人67kD层粘连蛋白受体在毕赤酵母中的表达及活性分析.pdf

卷#期!$%年%月生物工程学报!#$%&%()*$+,(-.#(/%0$(,(12&()!*)#!+,(-!$%./0/12/3：4/0/56/7 8，!$9；:00/;70?8!，!$%)?1A B7C BA A,;7 D7E F75(*(G01/E0/A H,E3（*)$#$JJK）)I77/A;E31ED,1(：?/F/EDE99PED!，U:*Q1NT18E3 VO H/EDN1E88 第三军医大学生物化学与分子生物学教研室，重庆#$M!重庆师范大学特殊教育学院，重庆#$#%8 3%4+*/5%$/(-.#(0%5#&/*2+$6 7(,%0),+*.#(,(12，8#*6 7#,#/+*2 7%6#0+,9$#:%*&#/2，!($1;#$1#$M，!#$+!(*5+,9$#:%*&#/2，!($1;#$1#$#%，!#$+摘要为实现人 9%C4 层粘连蛋白受体（V,5E 9%C4 Q51E1E./0/;7，9%Q.）蛋白的分泌表达，采用 4*:重组技术将 9%Q.04*:片段插入分泌型酵母表达载体;WRIKX 中，构建了相应的重组表达质粒;WRIKXN9%Q.并在 UG88J 毕赤酵母菌株中表达，每升培养基经亲和层析可纯化目的蛋白 8!)J95D。纯化的目标蛋白能够与肺癌:J#K 细胞竞争性结合其配体分子 Q*N8，具有相应的生物学活性，从而为深入研究人 9%Q.的结构与功能奠定了基础。关键词9%Q.，毕赤酵母，蛋白质表达中图分类号S%M文献标识码:文章编号 8$N$98（!$%）$#N$9$!N$J077-,?/A/07/E 9%C4(51E1E 7/0/;EA513;WRIKXN9%Q.BA 0EA7,0/3 6-1EA/71ED F 9%Q.04*:1EA/Y;7/AA1E 2/07;WRIKX)?/9%Q.;7A/Y;7/AA/31E?#0#+4+&/(*#&F/7 1E3,0/3 6-5/E(，E3 6,8!)J95D/(/07;?7/A1A;,71-9%Q.0,(3 6/61E/3 F/7 1E F 8Q 0,(FF1E1;?0(,5E)$:#/*(05;/1AA-A?B/3 7D/;7AE/Y0/(/E(0121A;(0/3 A(13 F,E31E F7 70?E A7,0E3F,E0,(/*9%Q.，?#0#+4+&/(*#&，;751E1E 7/0/;51E1E，Q*）的一种高亲和性非整合素受体，8KM 年首次报道该受体的表达与原发性乳腺癌腋下淋巴结转移的数量相关，!$年 V1;F/(等用消减杂交技术对恶性黑色素瘤及良性黑痣组织标本中基因表达的差异进行检测，发现9%Q.基因的表达与肿瘤的进程有关8。到!$J 年为止已有超过 8!$例对来自不同器官、不同类型的肿瘤用免疫组化方法证实了 9%Q.在浸润、转移甚至肿瘤生长中的作用!。因此，弄清 9%Q.与其配体的作用关系并设法抑制其活性对于肿瘤的转移抑制治疗具有重要的理论和实际意义。!#$是表达于细胞膜上的一种受体蛋白，从细胞中直接分离存在成本高、产率低的缺点，而原核表达产物又不具有相应的生物学活性，因此本研究将编码!#$的%&(序列插入酵母表达载体)*+,-.中，转化毕赤酵母菌/0112，获得可分泌表达!#$的菌株。表达菌株受甲醇诱导后，培养基上清经0&03*(/4 电泳可看到分子质量约为!5&的目的蛋白带，而空载体对照没有相应的条带。亲和纯化后!#$能够与肺癌(26-细胞竞争性结合其配体分子#31，具有相应的生物学活性。!#$的表达为探索其结构及与层粘连蛋白结合的分子机制并针对性制备相应的生物学制剂打下了基础。!材料与方法!材料重组克隆载体)7,839:!