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细菌的分离与培养
实验目的：
掌握在各种培养基上的接种方法并观察生长现象。
实验材料：
菌种、普通琼脂平板、肉汤培养基、半固体培养基、斜面培养基、接种环、接种针、酒精灯。
实验内容：
一、平板划线接种法（分离培养法）
原理：通过在平板上划线，将混杂的细菌在琼脂平板表面充分的分散开，使单个细菌能固定在一点上生长繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯种的目的。若需从平板上获取纯种，则挑取一个单个菌落作纯培养。
用途： 分离出纯种细菌，以利作纯培养。
课时安排：2课时
操作方法（三区划线法）：
1、右手拿接种环，烧灼冷却后，取菌液一环。
2、左手抓握琼脂平板（让皿盖留于桌上），在酒精灯火焰左前上方，使平板面向火焰，以免空中杂菌落入，右手将已沾菌的接种环在琼脂表面密集而不重叠的来回划线，面积约占整个平板的1/5-1/6，此为第一区。划线时接种环与琼脂呈30-40度角轻轻接触，利用腕力滑动，切忌划破琼脂。
3、接种环上多余的细菌可烧灼（每划完一个区域是否需要烧灼灭菌视标本中含菌量多少而定），待冷后，在划线末端重复2-3根线后，再划下一区域（约占1/4面积），此为第二区。
4、第二区划完后可不烧灼接种环，用同样方法划第三区，划满整个平皿。
5、划线完毕，将平板扣入皿盖并作好标记，置37℃温箱孵育18-24小时观察琼脂表面菌落分布情况，注意是否分离出单个菌落，并记录菌落特征（如大小、形状、透明度、色素等）。

二、液体培养基接种法
用途：凡肉汤、蛋白胨水，各种单糖发酵均用此法接种。可以观察细菌不同的生长性状、生化特性以供鉴别之用。
操作方法：
右手执笔式握住接种环，灭菌冷却后取单个菌落。
1、 左手拇指、食指、中指托住液体培养基之下端，右手小指和无名指（或手掌）拔取试管塞，将管口移至火焰上旋转烧灼。
2、 将沾菌的接种环移入培养基管中，在液体偏少侧接近液面的管壁上轻轻研磨，沾取少许液体与之调和，使菌液混合于培养基中（图5）。
3、 管口通过火焰，塞好试管塞，将接种环灭菌后放下，经37℃温箱孵育18-24小时，取出观察生长情况。
三、半固体穿刺接种法
用途：观察细菌动力，保存菌种。方法：
1、以无菌操作用接种针挑取单个菌落，立即垂直插入培养基中心至接近管底处循原路退回。
2、管口通过火焰，塞上棉塞，接种针灭菌后放下。试管置37℃温箱孵育18-24小时，取出后对光观察穿刺线上细菌生长情况：细菌有无向周围扩散生长，穿刺线是否清晰等。
图5 液体（左）及半固体（右）培养基接种法
四、斜面培养基接种法
用途：常用于扩大纯种细菌及实验室保存菌种。
操作方法：
1、 以无菌操作法用接种环挑取单个菌落，自斜面底向上划一直线，然后再从底向上轻轻来回作蜿蜒划线。
2、 管口通过火焰，塞上棉塞，接种环烧灼后方可放下。置37℃温箱孵育18-24小时，取出观察斜面上菌苔生长情况。
细菌分离培养及移植

在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。
[目的要求]
(1)掌握细菌分离培养的基本要领和方法。
(2)掌握厌氧菌培养的原理及其方法。
[实验材料]
菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。
器械：剪刀、记号笔(以上小组共用)。
培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环(以上每人一套)。
[需氧性细菌分离培养法]
1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。划线培养时须注意以下几点：
(1)左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20。左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。
(2)右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-l)。
(3)划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基。
(4)划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。
(5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37℃培养。
2．纯培养的获得与移植法将划线分离培养37℃24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。具体操作方法如下：

