天然药物化学实验讲义.docx

青岛科技大学化工学院天然药物化学实验讲义第二版药 剂 教 研 室 编二六 年目 录目录1天然药物化学实验须知2天然药物化学实验技术.4实验一 大黄中蒽醌类成分的提取、分离和制剂鉴别30实验二 绞股蓝总皂苷的提取和制剂鉴别35实验三 汉防己生物碱的提取、分离和鉴别38实验四 芸香苷的提取、分离和鉴定444实验五 中药制剂薄层色谱鉴别的应用49附录55 天然药物化学实验须知（一）实验要求 1实验前应认真预习，做好预习笔记，明确实验目的，掌握实验原理，了解实验步骤，安排好当天实验计划。2实验时要遵守实验室制度，按照操作要求，认真操作，正确使用各种仪器，努力掌握基本操作技术。养成及时记录的习惯，观察到的现象和结果以及有关的重量、体积、温度或其它数据，应立即如实记录。3实验室内保持安静、整洁。不许大声喧嚷，不许吸烟，不迟到不随便离开。随时注意反应情况和做好下一步的准备工作。保持桌面、仪器、水槽、地面四洁。废弃的固体和滤纸等丢入废物缸内，绝不能丢入水槽和丢到窗外。 4实验后要认真分析实验现象，作出合理结论，写出实验报告，提取纯化产品包好，贴上标签，交给老师。必要时还需进一步查阅某些尚未理解的理论和知识。5每次实验完毕，值日生负责整理公用仪器，将实验台及地面打扫干净，倒清废物缸，检查水电开关，关好门窗。（二）实验室规则1在实验室中要穿白大衣，实验中不准做与实验无关的事。2必须遵守实验室的各项制度，听从教师指导，尊重实验室工作人员。3实验前应清点并检查仪器是否完整，装置是否正确，合格后才能开始实验。4使用仪器时要轻拿、轻放，贵重仪器未经教师允许不得擅自动用。一旦损坏仪器应及时报损、补领，不得乱拿，乱用别人的仪器。5公用仪器和药品，用完后立即归还原处，不可调错瓶塞，以免污染。仪器使用完毕应清理干净。节约用水、用电，节约试剂，严格掌握药品用量。（三）实验室安全注意事项1实验前应检查仪器是否完整无损，装置是否正确。回流、蒸馏时，冷凝水是否通畅，干燥管是否阻塞，在常压下进行蒸馏或回流，仪器装置必须与大气相通，不能密闭。2回流或蒸馏易燃溶剂（特别是低沸点易燃溶剂），不能使用明火加热，要根据溶剂的沸点选用水浴、油浴或电热套。液内要放几颗沸石，防止过热冲瓶或暴沸。若在加热后发现未放入沸石，则应待冷后放入，加热过程中也不得加入活性炭脱色，否则会发生暴沸。3蒸馏、回流易燃、易挥发、有毒液体时，仪器装置切勿漏气，冷凝管流出液应用弯接管导至接受瓶中，余气应用橡皮管通往室外或水槽里。4减压系统应装有安全瓶。加压柱色谱时，层析柱及储液瓶机械性能要高，连接要牢，注意控制压力，以防炸裂。5使用易燃溶剂时，应在远离火源和通风的地方进行，启封易挥发溶剂瓶盖时，脸要避开瓶口并慢慢启开，以防气体冲到脸上。6有毒、有腐蚀性的药品应妥善保管，操作后立即洗手，勿沾及五官及创口。7使用电器设备及各种分析仪器时，要事先了解电路及操作规程。使用时，注意仪器和电线不要放在潮湿处，手湿不要接触电源。8欲将玻璃管插入塞中，可在塞孔涂些水或甘油等润滑剂，用布包住玻璃管使其旋转而入，防止折断。9.实验室一旦发生火灾事故时，应保持镇静，并采取各种相应措施。首先，要立即断绝火源，切断电源并移开附近的易燃物质。三角瓶内溶剂着火可用石棉网或湿布盖熄。小火可用湿布或黄沙盖熄，火较大时应根据具体情况采用相应的灭火器材。（四）实验报告格式天然药物化学实验报告的格式不是固定不变的，可以按题目的内容及要求作适当调整。一般包括下列内容：实验报告中除应标明专业、班级、实验组、姓名、实验时间外：1题目2目的要求3基本原理 主要的提取分离及鉴定原理。4操作 以流程图表示，简明扼要，包括现象记录。5鉴定 包括化学反应的试剂、现象及结论，色谱鉴定条件、结果及结论。6产品 产品颜色、晶形、重量、熔点以及得率。7讨论 包括实验过程中主要注意事项、关键步骤、实验成败的原因及心得体会。8思考题 可以根据老师的要求，回答各实验中的某些思考题。9. 实验报告要求字迹端正，图表清楚，叙述有条理，尽量做到既有所观察的实验现象，又有说明和解释；既有实验数据又有分析和结论；既有成败的经验教训又有自己的实践体会，甚至有改进的建议。天然药物化学实验技术提取、分离、纯化、鉴定是贯穿于天然药物化学实验的全过程的基本操作单元。