#$由第四军医大学西京医院消化研究所樊代明院士馈赠；酵母穿梭表达载体（!#$%3&;#(）)*+,-.和!#$%)%*+,*菌株（/0112?AB0）为+CD=BEFGHC 公司产品；#31、层粘连蛋 白 肽 段（IJ8=C=C KEJG8HCB-L-3-MM，N+/0$）为0=G8J 公 司 产 品；0H)OJPHQ/32、,RE 活 化 的0H)OJEFH 6R 为*OJE8J%=J 公司产品；限制性内切酶、96&(连接酶及 9JS&(聚合酶均购自*EF8HGJ 公司；酵母培养基*H)BFCH、NR（TUV）为&=K%F 公司产品；生物素、羊抗驴+G/、(*均为/=W%F 公司产品；!#$多抗驴血清购自 0JCBJ 公司。!#酵母表达质粒的构建采用亚克隆策略，将!#$%&(片段从)7,839:!#$克隆质粒切下并定向克隆到)*+,-.酵母表达质粒，酶切鉴定后进行序列测定。!$酵母菌的转化与鉴定根据+CD=BEFGHC 公司!#$%4Q)EH=FC.=B 制备酵母菌/0112 感受态细胞，将线性化的酵母表达质粒)*+,-.3!#$在 12XXY:L2!Z:LXX条件下电转化。筛选在 平板上生长缓慢而在&平板上生长良好的菌株，玻璃珠法提取酵母总&(，用酵母载体通用引物（23/(,9/99,(99/(,(/,3M和 23/,(9/,(99,9/(,(9,3M）进行*,$反应（反应条件为-6 62，22-X，L 1LX），检测目的基因在酵母基因组中的整合情况。!%&()的表达及鉴定挑取酵母菌单克隆接种于 28#N*&液体培养基中，L MX培养 1!LXO，离心收集菌体并重悬于 1XX8#R/N 扩增培养基中，L MX培养至-!XX_ LX !X，离心收集菌体，用 LXX8#RN 诱导培养基重悬，X2a甲醇浓度下培养 6O，以诱导目的蛋白的表达。离心，取上清，用斑点杂交、0&03*(/4及 THBHEC WIFB 法检测目的蛋白分泌表达情况。简要步骤如下：诱导上清直接点于硝酸纤维素膜（,膜）或经 0&03*(/4 分离后以半干法电转移到,膜上，将,膜短暂漂洗后依次经 2a脱脂奶粉室温封闭 1O、与!#$多抗驴血清孵育 1O、与 H 6R 凝胶，加入 L!G 溶于偶联缓冲液（含X28FIU#J,I 的 X18FIU#J,VM缓冲液，)3,I)6，含 XL8FIU#J,I，X1a 9E=BFC b31XX），6保存备用。!*#表达上清的收集：将含重组质粒)*+,-.3!#$的酵母表达菌在 X2#:1#的 R/N:RN 培养基中扩大培养并按 16 条件进行甲醇诱导。诱导结束后离心收集上清，过 0H)OJPHQ/32 柱进行浓缩、脱盐和粗分离。!*$亲和层析：用亲和柱平衡缓冲液平衡透析浓缩脱盐后收集的表达上清。上样，充分混匀，结合过夜。用 LX 倍柱体积的亲和柱平衡缓冲液洗脱未结合的杂蛋白，换成亲和柱洗脱缓冲液（L288FIU#/Ic3,I)3,I（)9）法M对#31 进行放射性碘标。根据/OFO 的方法6略做修改测定细胞与#31 的结合能力。取处于对数生长期的肺癌(26-细胞，胰蛋白酶消化后 2XX.离心 28=C，用*R0 重悬并稀释成 1X!个细胞U8#，每管加 1XX!#细胞悬液，并分别加入 XX2、X1X、XL2、X2X、1XX、12X、LXX、L2X!G1L2+标记的#31，各管体积以*R0 补齐，相应的非特MX!连继勤等：人!5&层粘连蛋白受体在毕赤酵母中的表达及活性分析异结合管以!#代替细胞悬液进行，各组均作平行管。各管置于$%摇床结合&，在预先用封闭液浸泡的玻璃纤维滤膜上抽滤，用!#洗涤(次，除去未结合的&)*+,-.,&，取滤膜在/01 放射免疫!计数器上读出每管的 234，计算出结合量，做出结合曲线。!