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天然药物化学实验指导（供药学药剂专业用）河北医科大学药学院天然药物化学教研室2006年3月前 言天然药物化学是运用现代科学理论与技术研究天然药物中化学成分的一门学科，是药学、药剂、药分、中药学等专业及相关专业本科学生必修的专业课，是国家职业药师(中药学)资格考试必考课程。本课程在有机化学、分析化学、有机化合物波谱学、中药学、生药学等课程的基础上，重点讲授天然药物中化学成分的化学结构、理化性质、提取分离方法、结构鉴定、生理活性、天然药物新药开发等方面的基本原理和实验技能，培养学生具有从事天然药物方面的研究、开发和生产的能力，为我国药学事业的发展输送人才。天然药物化学实验是天然药物化学课的重要的、必不可少的组成部分。学习的主要目的是通过实验检验在课堂上所学的理论知识，使学生对理论知识的理解更加深入，掌握得更加牢固；通过实验训练学生的基本操作技能，培养学生分析问题和解决问题的能力，使学生获得从事天然药物化学科研工作的基本训练；使学生养成严谨的科学态度和良好的科学作风。实验教学的重点是加强学生基本操作技能的训练，要求学生掌握以下技能：（一） 提取分离方面1. 要求掌握常用的经典方法的原理及操作。其中包括液-固提取法（浸渍、渗漉、回流提取等）、液-液萃取法（简单萃取法、梯度萃取法、逆流分布法）、重结晶法等。2. 掌握纸色谱、薄层色谱、柱色谱的原理和基本操作。（二） 结构鉴定方面1. 化学方法掌握各类化学成分的一般定性反应在鉴定中的应用；掌握重要衍生物的制备方法及其在结构鉴定中的应用；了解重要降解反应的原理及应用。2. 光谱方法 了解UV、IR、NMR、MS在天然药物化学成分结构测定中的应用。 目 录实验须知1实验技能操作规范2实验一 大黄中蒽醌苷元的提取、分离和检识8实验二 芦丁的提取、水解；黄酮类化合物与糖类的鉴别10实验三 苦参生物碱的提取、分离、鉴别和生物碱的检识15实验四 利用纸色谱先导设计法从洋金花中提取分离生物碱19实验五 一叶萩碱的分离和鉴定23实验六 青蒿素的提取、分离和检识 25实验七 穿心莲内酯的提取、分离、鉴定及亚硫酸氢钠加成物的制备26 实验八 设计性实验29附录31实 验 须 知学 生 要 求1、第一次实验前要清点所有仪器，若有缺损则向教师报告并填单补充。以后做实验时如有损坏要立即向教师报告，填单补充并按学校规定比例赔偿。最后一次实验课结束后在教师监督下清点所有仪器。2、每次实验前要求提前预习实验内容，了解实验的原理和操作过程。实验中随时做好记录，在检查仪器装置正确后方可进行实验。实验完毕后认真总结，写好报告，提取纯化所得单体产物包好，交给老师。3、实验中不准做与实验无关的事情，严禁吸烟、饮食、大声喧哗，未经允许不得擅自离开，并应随时注意观察实验异常情况。4、实验结束时，应将实验室清扫干净，门、窗、水、电关好，经老师检查许可后方可离去。实 验 室 须 知天然药物化学实验中所用的药品多数是易燃、有毒、腐蚀性、挥发性、刺激性及易爆的药品，实验操作有时在加温加压等情况下进行，需要各种热源、电器或其它仪器，操作不慎易造成火灾、爆炸、中毒、触电等事故。所以应加强安全的责任心，提高警惕，消除隐患，遵守实验规则，避免事故。1仪器药品都是国家财产，须节约爱护使用；公用物品用完后立即放回原处。2使用易燃、易挥发及有毒的有机溶剂时，在回流、蒸馏、减压蒸馏等操作过程中，不能明火直接加热，要放沸石；若在加热时发现无沸石则应冷却后再加，防止爆沸冲出。减压系统应装有安全瓶。加液或移液时应停火或远离火源。起封易挥发溶剂瓶盖时，脸面要避开瓶口，慢慢启开，以防气体冲向脸部。