正确掌握和灵活处理各个环节的操作技能是训练学生严格认真的科学态度与良好工作习惯，促进理论与实践结合的一个重要环节。天然药物主要来源于植物、动物、矿物、海洋生物等，大部分是植物。其特点是所含成分复杂，常见结构相似的产物共存一体，甚至同时含有多种活性成分，有着多方面的临床用途。天然药物品种繁多，因地区用药习惯、文献的记载混乱等诸多原因，常致品名混乱。即使同一品种其所含成分、含量也因产地、取材部位、采集时间、贮存条件及存放时间等的不同而变化。因此，在实验之前，必须对材料进行品种鉴定。确定学名、记录采集地和时间、药用部位，并留样备查。研究天然药物时，应查阅有关文献资料、了解前人对该植物或同属植物中化学成分的分离、药理及临床研究情况，特别应搜集该成分的各种提取分离方法、工业生产方法，再根据具体条件进行设计，确定提取分离路线。（一）天然产物提取技术提取是研究天然产物的一个重要步骤，是采用适宜的溶剂和适当的方法，将所要的成分尽可能完全地从天然药物中提取出来，同时注意避免或减少其它杂质的提出。常用的提取方法有溶剂提取法和水蒸气蒸馏法。提取方法设计是否合理和操作是否正确将直接影响下一步分离、纯化。提取前，通常对实验材料进行预处理。将其粉碎成粗粉，增加药材的表面积，以提高提取率。但粉碎过细，表面积太大，表面吸附作用也随着增加，反而影响溶剂扩散速度，同时，杂质的提出率也随之增高。因此，一般以能通过二号筛的粒度为宜。种子类药材常含有大量油脂，可以先用压榨法将大部分油脂除去后，再粉碎。富含纤维素、淀粉的根茎类药材，若用水作溶剂提取时。因多糖类高分子亲水性成分遇水易膨胀发粘稠产生冻胶状物，使提取、过滤困难，则以打成粗粒、切成小段或薄片为宜。植物体内所含的苷类往往与某种特殊的酶共存于同一组织的不同细胞中，当细胞破裂，在适宜的温度和湿度下，酶与苷接触，产生酶解作用。提取苷类成分时，将药材粗粉用乙醇或沸水提取，杀灭酶的活力，在提取腈苷和蒽醌苷时，尤需注意处理。但在提取次生苷或苷元时，却要利用酶解作用，如从毛花洋地黄叶中提取狄戈辛，从穿山龙中提取薯蓣皂苷元。1溶剂提取法溶剂的提取过程是溶剂对药材组织细胞不断作往返的扩散、渗透、溶解的过程，直至药材组织细胞内外溶液中，被溶解的化学成分的浓度达平衡为止。影响提取的因素除了前述的药材粉碎度之外，还有溶剂的选择、提取的方式、时间、温度等。（1）溶剂的选择选择适当的溶剂是提取步骤的关键。溶剂的极性大体可根据介电常数的大小来判断。常用溶剂的极性排列顺序为：石油醚 苯 无水乙醚 氯仿 乙酸乙酯 丙酮 乙醇 甲醇 水它们的介电常数分别为1.8、2.3、4.3、5.2、6.1、21.5、26.0、31.2、81.0天然产物的极性大体可分为3类：即极性（亲水性）、非极性（亲脂性）、中等极性（即亲水又亲脂）。依据相似相溶的规律，极性成分易溶于极性溶剂，亲脂性成分易溶于非极性溶剂，通过对欲提取成分及与其共存成分的极性差异来选择溶剂，如提取苷元、游离生物碱常用亲脂性溶剂氯仿、乙醚；苷类成分由于结构中含糖分子，羟基数目增多，表现出比其苷元有较强的亲水性，则可选择极性较大的溶剂如乙酸乙酯，正丁醇等。尚需说明的是，文献提供的化合物的溶解度是指纯品在溶剂中的溶解度。在粗提时，药材处于复杂的混合物状态，各成分的溶解度相互影响，可能由于成分间的助溶或发生化学作用，使溶解度有较大的改变。如用水提取时，水不溶的成分有时会被带出；从酒精提取物中分出的各种纯化合物，有时难溶于乙醇中；因油脂类杂质的存在，使香豆素可溶解于石油醚中。这也是常以水或不同浓度乙醇作为粗提的溶剂的原由。 总的来说，选择溶剂除了考虑溶解度外，尚需顾及溶剂的价格，使用是否完全，处理是否方便及是否与天然产物起化学变化等其它条件。 在实际工作中，依据工作的目的，可分定向提取法和系统溶剂提取法两类。从天然药物中提取某一已知成分或某类成分，可根据它们的性质，选择适当溶剂进行定向提取，如用石油醚直接提取细辛醚；提取有机酸时，可将药材用适量酸水浸润，使其游离，然后用脂溶性溶剂提取，系统溶剂提取法是研究天然药物成分的常用的初步提取分离方法。根据天然药物中各类化学成分的极性不同，药材粉末用极性由低到高的溶剂依次提取。一般顺序是石油醚、乙醚（或氯仿）、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇（或丙酮）、水，分别得到极性不同的组分。