#$竞争结合实验：取处于对数生长期的肺癌5*$6 细胞，消化后*11!离心*478，用!#重悬并稀释成&19个细胞:4-，每管加&11-细胞悬液，根据肺癌 5*$6 细胞与-.,&的结合曲线，每管加入&;*&)*+,-.,&（标记方法同上），各管分别加入 1、1;&、1;)*、1;*、&;1、);1、*;1 蛋白，各管体积以!#补齐，以纯化的人可溶性增殖诱导配体?5!+-作为无关受体设置对照组，相应的非特异结合管以!#代替细胞悬液进行，各组均作平行管。各管置于$%摇床结合&，在预先用封闭液浸泡的玻璃纤维滤膜上抽滤，用!#洗涤(次，除去未结合的&)*+,-.,&，取滤膜在/01 放射免疫!计数器上读出每管 234，做出竞争结合曲线，求出抑制率。$结果$!重组质粒%&()*+#,-.的构建及鉴定用限制性内切酶#$#和%$&#将 9=-2.5片段从质粒 3AB4,CD9=-上切下回收，将该片段克隆到表达载体 3!+B6E 上，然后转化大肠杆菌。重组质粒 3!+B6E,9=-经#$#:%$&#双酶切可见大小为 000F3 目的条带（如图测序结果也表明9=-2.5 序列已成功插入 3!+B6E 质粒，且具有正确的阅读框架和编码序列。图&重组质粒 3!+B6E,9=-的酶切鉴定/7&：.5 4LNPIN-)111；)：3!+B6E:#$#Q%$&#；(：3!+B6E,9=-:#$#Q%$&#G$转化子/0123456阳性克隆的鉴定挑取 R7?QSTJ#表型的转化菌株，以其基因组.5 为模板，用酵母*U5VW+和(U5VW+通用引物!B 验证目的.5 与酵母基因组整合状况，部分结果如图)。由于酵母基因组.5 中含有与引物同源的序列，片段大小约为);)PF，而对空载体的扩增大小应为$6)F3，因此阴性对照转化菌的扩增片段应为))PF 和$6)F3 两条带，而阳性转化菌扩增条带大小应为);)PF 和&;$PF（目的基因片段 000F3 加空载体片段$6)F3），从图)中可看到与理论分子量大小相符电泳条带，表明目的基因已在酵母基因组中得到整合。图)酵母转化子!B 鉴定/7 7HI8J7K72LJ7M8 MK XIL?J NI2M4F78L8J?&：3!+B6E JNL8?KMN4L8J；)，(：3!+B6E,9=-JNL8?KMN4L8J?；$：-)111.5 4LNPING$7目的基因的表达检测$7!斑点杂交分析：对 5、B、四株转化菌在诱导后不同时间取样进行斑点杂交分析，结果见图(。图(斑点杂交分析结果/7 3NMJI785，B，：5 2OM8I，2OM8I，B 2OM8I L8H 2OM8I；&，)，(：$0，91 L8H=)LKJIN YL?78HT2IH NI?3I2J7ZIOXG从图(可看出，&（克隆诱导后$0）位点显色最明显，说明该菌株在诱导后$0 分泌在上清中的9=-蛋白浓度最大。$7$#,!5 电泳及 I?JIN8 FOMJ 分析：挑取上述阳性克隆，并以 3!+B6E 重组酵母菌作对照进行诱导表达。甲醇诱导$0 后取上清进行#,!5 电泳和 I?JIN8 印迹分析。考马斯亮蓝染色表明3!+B6E,9=-菌株分别在 9=P 和(=P 处出现了两条特异的蛋白带（图$），3!+B6E 载体对照菌则没有相应条带。进一步用 I?JIN8 FOMJ 鉴定表明，杂交后可看到特异性蛋白带而对照菌则无此反应（图*），说明此两条蛋白带为重组菌株特异表达的蛋白带，分别对应于 9=-及其前体(=-!。$8#,-.蛋白的纯化及活性分析收集表达上清，过#I3LHI,=*凝胶柱后收集$19()*+,+-$./*01$2 3)$&+#(*$1$!4生物工程学报)11=，_MO;)(，.M;$图!#$%&()*+,-./01 表达上清#2#-(34 分析5678!