3接触有毒及强腐蚀药品应小心操作，操作后要立即洗手。4实验中，若涉及有毒或腐蚀性气体产生应在通风橱中进行操作。必要时可戴好防护用具进行工作。在进行易燃性有机溶剂实验时，一定要按照操作规程进行。不可将易挥发、易燃性有机溶剂倒入水槽中，应按老师要求处理，有机废液应倒入废液瓶内。5实验台上不得放无用的药品仪器。在实验时要做到水槽、仪器、桌面、地上清洁整齐。6万一不慎着火，要沉着冷静积极抢救，立即切断室内电源和火源，用石棉布将着火部位盖严，使其断绝空气而熄灭；或视火势情况选用适当灭火器材进行灭火。在实验室宜使用二氧化碳灭火器。消防器材，沙箱、石棉布、灭火器等应放在方便固定的地点，不能随意移动，均应处于备用状态。以下为实验室中常发生的事故，应予以特别注意且避免：1蒸馏或回流加热时，发现未放沸石、未等溶液冷却就补加沸石，结果溶液冲出瓶外而引起火灾。2蒸馏或回流易燃物或有毒物时，忘记开冷凝水，大量蒸气逸出亦易引起火灾或造成人员中毒。3蒸馏易燃物时塞子漏气引起火灾。4用三角烧瓶作减压装置的接收器容易炸裂。5使用真空干燥器时，用完就直接开干燥器的放气阀，结果使泵内的机油被吸到干燥器中，样品被污染。6实验室水槽被杂物堵塞。第一部分 天然药化实验中常用实验技能操作规程一、圆形（径向）纸色谱技术（一）操作技术及程序1. 准备仪器及试剂 培养皿、色谱滤纸、毛细管、相关试剂等。2准备色谱滤纸 取直径12.5cm的普通圆形滤纸，将滤纸划分出数个区间（根据所点样品的数目划分区间，滤纸不得折叠），在此色谱滤纸中心处用铅笔轻轻画直径约为1.52.0cm的圆，做为点样的起始线。在此圆的中心打一小孔，将一个长方形的滤纸条搓成一个滤纸芯，插在色谱滤纸的小孔中，纸芯与色谱滤纸成直角，纸芯的高度要比培养皿上下合盖后的内部高度稍低。3点样 用毛细管将样品及对照品溶液点在色谱滤纸上所画的圆形起始线上，晾（吹）干。做好标记。4选择及配制展开剂。5展开 将展开剂适量倒入培养皿中，上下盖好，平衡放置，保持5分钟左右，使其内部达液气饱和。然后将色谱滤纸小心“扣盖”在培养皿的下皿中，色谱纸保持水平，纸芯保持直立并插入展开剂中，扣好培养皿上盖。展开剂将沿小纸芯向上浸湿，到达色谱滤纸后以一个圆形的湿斑慢慢向四周扩展。在展开剂浸湿色谱纸一定距离（一般接近培养皿边沿）时即可结束展开。将色谱滤纸取出，做好展开剂到达前沿标记，自然晾干或吹干。6显色 根据所测样品性质选择合适的显色方法，观察色斑的位置。7观察实验结果 确定出化合物斑点的位置后，用尺子测量距离，计算比移值（Rf）或与标准品对照。（二）注意事项1色谱纸小心取放，不要折叠、污染。2展开剂一定要选择合适，否则样品展开效果差。3点样量要合适，浓度小则展开后观察不清楚，浓度太大则有拖尾现象。 径向纸色谱示意图二、硅胶薄层色谱检识技术（一） 操作技术及程序1准备仪器及试剂 色谱缸、TLC专用玻璃板（5cm20cm）、研钵、薄层用硅胶G、0.5%羧甲基纤维素钠（CMC）水溶液、其它相关试剂等。2制板 硅胶G-CMC板 称取2.53g硅胶G放入研钵中，加入约79ml 的0.5%CMC水溶液（硅胶：粘合剂CMC约1：23），混合成均匀的粘稠状溶液，再将其倒在TLC 玻璃板上并涂布均匀，然后轻轻颠荡，使硅胶均匀地分布在玻璃板上，形成均匀厚度的硅胶层。水平放置，自然晾干。荧光薄板 称取硅胶GF254 2.53g，同硅胶GCMC板法制备。AgNO3-硅胶板 方法一：将AgNO3加入少量水溶解，再加甲醇稀释成10溶液，把预先制好的硅胶薄层浸入该溶液内约一分钟，取出避光阴干。方法二：在硅胶G中加入一定量10硝酸银水溶液（代替水）调成糊状铺板，避光阴干。