更换溶剂前，必须将前一种溶剂挥尽。也可以先用水或醇提取，浓缩成浸膏，加入惰性填料，如硅藻土，拌匀、低温烘干，研成粗粉，再用上述溶剂系统依次提取。本法的缺点是由于各成分间的助溶作用，同一类成分往往也会分散在邻近的几个部位中，这一现象较为普遍发生。虽如此，但系统溶剂提取法仍是研究成分不明的天然药物最常使用的方法。（2）提取的方法提取方法的选择，主要从溶剂性质及被提取成分遇热稳定性来考虑。浸渍法 将药材粗粉置于适当容器中，加入适量溶剂如稀醇、酸性醇、水、酸水或碱水等，密闭，时常振摇或搅拌，室温下浸提1天2天后，过滤。一般可重复提取2次3次，第2、3次浸渍的时间可缩短。合并浸渍液，浓缩后得提取物。本法适用于提取遇热易破坏的成分或含大量淀粉、粘液质、果胶、树胶等多糖的药材。因提取在室温及静态下进行，提取效率低，耗时长，特别是用水作溶剂，提取液易发霉变质，必要时可加入适量防腐剂。图1 渗漉装置渗漉法 是将药材粗粉置渗漉筒内，使溶剂自上而下匀速流动，达到渗漉提取天然产物的一种浸出法。因溶剂一直处于动态，造成了浓度差，使扩散能较好的进行，故本法浸出效率较浸渍法高。因在常温下渗漉，适用于遇热易破坏的成分的提取。常用溶剂有不同浓度的乙醇、酸性乙醇、碱性乙醇、酸水、碱水和水等。连续渗漉装置见图1。操作步骤为浸润、装筒、排气、浸渍和渗漉。装筒均匀、松紧合适，充分浸渍和控制流速为关键。一般流速以每分钟2ml5ml为宜。通常收集渗漉液约为药材重量的8倍10倍，或以成分鉴别试验决定渗漉终点。生产上，则可将后期的稀渗漉液套用来提高溶剂的浸出效率。溶剂消耗量大和提取时间长是本法的不足之点。 煎煮法 将药材粗粒或薄片置适当容器（避免用铁器）中，加水加热煮沸。一般煎煮2次3次，第1次1h，第2、3次可酌减煎煮时间。含挥发性成分及遇热易破坏成分的天然药物不宜用本法。含多糖类量大的药材因煎煮后，淀粉等多糖呈糊状，使提取液粘稠，过滤困难，也不适宜。回流提取法 将药材粗粉置于圆底烧瓶中，添加乙醇或其它低沸点有机溶剂至烧瓶容量的1/22/3处，接上球形或直形冷凝管，置水浴上加热回流适时，趁热滤取提取液，药渣再用新溶剂回流2次3次，若遇成分在溶剂中不易溶解或药材质地坚实不易溶出时，需适当延长每次提取时间或增加提取次数，合并滤液，浓缩即得提取物。本法提取效率较高，但溶剂用量较大，操作也较麻烦，因药材与水浴接触，受热温度较高、时间较长，不适用于遇热不稳定成分的提取。连续回流提取法 索氏提取器弥补了分次加热提取法中需要溶剂量大并操作麻烦的不足，但提取时间较长，一般约需4h10h才能提取完全，因此，对热不稳定的成分慎用。为防止成分破坏，可在提取过程中，提取1h2h后转移出提取液，另加新溶剂再继续提取。超声提取法 超声波是一种弹性机械振动波，是O以外的声振动。本法利用其高频率的振动，产生并传递强大的能量给药材和溶剂，使它们作高速度的运动，产生的穿透效应比电磁波深。由于大能量的超声波作用在液体里，当振动处于稀疏状态时，液体被撕裂成许多小空穴，待其在瞬间闭合时，产生高达数百毫帕的瞬时压力，这一现象称作空化现象，这种空化现象可击碎药材，加速药材中的成分溶入溶剂，使其进一步提取，从而增加了提出效率，因此，超声提取法的提取效率优于前述各提取法。本法操作简便，适用于各种溶剂的提取；提取时间短，一般只需数十分钟即可完成；不需加温即可达到提取目的，故也适用于对热不稳定成分的提取。2水蒸气蒸馏法水蒸气蒸馏法只适用于具挥发性，能随水蒸气馏出而不被破坏，与水不发生反应而又难溶于水的天然产物的提取。如挥发油、小分子挥发性成分麻黄碱、丹皮酚、蓝雪醌的提取。实验室用的水蒸气蒸馏装置见图2。将药材粗粉置蒸馏瓶中，加适量水充分润湿，体积为蒸馏瓶容量的1/3为宜。加热水蒸气发生器产生水蒸气，通入蒸馏瓶中，将药材中挥发性成分共同蒸馏出来，经冷凝管，收集于接受瓶中。为避免部分水蒸气冷凝增加蒸馏瓶内体积，必须使蒸馏瓶保温或用小火加热。蒸馏中断或完成时，必须先打开三通管的螺旋夹，使与大气压相通后，才能停止加热水蒸气发生器，以免蒸馏瓶中液体倒吸入水蒸气发生器内。分离一些在水中溶解度较大的挥发性成分常采用盐析法，在蒸馏液中加入达饱和量的氯化钠。硫酸铵等，促使挥发性成分自水中析出，或采用低沸点脂溶性溶剂萃取。