#2#-(34 9:;?./01:=9 ABCDB=EC B;=FEDEFD9:#$%&()*+G-./01$：#$%&()*+G；H：#$%&()G-./01；I：=9D;6F E=J;=8图%#$%&()*+G-./01 表达上清 K;D;=F LC9D 分析5678%K;D;=F LC9D EFECM6 9:ABCDB=EC B;=FEDEFDA9FDE6F6F7./01=9D;6F$：#$%&()*+G；H：#$%&()*+G-./018前 I 个吸收峰对应流出液进行亲和纯化，纯化蛋白经毛细管电泳分析证实纯度达+%NIO，每升培养基纯化蛋白量为$HN%.7，#2#-(34 电泳如图.。蛋白冻干后用于配体-受体竞争结合实验。图./01 蛋白的纯化5678.(B=6:6AED69F 9:./01:=9 ABCDB=EC B;=FEDEFD$：=9D;6F E=J;=；H：;CBD;9:#;PE?;A6:6A L6F?6F7；!$!：F9F-;A6:6AL6F?6F78体-配体亲和性，从各管特异性结合$H%)-0Q-$的量和抑制率曲线（图,）可以看出，与对照组相比，纯化的./01 蛋白与 0Q-$具有较强的亲和性。当加样量为%!7时，纯化的./01 蛋白对肺癌 3%!+细胞的竞争性抑制率可以达到（+.N+H U$N$+）O。图,./01 对层粘连蛋白的竞争性结合5678,*9;D6D6V;L6F?6F7 EEMRP;ML9C!#!EF?!$!P9W DP;E9BFD 9:=E?69CEL;CC;?CE6F6F L9BF?D9 3%!+A;CC;A6:6AECCM WP;F 6FA=;E6F7 E9BFD 9:B=6:6;?./01 EF?3(1)0=;AD6V;CM；!EF?!%!P9W DP;6FP6L6D69F=ED;9:./01EF?3(1)0N2EDE=;=;FD?BC6AED;?;D;=6FED69F 6F DW9;E=ED;8%讨论./01 是一种具有多种功能的蛋白质，既可以介导细胞与细胞外基质的粘附作用，并在多种肿瘤细胞中过表达，促进肿瘤的浸润转移与多药耐药%，又可以与导致海绵状脑病的朊蛋白结合.，同时其前体蛋白还作为核糖体的一种组成成分，参与核糖体的组装、成熟过程/，而且该蛋白在生物进化过程中具有严格的保守性，提示该蛋白可能具有更为重要的生物学功能,。研究发现，./01 是由其 I/J2 的前体（I/J2 CE6F6F=;A;D9=;AB=9=，I/01(）蛋白通过翻译后加工依靠分子内疏水作用形成的同源或异源二聚体+。I/01(位于细胞浆内，与核糖体结合%S.连继勤等：人./J2 层粘连蛋白受体在毕赤酵母中的表达及活性分析蛋白!#具有共同的序列，所以也称为$%&()!#，而*%&位于细胞膜表面，主要作为&+的受体介导细胞与细胞外基质的粘附，故两者在大小、分布及功能上均有一定差异。因此获得一定量的*%&蛋白对于研究其结构及结构与功能的关系十分必要。由于编码*%&与$%&(的,-+.为同一序列，利用原核表达系统得到的产物为$%&(而不是*%&，从真核细胞中直接纯化往往又具有成本高而产率低的缺点。酵母细胞因兼具了原核生物繁殖快、成本低、易培养和真核生物翻译后加工的优点而成为表达外源真核基因的理想宿主细胞，甲醇营养型酵母表达系统的研究近年来更得到迅速发展。同时有研究表明，在酿酒酵母和白色假丝酵母细胞表面均有*%&同源物的表达且保守性极高/#。基于此，本研究利用 0123456781 公司近年来开发的多拷贝毕赤酵母表达系统对*%&进行了表达研究。*%&,-+.受甲醇诱导型启动子.9:/调控，由!;因子信号肽引导分泌于表达上清中，避免了胞内蛋白酶的降解并有利于产物的纯化。