纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化.pdf

李诗虹,陈秋如,杨志坚,等纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化 J福建农业科技,():收稿日期:作者简介:李诗虹,女,年生,本科生,主要从事食品质量与安全方面研究.通信作者:陈凌华,女,年生,博士,副教授,主要从事植物生物化学与分子生物学研究(E m a i l:c l i n g h u a_ c o m)基 金 项 目:福 建 省 教 育 科 学“十 四 五”规 划 年 度 课 题(F J J K B K );福 建 省 大 学 生 创 新 创 业 训 练 计 划 项 目(S ).纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化李诗虹,陈秋如,杨志坚,陈凌华(福建农林大学金山学院,福建福州 ;福建农林大学农学院,福建福州 )摘要:为优化纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺条件,采用单因素试验和正交试验相结合的方法,考察纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间和液料比等因素对荷叶碱提取率的影响,得到纤维素酶提取荷叶碱的最佳工艺条件为:纤维素酶添加量 m gg,酶解温度,酶解时间 m i n,液料比(m L/g);在此条件下,荷叶碱的提取率可高达 .研究结果可为后续荷叶碱的开发利用提供了积极参考价值.关键词:荷叶碱;纤维素酶酶解法;提取;工艺优化中图分类号:T S 文献标志码:A文章编号:()D O I:/j c n k i f j n y k j P r o c e s sO p t i m i z a t i o no f t h eE x t r a c t i o no fN u c i f e r i n eb yC e l l u l a s eE n z y m a t i cH y d r o l y s i sL IS h i h o n g,CHE NQ i u r u,YANGZ h i j i a n,CHE NL i n g h u a(J i n s h a nC o l l e g eo fF u j i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y,F u z h o u,F u j i a n ,C h i n a;C o l l e g e o fA g r i c u l t u r e,F u j i a nA g r i c u l t u r ea n dF o r e s t r yU n i v e r s i t y,F u z h o u,F u j i a n ,C h i n a)A b s t r a c t:I no r d e r t oo p t i m i z e t h ep r o c e s s c o n d i t i o n so f e x t r a c t i n gt h en u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e sb yc e l l u l a s ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s,t h ee f f e c t so f t h ea d d i n ga m o u n to f c e l l u l a s e,e n z y m a t i c t e m p e r a t u r e,e n z y m a t i c t i m ea n dt h e r a t i oo f l i q u o r t om a t e r i a l o nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fn u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e sw e r e i n v e s t i g a t e db yu s i n gt h em e t h o do f c o m b i n i n gt h es i n g l e f a c t o r t e s ta n do r t h o g o n a l t e s t T h eb e s t t e c h n o l o g i c a l c o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o no fn u c i f e r i n ei nl o t u sl e a v e sb yc e l l u l a s ew e r ea s f o l l o w s:t h ea d d i n ga m