图2实验室水蒸气蒸馏装置水蒸气蒸馏法的原理是基于两种互不相溶的液体共存时，两组分的蒸气压和它们各自在纯状态时的蒸气压相等，混合体系的总蒸气压为两组分蒸气压之和，也就是说，总蒸气压恒定高于任一组分的蒸气压，而沸点则恒定低于任一纯组分的沸点，也就是这里所提取的挥发性成分，其沸点一般高于100。因此，当研究的天然产物的沸点很高，不易直接进行蒸馏，或者在达到纯组分的沸点以前其已开始分解，不能用常压蒸馏的方法提取时，可采用本法来进行纯化。超临界流体是物质处于临界温度和临界压力以上时，所形成的一种特殊的相态，其物理性质介于液体和气体之间，具有密度接近液体、粘度近于气体，扩散系数为液体的百倍，介电常数也随着压力增大而增加等特性，从而呈现出较液体溶剂易于穿透到样品介质中的优点。超临界流体萃取法是利用超临界流体作为萃取剂从液体或固体样品中萃取成分的方法。应用本法提取天然产物，常用的萃取剂是超临界二氧化碳。其具有操作范围广（常用压力8MPa30MPa，温度3580），便于调节，尤适合于对光、热不稳定成分的萃取；可通过控制压力和温度达到选择性地提取各类成分的目的，通过降低流体的压力使被萃取的成分凝析而分离，使萃取到分离一步完成；二氧化碳具有无毒、无味、不燃烧、不残留、价廉易得、可循环使用等优点。超临界二氧化碳对亲脂性成分溶解性能与二氯甲烷相当。对极性大、分子量大的成分萃取需加入夹带剂如水、甲醇、乙醇、戊醇等改变选择性、提高溶解度。超临界二氧化碳萃取技术虽已显示诸多的优点，但由于工艺技术要求高，属高压设备，投资较大，目前尚处于发展阶段。（二）天然产物分离、纯化技术用各种提取方法得到的提取液，一般体积较大，所含成分的浓度较低，需进行浓缩以提高浓度。若溶剂选择合适，提取液略作浓缩，即有结晶析出，如用乙醇提取桔皮中的橙皮苷，用氯仿提取白花丹中的蓝雪醌。但这种情况是极个别的，通常所得的提取液是诸多成分的混合物，往往需经反复多次的分离纯化处理才能获得单体。分离和纯化是两个不可绝然分割的步骤，它们经常是同时进行互相包含的过程。在分离过程中包含着纯化的作用，而在纯化过程中也包含着分离微量成分或杂质的过程。1蒸馏与浓缩蒸馏是浓缩、分离和纯化液态物质的最重要最常用的手段。所采用的方法视溶剂和有效成分的性质而定。常压蒸馏法适用于有效成分受热不易分解，低沸点有机溶剂特别是氯仿、乙醚、石油醚等的提取液的浓缩。处理乙醚提取液时，禁止用明火或电炉加热，需用电热板或没有明火的其它装置加热水浴。减压蒸馏法适用于溶剂沸点高，有效成分受热易分解的提取液的浓缩。在实际工作中，对溶剂沸点超过70的，在可能条件下应采用减压浓缩。常用抽气减压装置有水泵和油泵。为防止水压变动引起倒吸，在水泵和蒸馏装置间需装安全瓶；为防止挥发性物质及腐蚀性气体侵入油泵，需装置安全瓶和干燥、吸收装置。蒸馏结束后应按顺序先撤热源，关闭压力计活塞，慢慢打开安全瓶活塞，使整个系统与大气相通后，才能关上水泵或油泵。减压蒸馏如苷、多糖等产生大量泡沫的水提液时，需在蒸馏瓶与冷凝器之间装一防泡球，以用来消泡。薄膜蒸发装置该装置使溶液以液膜状态迅速通过加热管，受热表面积大，从而提高了浓缩效率，并缩短了受热时间是一类较实用的浓缩方法，特别适用于浓缩以水或稀醇作溶剂的提取液。有时提取液浓缩到小体积放置后，有固体或结晶析出，可将析出物滤出，供进一步分离。滤液再浓缩，放置，再观察和处理，直到母液蒸干为止。如含叶药材用70乙醇提取时，在回收乙醇至含醇量近1520时，放置冰箱，绝大部分叶绿素可沉淀出来。可滤除后，再进一步浓缩至近稠膏状时，乘热转移至容量较小的圆底烧瓶内，置热水浴上，直接减压抽气，使提取物发泡成干燥疏松状，方便进一步处理。2萃取萃取是天然药物化学实验中用于分离、纯化有效成分的常用操作之一。其原理是利用混合物中各成分在两种互不相溶（或微溶）溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的。依据分配定律，化合物在一定的温度和压力下，溶解在两个同时存在的互不相溶的溶剂里，达到平衡后，该化合物在两相中浓度的比是一常数，称为分配系数（K）。各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，则分离效率就越高。