(1)两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出(图5—2)。右手持接种棒，在火焰上灭菌后，用右手小指和无名指并齐同时拔出两管棉塞，将管口进行火焰灭菌，使其靠近火焰(图5—3)。将接种环伸入菌种管内，先在无菌生长的琼脂上接触使之冷却，再挑取少许细菌后拉出接种环立即伸入另一管斜面培养基上，勿碰及斜面和管壁，直达斜面底部。从斜面底部开始划曲线，向上至斜面顶端为止，管口通过火焰灭菌，将棉塞塞好(图5—4)。接种完毕，接种环通过火焰灭菌后放下接种棒。最后在斜面管壁上注明菌名、日期和接种者，置37℃温箱中培养。
(2)从平板培养基上选取可疑菌落移植到琼脂斜面上作纯培养时，则用右手执接种棒，将接种环火焰灭菌，左手打开平皿盖，挑取可疑菌落，左手盖上平皿盖后立即取斜面管，按上述方法进行接种、培养。
3．肉汤增菌培养为了提高由病料中分离培养细菌的机会，在用平板培养基做分离培养的同时，多用普通肉汤做增菌培养，病料中即使细菌很少，这样做也多能检查出。另外用肉汤培养细菌，以观察其在液体培养基上的生长表现，也是鉴别细菌的依据之一。其操作方法与斜面纯培养相同：无菌取病料少许接种增菌培养基或普通肉汤管内于37℃下培养。
4．穿刺培养半固体移植用穿刺法接种。方法基本上与纯培养接种相同，不同的是用接种针挑取菌落，垂直刺人培养基内。要从培养基表面的中部一直刺入管底，然后按原方向退出即可。
5. 倾注培养法取3支融化后冷却至45℃左右的琼脂管，用接种环取一环培养物移至第一管内，摇匀。从第一管取一接种环至第2管，振荡。再由第2管取一接种环至第3管，混匀。将3管含有培养物的琼脂分别倒入3个灭菌培养皿内做成平板，凝固后倒放于37℃恒温箱内培养，24h后观察结果。第一管的平板菌数甚多，而第2、第3管之平板则渐渐减少，此法现在应用较少。
6．芽孢需氧菌分离培养法若怀疑材料中有带芽孢的细菌，先将检查材料接种于一个含有液体培养基的试管中，然后将它置于水浴箱，加热到80℃，维持15～20min，再行培养。材料中若有带芽孢的细菌，其仍能存活并发育生长，不耐热的细菌繁殖体则被杀灭。
7．利用化学药品的分离培养法抑菌作用：有些药品对某些细菌有极强的抑制作用，而对另一些细菌则无效，故可利用此种特性来进行细菌的分离，例如通常在培养基中加入结晶紫或青霉素抑制革兰氏阳性菌的生长，以分离革兰氏阴性菌。
杀菌作用：将病料如结核病病料加入15％硫酸溶液中处理，其他杂菌皆被杀死，结核菌因具有抗酸活性而存活。
鉴别作用：根据细菌对某种糖具有分解能力，通过培养基中指示剂的变化来鉴别某种细菌。例如SS琼脂培养基可以用做鉴别大肠杆菌与沙门氏杆菌。
8．通过实验动物分离法当分离某种病原菌时，可将被检材料注射于敏感性高的实动物体内，如将结核菌材料注射于豚鼠体内，杂菌不发育，而豚鼠最终患慢性结核病而死。实验动物死后，取心血或脏器用以分离细菌。有时甚至可得到纯培养。
[厌氧性细菌的分离培养法]
厌氧菌需有较低的氧化一还原势能才能生长(例如破伤风梭状芽孢杆菌需氧化一还原电势降低至0.1lV时才开始生长)，在有氧的环境下，培养基的氧化一还原电势较高，不适于厌氧菌的生长。为使培养基降低电势，降低培养环境的氧压是十分必要的。现有的厌氧培养法甚多，主要有生物学、化学和物理学3种方法，可根据各实验室的具体情况而选用。
1．生物学方法培养基中含有植物组织(如马铃薯、燕麦、发芽谷物等)或动物组织(新鲜无菌的小片组织或加热杀菌的肌肉、心、脑等)，由于组织的呼吸作用或组织中的可氧化物质氧化而消耗氧气(如肌肉或脑组织中不饱和脂肪酸的氧化能消耗氧气，碎肉培养基的应用，就是根据这个原理)，组织中所含的还原性化合物如谷胱甘肽也可以使氧化一还原电势下降。
另外，将厌氧菌与需氧菌共同培养在一个平皿内，利用需氧菌的生长将氧消耗后，使厌氧菌能生长。其方法是将培养皿的一半接种吸收氧气能力强的需氧菌(如枯草杆菌)，另一半接种厌氧菌，接种后将平皿倒扣在一块玻璃板上，并用石蜡密封，置37℃恒温箱中培养2～3d后，即可观察到需氧菌和厌氧菌均先后生长。
2．化学方法利用还原作用强的化学物质，将环境或培养基内的氧气吸收，或用还原氧化型物质，降低氧化一还原电势。
李伏夫(B.M.JIbbob)法此法系用连二亚硫酸纳(Sod~Lkrn hydrosulphite)和碳酸钠以吸收空气中的氧气，其反应式如下：
Na2S2O4 + Na2C03 + O2—→Na2SO4 + Na2SO3 + C02