o u n t o f c e l l u l a s ew a s m gg,t h ee n z y m a t i c t e m p e r a t u r ew a s,t h ee n z y m a t i c t i m ew a s m i n,a n dt h er a t i oo f l i q u o r t om a t e r i a l(m L/g)w a s U n d e r t h e s ec o n d i t i o n s,t h ee x t r a c t i o nr a t eo f n u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e s c o u l db e a sh i g ha s T h e r e s e a r c hr e s u l t s c o u l dp r o v i d ep o s i t i v er e f e r e n c ev a l u e f o r t h es u b s e q u e n td e v e l o p m e n t a n du t i l i z a t i o no fn u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e s K e yw o r d s:N u c i f e r i n e;C e l l u l a s ee n z y m a t i ch y d r o l y s i s;E x t r a c t i o n;P r o c e s so p t i m i z a t i o n 荷 叶 为 睡 莲 科 植 物 莲N e l u m b on u c i f e r aG a e r t n 的干燥叶,自古就有“清热解暑、去脂瘦身”的美誉.荷叶药食两用,荷叶碱作为荷叶主要活性成分,具有降脂降糖、抗肿瘤、抑菌、抗病毒等药理作用,并作为荷叶质量控制指标收录于中国药典(年版).我国拥有丰富的荷叶原料资源,有低廉的生产成本和极高的产量,但利用率却很低,大部分被废弃于池塘,给环境保护和 年第期经济建设造成极大浪费.随着健康中国的推进实施,以荷叶碱为代表的植物活性物质已成为人们关注热点.高效便捷提取荷叶活性物质荷叶碱,将其应用于食药保健或学术研究等方面,将具有积极的实践意义.目前荷叶碱的提取方法主要有加热回流法、索氏提取法、超声波法、微波法、酶解法等.根据荷叶碱易溶于有机溶剂以及酸性介质,常用的 浸 提 剂 有 乙 醇、甲 醇、氯 仿、HC l水 溶液 等,但这些浸提剂原液一般有刺激气味.为高效便捷安全、且能最大程度维持荷叶碱的药理活性,本研究在柠檬酸缓冲溶液的酸性介质中,探索纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺条件.柠檬酸缓冲溶液常用于食品生产,安全性高.纤维素酶酶解法反应条件温和、通过破坏荷叶细胞壁,有效促进活性内溶物的释放.本研究采用正交试验,优化了影响荷叶碱提取的纤维素酶添加量、酶解温度、酶解时间和液料比等因素,为后续荷叶碱的开发利用提供了参考依据.材料与方法 材料与试剂河北省雄安县的干荷叶(市购);荷叶碱标准品、纤维素酶(m g)、柠檬酸(分析纯)、柠檬酸钠(分析纯),购自福州鼎国生物技术有限公司.仪器数显恒温水浴锅(群安实验仪器有限公司);紫外可见分光光度计 N(上海仪电分析仪器有限公司);P H S C酸度计(上海雷磁有限公司);岛津AUY 电子天平(岛津国际贸易上海有限公司);拜杰多功能B J 型粉碎机(德清拜杰电器有限公司).试验方法 荷叶碱标准曲线的测定称取荷叶碱标准品 m g,用p H柠檬酸缓冲溶液定容至 m L,得到 gm L储备液.移取m L储备液定容于 m L容量瓶,得到 gm L标准母液;吸取 、m L的标准母液,用柠檬酸缓冲溶液定容于 m L容量瓶,配成不同浓度的荷叶碱标准溶液.用紫外分光光度计于 n m扫描,测定出荷叶碱标准品的最大吸收波长,然后在测得的最大吸收波长处,测定各浓度的荷叶碱标准溶液的吸光度,绘制标准曲线.荷叶碱提取率的计算方法荷叶碱的提取率(cvn)m 式中:c为荷叶碱浓度,gm L;V为样液体积,m L;n为提取液的稀释倍数;m为样品质量,g.荷 叶 碱 提 取 的 工 艺 流 程结 合 前 人 研究,并考虑纤维素酶适宜p H范围,拟定本试验操作流程:称取经干燥、过 目筛的干荷叶粉g 液料比(m L/g)加入柠檬酸缓冲溶液纤维素酶m g 水浴 m i n室温冷却离心取上层清液m L,加柠檬酸缓冲溶液定容于 m L容量瓶分光光度法测定荷叶碱含量.荷叶碱提取的单因素试验设计在 工艺流程基础上,考察以下个单因素的不同水平对荷叶碱提取率影响.()酶添加量:固定酶解温度,酶解时间 m i n,液料比 (m L/g),考察 不 同 纤 维 素 酶 用 量(、m gg)对荷叶碱提取率的影响.()酶解温度:固定酶解时间 m i n,液料比 (m L/g),酶 用 量 m gg,考 察 不 同 酶 解 温 度(、)对荷叶碱提取率的影响.