我们可用分离因子值来表示分离的难易；A、B两种成分在同一溶剂系统中进行萃取，则其分离因子：设KA10， KB=01，则KAKB10/0.1100第2次用Sml有机相萃取，剩在水相中的溶质为W2，同样， 若每次用Sml有机相作n次萃取，最后剩余在水相Vml中的溶质Wn为： 若n次SmI有机相作总量1次萃取，剩余在水相VM中的溶质W1为： 说明总量相同的溶剂，分次萃取的效率要比1次萃取的效率高。例如，在100ml水含有4g正丁酸的溶液，在15t时用100ml苯萃取，设在该温度时正丁酸在苯和水中的分配系数KD3。用苯100m11次荤取后在水中剩余量为1.0克；用100ml苯分3次等量萃取，则在水中剩余量为0.5g。实际操作中，溶剂在第1次提取时，一般为水提液的1/3，以后的用量可酌减，约为1/41/6。液一液萃取中常遇到乳化现象，特别是自碱性水提液中以氯仿进行萃取时，这种现象更为严重。这是因为天然药物中含有皂苷、蛋白质、多种植物胶质、鞣质等表面活性物质，加上两相互不相溶的溶剂和振摇等因素促成了乳状液的形成。有时由于存在少量轻质的沉淀、溶剂互溶、两液相的密度相差较小等原因也会使两液相不能清晰地分开。用来破坏乳化的方法有：较长时间静置。将乳状液分出（有时乳化层就是所需要的成分），再换新溶剂萃取。将乳状液加温或冷冻。将乳状液抽滤。若因两种溶剂能部分互溶而乳化，可加入少量电解质（如氯化钠），利用盐析作用破乳。在两相密度相差较小时，也可加入氯化钠，以增加水相的密度。加入低级醇如乙醇、戊醇，其表面活性更强，把原来的界面活性剂顶替，达破乳目的。pH梯度萃取法是分离酸性、碱性、两性成分常用的手段。其原理是由于溶剂系统 pH变化改变了它们的存在状态（游离型或解离型），从而改变了它们在溶剂系统中的分配系数。如混合黄酮苷元，由于结构中酚羟基的数目和位置不同，各自所呈酸性强弱不同，可使溶于有机相（如乙醚），依次用5碳酸氢钠，5碳酸钠、02氢氧化钠、4氢氧化钠的水溶液萃取而达分离的目的。分离碱性强弱不同的游离生物碱，可用pH由高至低的酸性缓冲溶液顺次萃取，使碱性由强到弱的生物碱分别萃取出来。（2）逆流连续萃取法是根据两种互不相溶的溶剂的相对密度不同而自然分层，分散相液滴逆流穿过连续相而进行连续萃取的方法。其操作简便，萃取比较完全并可避免乳化，适合各种密度的溶剂萃取。装置见图5。萃取管内填充小瓷圈或不锈钢丝。萃取管可用一根，数根或更多，以分配效率的需要而定。密度小者置高位贮存器中，大者置低位贮存器中。如用氯仿从川楝皮水浸液中提川楝素，则氯仿置低位贮存器中，水提取的浓缩液贮于高位容器内。萃取是否完全，可用薄层色谱，纸色谱及显色反应或沉淀反应进行检查。（3）逆流分溶法与液滴逆流分配法逆流分溶法是一种多次，连续的液一液萃取分离方法，经仪器操作，作数百次甚至千余次的两相溶剂的振摇、静止、分离、转移程序，将两个分配系数很接近的化合物分离。操作条件温和，样品容易回收，特别适合于分离因子较小、中等极性、不稳定物质的分离。样品极性过大或过小，或分配系数受浓度或温度影响过大时则不易用本法分离。易于乳化的溶剂系统也不宜采用。液滴逆流分配法又称液滴逆流色谱法。原理类似逆流分溶，使移动相在固定相的液柱中呈液滴形式垂直上升或下降达到逆流色谱分离的方法。溶剂系统的选择基本同逆流分溶法，但要求能在短时间分离成两相，并能生成有效的液滴。因不需振荡，故不易乳化或产生泡沫）特别适用于皂苷类的分离。用氮气驱动移动相，适用于易被氧化物质的分离。目前已广泛用于皂苷、生物碱、酸性成分、蛋白质、糖类等天然产物的分离与精制，并取得良好的效果。3结晶与重结晶大多数的天然产物在常温下是固体物质，具有结晶的通性，有一定的熔点和结晶学的特征，有利于化合物的鉴定。结晶法是利用混合物中各成分在某种溶剂中溶解度不同的特性，滤去某些固体成分中伴随的杂质，而使它们通过析晶过程达到互相分离、精制的目的。结晶的形成是同类分子的自相排列的产物，如试样中杂质太多，阻碍分子的排列，就很难析晶，也就是说，试样必须达到一定的纯度。通常，能结晶的大部分是比较纯的化合物，但不一定是单体化合物，有时它仍是个混合物，需进一步分离纯化。因此，结晶法是天然药物化学实验中获得单体的一个重要环节。形成结晶的条件是有效成分在欲结晶的混合物中的含量、适宜的溶剂系统、合适的温度和时间、正确的操作等。