取一有盖的玻璃罐，罐底垫一薄层棉花，将接种好的平皿重叠正放于罐内(如系液体培养基，则直立于罐内)，最上端保留可容纳1～2个平皿的空间(视玻罐的体积而定)，按玻罐的体积每1 000cm3空间用连二亚硫酸钠及碳酸钠各30g，在纸上混匀后，盛于上面的空平皿中，加水少许使混合物潮湿，但不可过湿，以免罐内水分过多。若用无盖玻罐，则可将平皿重叠正放在浅底容器上，以无盖玻罐罩于皿上，罐口周围用胶泥或水银封闭(如图5-5)。
焦性没食子酸法焦性没食子酸在碱性溶液中能吸收大量氧气，同时由淡棕变为深棕色的焦性没食橙(Purpurgallin)。
每100cm3空间用焦性没食子酸1g及10％氢氧化纳或氢氧化钾10ml，其具体方法主要有下列几种：
(1)单个培养皿法：将厌氧菌接种于血琼脂平板。取方形玻璃板一块，中央置纱布或棉花或重叠滤纸一片，在其上放焦性没食子酸0．2g及10％NaOH溶液0.5mL。迅速拿去皿盖，将培养皿倒置于其上，周围以融化石蜡或胶泥密封。将此玻璃板连同培养皿放入37℃温箱培养24～48h后，取出观察。
(2)Buchner氏试管法(图5—6)：取一大试管，在管底放焦性没食子酸0．5g及玻璃珠数个或放一螺旋状铅丝。将已接种的培养管放人大试管中，迅速加入20％NaOH溶液0.5ml，立即将管口用橡皮塞塞紧，必要时周围封以石蜡。37℃培养24～48h后观察。
(3)玻罐或干燥器法：置适量焦性没食子酸于一干燥器或玻罐的隔板下面，将培养皿或试管置于隔板上，并在玻罐内置美蓝指示剂一管，从罐侧加入氢氧化钠溶液放于罐底，将焦性没食子酸用纸或纱布包好，用线系住，暂勿与氢氧化钠接触，待一切准备好后，将线放下，使焦性没食子酸落入氢氧化纳溶液中，立即将盖盖好，封紧，置温箱中培养。
(4)瑞(wright)氏法：将已接种细菌的培养管的脱脂棉塞在火焰中烧灼灭菌后，塞入管中离培养基1～1.5cm处，置适量焦性没食子酸于其上，加入10％NaOH溶液2ml，迅速用橡皮塞将管口塞紧，以胶泥或石蜡严密封闭置温箱中培养(图5—7)。