()酶解时间:固定酶解温度,液料比 (m L/g),酶用量 m gg,考察不同酶解时间(、m i n)对荷叶碱提取率的影响.()液料比:固定酶解温度,固 定 酶 解 时 间 m i n,酶 用 量 m gg,考察不同液料比(、)对荷叶碱提取率的影响.荷叶碱提取的正交试验设计根据单因素试验结果,设计四因素三水平正交试验考察酶添加量、酶解温度、酶解时间和液料比对荷叶碱提取率的影响(表).表正交试验因素水平T a b l eF a c t o r l e v e l o f t h eo r t h o g o n a l e x p e r i m e n t水平因素A酶解温度()B酶添加量(m gg)C酶解时间(m i n)D液料比 李诗虹等:纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化 年第期结果与分析 荷叶碱标准曲线绘制由图可知,在 n m处荷叶碱有最大吸收峰,故后续试验选用 n m作为测定波长.通过测定各荷叶碱标准溶液的吸光度,得到荷叶碱的标准曲线回归方程(图):y x (y为提取液的吸光度A,x为提取液的浓度);其相关系数R为 ,线性关系良好.图荷叶碱的吸收光谱F i g A b s o r p t i o ns p e c t r u mo fn u c i f e r i n e图荷叶碱标准曲线F i g S t a n d a r dc u r v eo fn u c i f e r i n e 荷叶碱提取的单因素试验结果 酶添加量对荷叶碱提取率的影响由图可知,荷叶碱提取率随着纤维素酶添加量的增大而增大,当纤维素酶添加量为 m gg时,荷叶碱提取率达到最大,其后随着纤维素酶添加量的增加,提取率有所降低.当纤维素酶添加量低于 m gg时,纤维素酶的增加使其对荷叶细胞壁的降解作用加剧,有利荷叶碱的溶出释放,所以荷叶碱的提取率会逐渐升高;当纤维素酶与底物的反应达到饱和状态时,荷叶碱提取率达到高峰;随后由于底物浓度不变,酶量的增加导致酶产生竞争性抑制,使酶促反应效率下降,荷叶碱提取率也略微降低.因此,选取 、m gg作为正交试验中纤维素酶添加量的个试验水平.注:图中不同小写字母表示差异显著(P ),以下各相同.图酶用量对荷叶碱提取率的影响F i g E f f e c to f t h ee n z y m ea m o u n t o nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fn u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e s 酶解温度对荷叶碱提取率的影响由图可知,纤维素酶的最适温度为,当温度低于或高于,酶的反应活性均未达到最大值,荷叶碱的提 取 率 均 低 于 的 提 取 率.低 温 时(T),酶活 性 随 温 度 升 高 而 提 高;但 过 高 温 度(T)会引起酶蛋白变性,导致提取率下降.故选择、作为正交试验中酶解温度的个试验水平.图酶解温度对荷叶碱提取率的影响F i g E f f e c to f t h ee n z y m a t i c t e m p e r a t u r eo nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fn u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e s 酶解时间对荷叶碱提取率的影响由图可知,荷叶碱提取率在酶解时间 m i n时最高,这也是酶促反应的最佳时间.酶促反应需要有个时间过程,使酶与底物充分接触反应,因此酶促时间在 m i n之前,提取率随着酶促反应的趋于完全 年第期李诗虹等:纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化而不断提升;由于酶活性对时间有依赖性,酶解时间大于 m i n后,随后时间的增加,酶的催化活性下降,提取率有所降低.故选择、m i n作为正交试验中酶解时间的个试验水平.图酶解时间对荷叶碱提取率的影响F i g E f f e c to f t h ee n z y m a t i c t i m eo nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fn u c i f e r i n e i nl o t u s l e a v e s 液料比对荷叶碱提取率的影响由图可知,当液料比小于 时,由于荷叶干粉的量较多,该比例下所能溶出的有效成分是有限的,存在剩余物料利用不完全的情况,溶剂不够会导致提取不完全;这时随着溶剂的增加,溶出的有效成分也随之增加.当液料比等于 时,提取率最高.当液料比大于 时,过大的液料比降低了提取液的浓度,导致荷叶碱提取率下降.故选取 、作为正交试验液料比的个试验水平.