其中最主要的是选择合适的溶剂。（1）溶剂的选择理想的溶剂必须具备以下条件：不与结晶物质起化学反应；杂质与结晶物质在溶剂中的溶解度相差很大。例如，结晶成分热时溶解度大，冷时溶解度小，而对杂质则冷热都不溶或冷热全能溶解；溶剂的沸点不宜大高或太低。沸点太低则溶剂易挥发逸失，过高则不易将结晶表面的溶剂除去。常用的溶剂为甲醇、乙醇、丙酮、氯仿、乙酸乙酯等；能给出较好的晶形；无剧毒。事实上很少能找到如上所要求的理想溶剂，需要通过小量摸索试验而定，或藉文献资料，参考同类型化合物的一般溶解性质和结晶的溶剂条件，或依据“相似相溶”规律按所推测的结晶物质的极性大小来选择溶剂。当不了解结晶物质的溶解性能时，可取少量样品（数毫克），用不同溶剂（数滴或数毫升）在小试管中，用滴管逐滴加入溶剂试验其溶解度，包括冷时或热时的溶解度。一般首选乙醇，因它为脂溶性和水溶性基团均可用的溶剂，且经济安全。有些成分在一般溶剂中不易形成结晶，可考虑其它不常用的溶剂如二氧六环、二甲基亚矾、乙睛、甲酞胺、二甲基甲酞胺、冰醋酸等。如葛根素在冰醋酸中形成结晶；大黄素在吡啶中易于结晶。也有用水或酸水结晶，如小檗碱可在水中结晶；石蒜碱可用5盐酸溶液生成盐酸盐结晶。当难以选择到合适的单一溶剂时，通常使用混合溶剂。先将样品用易溶的溶剂溶解，然后在加热的情况下，分次滴加对样品难溶而与原来溶剂能相混溶的溶剂，直至初显混浊，再略加热溶解或稍滴加易溶的溶剂，使溶液澄明后置室温或冰箱中析晶。在选择混合溶剂时，最好使需结晶的成分在低沸点溶剂中较易溶解，而在高沸点溶剂中较难溶解，这样可在放置过程中，先挥发低沸点溶剂，使结晶慢慢析出。常用的混合溶剂有：水一乙醇、乙醇一乙醚、石油醚一苯、水一丙酮、乙醚一乙醇一乙酸乙酯、石油醚一乙醚等。（2）结晶溶液的制备结晶溶液一般是过饱和溶液。通常将需结晶物质置于锥形瓶中，加入较需要量略少的溶剂，于水浴上加热至微沸，为了避免溶剂挥发及安全操作，应在装置中接上冷凝管，若未完全溶解，可逐步添加溶剂，直至所需结晶物质刚好完全溶解（要注意判断是否有不溶性杂质，以免误加过多溶剂）。趁热过滤，放置冷处析晶。结晶时一般以低温较好，且温度应逐渐降低，使结晶慢慢形成，这样才能使结晶含杂质少，纯度高。溶剂的用量是影响结晶的纯度和速率关键。在放置过程中，先塞紧瓶塞，避免液面先出现结晶，而致结晶纯度较低。如不结晶，可打开瓶塞，使溶剂逐步自然挥发，慢慢析晶。也可以用玻璃棒或金属刮勺摩擦瓶壁或加入微量晶种，诱导析晶。有些化合物即使在含量高而又纯的情况下也不易结晶时，可将其制备成结晶性衍生物，如生物碱可制成盐，有 机酸制成钾、钠、钙、铵盐，羟基化合物制成乙酰化衍生物或苯甲酞衍生物，碳基化合物可以制成脎或腙类化合物等。分离后，再用化学方法处理使其恢复到原来化合物。（3）重结晶与分步结晶一般采用减压抽滤把结晶从母液中分离出来。晶体需用少量溶剂洗涤，以除去存在于结晶表面的母液。洗涤时，宜暂停抽气，用刮刀小心拨动，使所有晶体润湿，略静置后再行抽气。母液适当浓缩放置，又可得到一部分纯度较低的晶体。上述得到的结晶仍为粗晶，有时仍是几个成分的混合体，可以用分步结晶使之分开。由于不同成分的含量不同、形成晶体的条件不同，析晶也有先后。因此在制备结晶时，最好在形成一批结晶后，立即抽滤分出结晶，母液略作浓缩，放置后得第二批结晶。抽滤后又浓缩母液得到数批结晶。从上述分步结晶法所得各部分结晶，其纯度往往有较大的差异，而且常是不同的成分，在未作检查之前不要贸然混合。纯化结晶常用的方法是数次的重结晶。重结晶用的溶剂可以用原先制备结晶的溶剂，但也经常改变，因为经精制后的结晶在溶剂中的溶解度和混晶的溶解度随着纯度的改变而改变。通常，可依据结晶外观的色泽均匀，晶形一致程度和是否具有一定的熔点和较小的熔距；结合在薄层色谱或纸色谱上，经数种不同展开系统展层，均显示出的单一近圆形的斑点来判断结晶的纯度。必要时，可制备衍生物，采用高效薄层色谱、气相色谱、高效液相色谱来进一步确定结晶是单一化合物。4干燥分离得到的单体需要干燥，除去附着在结晶表面的少量水分或溶剂，尤其在进行测定熔点。波谱分析、定性和定量分析时必须使其完全干燥，以免影响检测的准确性。在两相溶剂萃取后，有机相需干燥除去水分，精制或再生溶剂时也需干燥脱水。