慢性髓细胞性白血病中可 检 出 BCR-ABL（BCR activator of RhoGEF and GTPase-ABL tyrosine kinase）融合，导致费城染色体（Philadelphia chromosome，Ph）形成30；肺腺癌患者的肿瘤组织中EML4-ALK（EMAP-like 4-ALK receptor tyrosine kinase）融合基因编码的融合蛋白具有致癌作用31-32。因此检测融合基因并阐明其形成的机制和演化过程对于肿瘤研究具有重要价值。免疫组织化学和荧光原位杂交是临床检测融合基因的 2 种主要方法33。这 2 种方法用于分析单个基因，且对于组织样本有一定的要求，在临床实践中可行性低且耗时。因此，LRS技术作为能够以最少的样本量测试多个基因的新技术，可助力融合基因的快速发现。Jeck 等34利用 ONT MinION 测序系统，通过修改锚定多重 PCR 方法进行文库构建，在测序 15 min内获得100 读长，可实现 BCR-ABL 融合转录本的检测。在 Romagnoli 等35的研究中，LRS 技术能在 60 h 内鉴定出嗜酸性粒细胞增多症患者循环血 DNA 样本中的血小板源性生长因子受体/、成纤维细胞生长因子受体 1 和 Janus 激酶 2基因重排，该结果与诊断时独立进行的荧光原位杂交分析结果完全一致。同时，测序结果为识别这几例患者基因融合位点提供了理论依据，这是传统方法无法提供的信息。2.2 全长 RNA 转录本检测及转录本异构体和lncRNA 识别 一些转录亚型的异常表达可能会激活癌基因或使抑癌基因失活，从而导致癌症发 生36。在 RNA 水平上研究癌细胞的分子特征很大程度上依赖于参考转录组的精确度和完整性。然而，由于传统Illumina短读长（150 bp）的限制，通常无法捕捉到转录本中的所有外显子，导致一些新的转录亚型无法识别37。Fang等38对 3 例肝细胞癌患者的肿瘤组织、门静脉癌栓和癌旁组织进行了纳米孔转录组 RNA 测序。研究结果发现，短读长测序的转录本组装可能会出现许多错误，而 LRS在识别结构复杂的长片段新转录本方面具有明显的优势。此外，其他研究者也使用 LRS 成功地发现了细胞中大量新的转录本39-41。以上研究结果表明，LRS 是准确组装转录本的有效工具，并且相较于 NGS 技术能够识别更多未知的转录本。lncRNA 参与基因组修饰、转录激活、转录干扰、核内运输等过程42，其在肿瘤发生与发展过程中的调控作用已被大量研究证实。lncRNA 会因细胞类型、组织类型和物种类型的不同产生多种同工型。短读长测序可揭示 lncRNA 表达差异，但表达差异不足以代表其作用方式，因此 LRS 技术为 391 探索 lncRNA 不同加工方式及生物学功能提供了有力工具43。为了加速 lncRNA 注释，GENCODE联盟开发了 RNA 捕获长测序（RNA capture long-read sequencing，CLS），它将靶向 RNA 捕获与 LRS相结合，所生成的全长转录本模型能够明确描述lncRNA 的基因组特征，包括启动子和基因结构及蛋白质编码潜能44。2.3 表观遗传修饰识别 表观遗传学在驱动癌症及其异质性方面具有重要作用，基因表达的表观遗传调控主要依赖于DNA甲基化和组蛋白修饰45。迄今为止，研究 DNA 甲基化通常先利用亚硫酸氢盐处理，将胞嘧啶转化为尿嘧啶进而将表观遗传信息转化为遗传信息，再进行大规模平行 DNA 测序。然而，基于亚硫酸氢盐处理的测序无法区分胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基胞嘧啶，这增加了文库制备的复杂性及来自不完全化学转化等偏差的可能性46。此外，常用的 NGS 技术存在读取长度短的限制，使得一些区域难以定位，无法进行等位基因特异性甲基化的研究。Rand 等47和Simpson等48首次使用纳米孔测序实现了全基因组DNA甲基化分析。Ewing 等49利用 ONT 测序技术实现了转座元件表观基因组的全面分析，同时评估转座元件的甲基化水平和检测体细胞转座因子的动员情况。此后，研究者们开发及改进了基于LRS技术对表观遗传景观进行建模和分析的工具50-51，将现有DNA甲基化检测技术向前推进了一步。3 小结与展望LRS 技术助力人类癌细胞基因组及全转录组图谱绘制，使肿瘤患者游离 DNA 检测、大片段结构变异和甲基化等快速检测成为可能，为临床快速筛选、疾病诊断及预后判断提供了有力依据。LRS 技术处于起步阶段，仍然存在一些尚待解决的问题，首要挑战是对最低样本量的需求。相对 NGS，LRS 技术对检测 DNA 或 RNA 的质量和数量要求更低，但仍需要微克级 DNA 来制备用于全基因组测序的文库，特别是临床血液及体液样本提取的 DNA 量通常很有限，因此，LRS 应用于临床还需要进一步减少对样本量的需求。另一个挑战则是 ONT 和 PacBio 测序存在较高的原始错误率及长扩增子嵌合体形成率，有待于通过升级优化检测平台和下游分析流程规避可能的错误。例如，ONT 发布的 PromethION 流通池 10.3 版本的测序准确度远高于之前的版本，在单读时测序准确度可达到 99%，有助于改善当前长读测序碱基准确度低的不足，进一步帮助改进下游分析。此外，针对LRS 数据的下游分析，如重复序列比对、基因组结构变异检测和甲基化分析等依赖人工智能算法、软件和数据库等生物信息学工具。目前已有的针对NGS 数据开发的算法无法解决 LRS 数据高原始错误率的问题，因此开发更适合处理长序列片段数据的算法有助于 LRS 技术准确度的提升。LRS 技术在肿瘤研究中的应用思路和探索领域正在不断扩展，特别是针对一些具有高突变率的肿瘤，如血液肿瘤中的各类白血病及多发性骨髓瘤、恶性淋巴瘤等，LRS 技术可通过以下应用方向发挥重要作用：（1）检测肿瘤早期的基因突变，对癌症进行早期预警；（2）根据分子标志物对疾病进行鉴别诊断及分子分型；（3）根据患者的基因变异选择合适的靶向药，做到精准治疗；（4）利用基因变异导致患者对化疗药物耐受性的不同进行化疗相关不良反应预测；（5）利用 LRS 技术检测微小残留灶进行疗效判断及复发监测，进一步提高分子诊断在肿瘤早期诊断、精准治疗、判断疗效、复发预测等全程管理中的重要应用价值。LRS 技术尽管仍然存在诸多亟待解决的问题，其仍是测序技术更新换代的重要里程碑。相信随着技术的革新，未来 LRS 技术将加速肿瘤基因组学及表观遗传组学研究，窥探既往难以发现的分子生物学信息，为新的肿瘤生物标志物识别及诊疗方式开发提供新的思路。参 考 文 献1 SENOL CALI D,KIM J S,GHOSE S,ALKAN C,MUTLU O.Nanopore sequencing technology and tools for genome assembly:computational analysis of the current state,bottlenecks and future directions J.Brief Bioinform,2019,20:1542-1559.2 KORLACH J,BJORNSON K P,CHAUDHURI B P,CICERO R L,FLUSBERG B A,GRAY J J,et al.Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules J .Methods Enzymol,2010,472:431-455.3 WENGER A M,PELUSO P,ROWELL W J,CHANG P C,HALL R 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