图液料比对荷叶碱提取率的影响F i g E f f e c to f t h er a t i oo f l i q u o rt om a t e r i a lo nt h ee x t r a c t i o nr a t eo fn u c i f e r i n e i n l o t u s l e a v e s 正交试验结果由表可知,影响荷叶碱提取率的因素顺序为C(酶解时间)B(酶添加量)A(酶解温度)D(液料比).其中,酶添加量、酶解时间、酶解温度这个因素对荷叶碱提取率影响极显著,液料比对荷叶碱提取率影响显著(表).正交试验结果分析显示,荷叶碱提取的最佳表现组合为ABCD.按照此优化后得到的提取条件,再次进行荷叶碱的测定,测得荷叶碱提取率为 .表荷叶碱提取的正交试验结果T a b l eO r t h o g o n a l t e s t r e s u l t so f t h ee x t r a c t i o no fn u c i f e r i n e f r o ml o t u s l e a v e s试验号酶解温度A酶添加量B酶解时间C液料比D提取率()K K K k k k R 李诗虹等:纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化 年第期表荷叶碱提取正交试验结果的方差分析T a b l eV a r i a n c ea n a l y s i so f t h eo r t h o g o n a l t e s t r e s u l t so f t h ee x t r a c t i o no fn u c i f e r i n e f r o ml o t u s l e a v e s方差来源自由度偏差平方和均方值FPA B C D 误差 总变异 注:“”与“”分别表示因素对荷叶碱提取的影响显著(P )、极显著(P ).结论本研究在柠檬酸缓冲溶液的酸性介质中,研究纤维素酶酶解法提取荷叶碱的最佳工艺.纤维素酶酶解法提取荷叶碱,能有效保持荷叶碱的生理活性;提取适宜的酸度条件由食品加工生产中常见的柠檬酸缓冲溶液提供,较一般的盐酸、硫酸或醋酸更加的稳定安全,维持溶液p H值效果好.通过正交试验获得纤维素酶提取荷叶碱最优条件为酶解时间 m i n、酶 添 加 量 m gg、酶 解 温 度、液料比 (g m L),得到的荷叶碱提取率为 .该提取方法提取效率高、操作简便易行且安全、对试验条件要求不高,可为后续以荷叶碱为代表的食药功能产品的开发利用提供积极参考价值.参考文献:C U IH T,L IYT,C A O M,e ta l U n t a r g e t e dm e t a b o l o m i ca n a l y s i so ft h ee f f e c t sa n d m e c h a n i s mo fn u c i f e r i n et r e a t m e n to n r a t sw i t hn o n a l c o h o l i cf a t t yl i v e rd i s e a s eJF r o n t i e r si nP h a r m a c o l o g y,:HUAN GXB,HA ON,C HE NG QC h e m i s t r ya n db i o l o g yo fn u c i f e r i n eJI n d u s t r i a lC r o p sa n dP r o d u c t s,:Q IQ,L IR,L IH Y,e ta l I d e n t i f i c a t i o no f t h ea n t i t u m o ra c t i v i t ya n dm e c h a n i s m so fn u c i f e r i n et h r o u g han e t w o r kp h a r m a c o l o g ya p p r o a c hJA c t aP h a r m a c o l o g i c aS i n i c a,():陈畅,谢永艳,黄丽萍荷叶碱药理作用的研究进展 J南京中医药大学学报,():陈强,杨维丹,刘永静荷叶总生物碱的制备方法研究J江西中医药大学学报,():邢毅,刘杰索氏提取荷叶生物碱及纯化工艺探究 J食品工业,():郑振佳,席兴军,赵先恩,等超声辅助提取高效液相色谱法测定荷叶中的生物碱 J食品与发酵工业,():肖桂青,方俊,卢向阳,等微波辅助提取荷叶总生物碱的工艺研究 J天然产物研究与开发,():,宁娜,韩建军,胡宇莉,等酶法辅助回流提取荷叶中荷叶碱的工艺研究 J中国兽医杂志,():刘雪敏响应面法优化荷叶中生物碱提取的研究 D武汉:武汉工程大学,潘诗哲,但凡,樊洁敏,等响应面法优化荷叶生物碱盐提取工艺及其纯化 J精 细 化 工,():,王福刚,曹娟,刘斌,等星点设计效应面法优选荷叶总生物碱提取工艺 J中药材,():潘旭,郭丽响应曲面法优化酶辅助酸性乙醇提取荷叶生物碱工艺 J食品科技,():杨洪斌,张初燕浅析酶的最适温度并不是“最适”的原理J生物学教学,():(责任编辑:柯文辉)年第期李诗虹等:纤维素酶酶解法提取荷叶碱的工艺优化