所以，干燥是天然药物化学实验中最普通而又很重要的操作。选择适宜的干燥方法，选择适当的干燥剂是本操作的关键。（1）基本原理干燥的方法大致可分为物理法和化学法两种。吸附、分馏以及利用共沸蒸馏除去水分均为物理法。用吸附物理法干燥时，常用分子筛吸附去水，分子筛是多水硅铝酸盐的晶体，晶体内部有许多孔径大小均一的微孔，具有很强的吸咐能力，能有效地把小于其孔径的分子吸进孔内，从而达到将不同大小的分子“筛分”的目的。其无毒、无腐蚀性，不溶于水和有机溶剂，能在pH为512的范围内使用。常用的为3A钾A型和4A钠A型，它们的微孔的表观直径分别约为32、42，能吸附直径4的分子，商品规格的吸附水量分别为170mgg、240mgg（水分子的直径约为3，最小有机分子甲烷的直径为49）。新的分子筛用前应于35010，烘2h活化脱水，待冷至200左右，应立即存于干燥器内备用。分子筛宜用于除去微量的水分，如样品中水分过多，应先用其它干燥剂去水后，再用分子筛干燥。用过的分子筛可在相同温度烘烤解吸后重复使用。化学法是以干燥剂去水，按其去水作用可分为两类：能与水可逆地结合生成水合物如氯化钙、硫酸钠等。与水发生不可逆的化学反应生成新的化合物，如金属钠、五氧化二磷。实验室应用最广泛的是前者。（2）固体的干燥重结晶后，滤集的结晶表面上仍吸附有少量溶剂，需根据其性质选择适当的方法进行干燥。少量结晶可用数层滤纸挤压吸出溶剂，此法常使晶体上沾污滤纸纤维。对易挥发性溶剂，可将结晶置表面皿上铺成薄层，上覆一滤纸避免灰尘沾污，置于室温自然干燥。对热稳定的化合物可置红外干燥箱或烘箱中加热干燥。因溶剂的存在，使结晶可能在较其熔点低得多的温度下就开始熔融，因此操作中应十分注意控制温度并经常翻动，以免造成分解或变色。置干燥器内常压或减压下进行干燥是最常用的方法，其适用于易吸湿，在较高温度干燥时会分解或变色的物质，以及未明性质的样品的干燥。真空干燥器干燥效率较高，抽气时干燥器外需以布包裹，一般以盖子推不动为宜，以防炸碎，最常用的干燥剂是变色硅胶。石蜡片可用来吸收乙醚、氯仿、苯等溶剂。实验过程中抽滤得的固体析出物视具体情况选择处理。真空恒温干燥器（干燥枪）干燥效率高，特点是可除去结晶水或结晶醇，需专用装置，当需要化合物完全干燥（如作波谱分析送样），才采用本法进行干燥处理。（3）液体的干燥 溶剂萃取液在浓缩前和溶剂的精制，再生脱水干燥是必经的步骤。选择干燥剂的首要条件是其不与被干燥的有机化合物发生任何反应和互溶，次之是干燥效能和价格低廉。操作时应将被干燥的液体中的水分尽可能分离干净，不应有任何可见的水层。干燥剂的用量要适当，因其在吸水的同时也会吸附部分溶质和溶剂，必要时，宁可先加入一些干燥剂，密塞后振摇片刻，放置一段时间，若发现干燥剂附着瓶壁互相粘结，可过滤后再加入新的干燥剂或更换干燥效能较强的干燥剂。因液体中含水量不同，干燥剂质量、颗粒不同，处理时温度不同等因素，难以规定干燥剂具体用量，实验者应在实践中仔细观察积累经验。5其他方法沉淀法、盐析法、吸附法、透析法、升华法等也是分离、纯化天然产物的常用方法。该部分内容在理论教材中已作介绍。事实上，从天然药物中获得单体常是多种分离手段结合运用，逐步分离，纯化的结果。（三）色谱分离技术色谱法是目前一种被广泛应用的物理、化学的分离纯化、分析的方法。由于天然产物的各类成分结构不同，性质各异，选择的色谱法也不同的。如一般生物碱的分离可用氧化铝或硅胶吸附色谱法；极性较高的生物碱可用分配色谱法；季铵型水溶性生物碱常用分配色谱法或离子交换色谱法；对具多元酚结构的黄酮类和鞣质的分离前用聚酰胺色谱法或葡聚糖凝胶色谱法；分离三萜皂苷常用大孔吸附树脂法和分配色谱法。总的来说，对非极性成分往往考虑硅胶或氧化铝吸附色谱法；若极性较大的成分则采用分配色谱法或弱吸附剂的吸附色谱法；对酸性或两性成分可用离子交换色谱法，有时也可用吸附色谱法或分配色谱法；凝胶色谱法用于分离分子大小差异较大的物质。根据色谱分离原理不同，现将几种常用的色谱分离技术介绍如下：1吸附色谱法在天然产物的分离与精制工作中，吸附色谱法应用十分广泛。吸附色谱法是利用混合物中不同组分的分子、溶剂分子与吸附剂表面分子的分子间力的相互作用不同，引起了不同的物理吸附性能，随着流动相的移动，在不断地进行着吸附、解吸附的可逆过程中，藉各组分在两相间的迁移速度不同而达分离的方法。