(5)史(Spray)氏法：用图5—8所示的厌氧培养皿，在皿底一边置焦性没食子酸，另一边置氢氧化钠溶液，将已接种的平皿翻盖于皿上，并将接合处用胶泥或石蜡密封完全，然后摇动底部，使氢氧化钠溶液与焦性没食子酸混合，置温箱中培养。
(6)平皿法：置一片中有小圆孔的金属板于两平皿之间，上面的平皿接种细菌，下面的平皿盛焦性没食子酸及氢氧化钠溶液，用胶泥封固后，置温箱中培养(图5—9)。

硫乙醇酸钠法硫乙醇酸钠(HSCH2C0ONa)是一种还原剂，加入培养基中，能除去其中的氧或还原氧化型物质，促使厌氧菌生长。其他可用的还原剂包括葡萄糖、维生素C、半胱氨酸等。
(1)液体培养基法：将细菌接种入含0.1％的硫乙醇酸钠液体培养基中，37℃培养24～48h后观察，本培养基中加美蓝液作为氧化还原的指示剂，在无氧条件下，美蓝被还原成无色。
(2)固体培养基法：常采用特殊构造的Brewer氏培养皿，可使厌氧菌在培养基表面生长而形成孤立的菌落。操作过程是先将Brewer-氏皿干热灭菌，将熔化且冷却至50℃左右的硫乙醇酸钠固体培养基倾入皿内。待琼脂冷凝后，将厌氧菌接种于培养基的中央部分。盖上皿盖，使皿盖内缘与培养基外围部分相互紧密接触(图5—10)。此时皿盖与培养基中央部分留在空隙间的少量氧气可被培养基中的硫乙醇酸钠还原，故美蓝应逐渐褪色，而外缘部分，因与大气相通，故仍呈蓝色。将Brewer氏培养皿置于37℃恒温箱内，经过24～48h后观察。
3．物理学方法利用加热、密封、抽气等物理学方法，以驱除或隔绝环境及培养基中的氧气，使其形成厌氧状态，有利于厌氧菌的生长发育。
厌氧罐法常用的厌氧罐有Brewer-氏罐、Broen氏罐和Mclntosh-Fildes二氏罐(图5-11)。将接种好的厌氧菌培养皿依次放于厌氧罐中，先抽去部分空气，代以氢气至大气压。通电，使罐中残存的氧与氢经铂或钯的催化而化合成水，使罐内氧气全部消失。将整个厌氧罐放入孵育箱培养。本法适用大量的厌氧菌培养。
真空干燥器法将欲培养的平皿或试管放入真空干燥器中，开动抽气机，抽至高度真空后，替代以氢、氮或二氧化碳气体。将整个干燥器放进孵育箱培养。
高层琼脂法加热融化高层琼脂，冷至45℃左右接种厌氧菌，迅速混合均匀。冷凝后37℃培养，厌氧菌在近管底处生长。
加热密封法将液体培养基放在阿诺氏蒸锅内加热10min，驱除溶解于液体中的空气，取出，迅速置于冷水中冷却。接种厌氧菌后，在培养基液面覆盖一层约0.5cm的无菌凡士林石蜡，置37℃培养。
此外，尚有摇振培养法，此处从略。
[二氧化碳培养法]
少数细菌如布氏杆菌(牛型)等，孵育时，需大气中添加5％～10％二氧化碳，方能使之生长繁殖旺盛。常用的方法是置于C02培养箱中进行培养；最简单的二氧化碳培养法是在盛放培养物的有盖玻璃缸内，燃点蜡烛，当火焰熄灭时，该缸的大气中，就约增加了5％～10％的二氧化碳。也可用化学物质作用后生成二氧化碳，如碳酸氢钠与硫酸钠或碳酸氢钠与硫酸作用即可生成二氧化碳。若各用0.4％NaHCO2与30％H2S04 1mL，则可产生22.4mL的二氧化碳气体。

[思考题]
1．分离培养的目的是什么?何谓纯培养?
2．在挑取固体培养物上的细菌作平板分区划线时，为什么在每区之间都要将接种环上剩余的细菌烧掉?
3．培养皿培养时为什么要倒置?