研究中发现表达在上清中的目的蛋白有*%&和$%&(两种形式，且两种蛋白均可与*%&多抗驴血清发生特异性反应，表明诱导后细胞内表达的产物应为$%&(，部分$%&(在分泌过程中二聚化形成*%&。有关*%&二聚体的形式，由于目前尚未在*%&中鉴定到其他蛋白成分，故倾向于*%&是由$%&(经酰基化后形成的同源二聚体，本研究结果尚不能就此做出判断。利用?8 A;%B 凝胶柱可以将*%&和$%&(两种蛋白分开，并能够对表达上清进行浓缩和脱盐，然后利用 C+D5 活化的 56E8 D 凝胶柱可以特异性地纯化到*%&蛋白，纯度达到 FBG$H，完全能满足活性测定的要求。在小量（/&DIIJ 培养基）诱导的情况下，每升培养基可纯化目的蛋白/KGB*L7，可满足常规实验操作的要求。*%&在多种癌细胞的细胞膜表面过表达，尤其是肺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌细胞，这种过表达与肿瘤细胞的浸润转移密切相关/M/$。本研究所用的肺癌.BF 细胞为高转移性癌细胞，细胞表面的*%&受体蛋白过表达，因此该细胞可与*%&的配体分子&+;/特异性结合，结合特征符合一般的配体与受体结合特征，具有饱和性，细胞结合实验也证明了这一点。纯化的*%&可与肺癌.BF 细胞膜上的*%&受体竞争性结合/KB0;&+;/，从而使细胞所结合的/KB0;&+;/数量下降，达到抑制细胞与/KB0;&+;/结合的目的。当*%&用量为 B7 时抑制率可以达到（F*GFK N/G/F）H。说明纯化的*%&蛋白与其配体&+;/具有高亲和性，具备了相应的生物学活性。总之，本研究提供了一种获得人*%&蛋白的简单易行的方法，获得的蛋白能够满足进一步实验操作如结构测定、功能分析的要求，为研究*%&在相关疾病发生发展中的作用机理、与其配体的相互作用位点及设计针对性的生物学制剂打下基础。!#!$%&（参考文献）/O3!P8Q，T85 J，!#$U QQV 587TQ48?7818E 31 LQ37114 L8Q16L 43EET8E 3?8143P38?SV ETS45,4328=VS53?3W4361U%&(#)*!&，K#，(（*）：/F M/B%U K D8516 X，(655313-，CE437Q3613 Y，!#$U Z=8*%R-QL3131 58,8!46531,58E8E 4TL65 7758EE32818EE SV 58L6?8Q317 QL3131;/U+),-*&.!$#(#)*!&，K#B，)(（K）：$F$M#*U$&3T C（刘长征），17 O-（王活丹），OT J（胡 雅 儿）U!853L814Q+T,Q85 I8?3,318 1?+T,Q85(=5L,6Q67VU D83317：(86!Q8 E I8?3,Q(TSQ3E=317 O6TE8（人民卫生出版社），/FFF，!U%_ M _KU A=6E=.，D1?V6!?=VV，6Q8&，!#$U 0E6Q4361 6P QL3131;S31?317!564831 P56L 4=8!5646W61!5E348/!0123#)0#,-)-4#)0 4=4LV L8?348,8QQ?=8E361U%0-*2!3，/FFF，*+（$）：BB/M BB_U B A3214;O65a34W X，-23?E61 D，83,=U&L3131;31?T,8?E371Q31731 4TL65,8QQEU(#)*!&/!，K#B，(*（/）：/;/#U*X1，83EE 1E;?6L3114 1874328$%R-)*%R-QL313158,8!465 LT414 3L!35E(5(74361 31 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