物理吸附过程一般无选择性，但吸附强弱及洗脱难易（迁移快慢）都大体遵循“相似者易于吸附”的经验规律。常用的吸附剂是硅胶、氧化铝和活性炭，前二者均属极性吸附剂。硅胶略呈酸性，具有中程度吸附能力，应用最广泛，适用于分离极性、非极性化合物。氧化铝具有较强的极性，市售色谱商品有碱性（pH10），中性（pH7）及酸性（pH4）3种氧化铝，其中以碱性氧化铝的吸附性最强。硅胶和氧化铝的吸附能力（活度）与含水量有关，其分级见表1一2。硅胶活化温度为100110，烘30min。氧化铝在400活化6h，可得III级活度，保存于密闭容器中备用。用时根据需要，按表1一2，在氧化铝中分次加入计算量的水，充分搅匀，不时振摇，平衡3h4h后，测定其活度。关于活度测定方法，是采用对一系列偶氮苯染料吸附情况判断定级。详细操作参阅分析化学教材。表1一2硅胶、氧化铝的活度与含水量活度等级含水量（）硅胶氧化铝051525280361015 活性炭属非极性吸附剂，对非极性物质有较强的亲和能力，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中随着溶剂极性的降低吸附力降低。适用于分离亲水性成分。市售色谱商品有粉末状、颗 粒状和锦纶活性炭3种，其吸附活性依次减弱。用前，前二者150，后者100活化4h。吸附色谱法的三要素是吸附剂、溶剂（展开剂、洗脱剂）、被分离物质，三者之间相互联系又相互制约，处理好三者的关系是分离成败的关键。（1）吸附薄层色谱法吸附薄层色谱法是一种将吸附剂用适当方法涂布于玻璃板或薄膜、铝箔片上进行色谱分离的操作方法，具有微量、快速、简便的特点，广泛应用于天然产物的定性、定量分析、微量制备，也可配合柱色谱作跟踪分离等。被分离物质的极性、酸碱性等性质是选择吸附剂的主要依据。供薄层色谱用的商品吸附剂的种类有单纯的、添加粘合剂的、添加荧光剂的。常用的硅胶H，硅胶G（含石膏1535）。氧化铝G、硅胶HF254（指含在紫外波长254nn1激发下显荧光的物质）等。有时，用032酸溶液。042氢氧化钠溶液或用乙酸钠，磷酸盐等不同pH缓冲溶液代替水铺板，以期改变吸附剂性能而达到提高分离效果的目的。为提高糖。醇类化合物的分离效果，有时用硅胶：氧化铝（1：1）铺板。为分离不饱和程度不同的化合物，常用10硝酸银溶液代替水铺板（操作时注意避光）。上述方法制成的薄层称作特殊薄层。在吸附色谱的三要素中，展开剂的选择是最关键的。主要考虑溶剂的极性和溶剂的选择性（溶解度）。极性大的被分离物质需用极性较大的展开剂。实际工作中需经试探实验而确定合适的展开剂，其方法是在一块薄层板上，用铅笔划分成若干小格，于各小格中央点上一滴样品，使挥干溶剂后，用毛细管吸取极性大小不同的各种溶剂，点加到各样品点上，待扩散后在紫外光灯下观察或用显色剂显色，如果某一溶剂能很好地把样品展开成一层层明显的色环，就用此溶剂在薄层板上试展层，以能使欲分离的主要物质的Rf值在0.30.7的范围，或使混合物能达到最佳分离度作为指标。通常，尚需要在此溶剂基础上进一步调整展开剂的极性，采用混合溶剂。在分离碱性或酸性物质时，可在展开剂中加入少量碱（氨水、二乙胺）或酸（甲酸、醋酸），也可在层析缸内置一小杯挥发性碱或酸，均能收到良好分离效果。有时溶剂中含少量极性杂质，如氯仿中含1乙醇。乙醚中含少量的水，会影响展开剂的极性，因此，为了提高色谱分离的效果和重现率，要注意所用溶剂的规格和混合溶剂配制的准确性。文献介绍和实践经验在优选展开剂工作中常起着主导作用。薄层色谱操作包括：制板点样展开定位等步骤。若为制备性薄层，还须有洗脱操作。制板 市售商品预制薄层板有氧化铝G，硅胶G，硅胶GF254等。但目前最常用的仍是手工自制板。用于制备薄层板的玻璃要求表面光洁、平整，最好使用1mm2mm厚的优质平板玻璃。常用规格有5cm10cm，5cml5cm，15cml5cm等，有时也用载玻片的。用前须用洗液或碱液清洗并晾干存放。铺板的方法可分为干法和湿法两类。干法铺板是将吸附剂直接均匀地铺于玻璃板上，虽方法简单，但因易吹散、松动，给操作带来不便，用的甚少。湿法铺板是将吸附剂加水或其它溶液先调成糊状再铺层。为了增加板的硬度，便于使用，常添加适量粘合剂（如石膏。羧甲基纤维素钠（CMC-Na）或两