3活化 将自然晾干的硅胶板放于烤箱中，在105110中活化0.51.0小时。4点样 在距硅胶玻璃板下端1.52cm处用铅笔点样轻轻划一直线，注意不破坏硅胶平面，作为点样起始线。分别用毛细管将样品及对照品溶液点在硅胶板的起始线上，晾(吹)干，做好标记。样品点的直径应在23mm，样品点之间的间隔应不少于1cm。5选择及配制展开剂。6展开 将展开剂适量倒入色谱缸中，将薄板放于色谱缸中（不得浸入展开剂中），盖好上盖，保持1530分钟左右，使其内部达液-气饱和。然后将硅胶板下端小心慢慢地插入到展开剂中，不要使展开剂浸没点样起始线，上端用玻璃物体支起，盖好上盖。此时将会观察到展开剂沿硅胶板逐渐地向上浸湿（即展开），展开的距离一般为15cm以上。将硅胶板取出，在前沿处作出标记，自然晾干或吹干。7显色 根据样品性质选择合适的显色方法进行样品的显色观察。8计算比移值Rf及与标准品对照。（二）注意事项1硅胶板小心取放，硅胶板不要受污染、刮蹭。2样品的点样量要合适，如果浓度小则展开后观察不清楚；如果浓度太大或点样的点直径过大可能有拖尾现象。如果样品溶液的浓度较低，可用毛细管反复在点样处多点几次。3展开剂一定要选择合适，否则样品展开分离效果差。.4荧光硅胶（硅胶-GF254）与硅胶-G的使用方法相同，但不用显色剂，可在紫外灯（254nm）下观察样品展开情况。Rf值测量示意图 三、硅胶柱色谱分离技术（一）操作技术及程序1准备仪器及试剂 玻璃色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。2装柱 【湿法】 取100200目的柱色谱用硅胶适量，置于烧杯中，加入适量的有机溶剂，搅拌使硅胶完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。注意加硅胶时要打开活塞，让硅胶自然下沉，液面保持在硅胶之上，硅胶柱中不得有气泡。加样前，液面高度要保持在510mm。【干法】取100200目的柱色谱用硅胶适量，加入到色谱柱中，（主意要打开活塞）加时不断轻轻敲打色谱柱壁，使硅胶紧密均实。3加样 方法一：一般将样品溶液溶于少量开始的洗脱剂中，制成样品溶液，轻轻注入已准备好的硅胶柱上面，勿使柱面受到扰动，否则影响色谱效果。方法二：如样品不溶于开始的洗脱剂，则将样品溶于挥发性的溶剂（如乙醇、甲醇）中，然后取少量吸附剂与其拌匀，除尽溶剂，再将含有样品的吸附剂均匀地加入到色谱柱的顶端，再覆盖上少量硅胶或脱脂棉、小玻璃球将其压住，以防洗脱时冲乱顶部的拌样硅胶。4选择及配制洗脱剂。5洗脱及接收 选择好洗脱剂后，放在分液漏斗中，打开活塞慢慢连续不断地滴加在吸附柱上。同时打开色谱柱下端活塞，等份收集洗脱液，流速保持12滴/秒，一般先选用洗脱能力弱的溶剂，逐步增加洗脱能力。6同时配合TLC或其它方法检查接收液。（二）注意事项1硅胶吸附拌样的比例约为： 样品：硅胶=1:1或1:2。2吸附剂硅胶的使用量比例约为 样品：硅胶=1:3060或1:100(难分离物)。3洗脱剂的极性选择要合适，否则得不到很好的分离。4洗脱的速度要合适，一般保持在215ml/min。色谱柱分离过程示意图四、离子交换柱色谱分离技术（一）操作技术及程序1准备仪器及试剂 色谱柱、铁架台、接收瓶、相关试剂等。2预处理（活化）树脂（以强酸型阳离子交换树脂为例） 按交换样品的性质选择树脂，根据树脂的交换容量及样品的量，称取适量树脂。新树脂用无水乙醇浸泡12 h以上除去杂质，再用蒸馏水浸泡24小时溶胀。将色谱柱固定在铁架台上，调节合适高度以便接收。将树脂装入色谱柱中，水液面始终浸没树脂，避免树脂中产生气泡空洞。先用5倍量的2mol/L盐酸水溶液冲洗树脂使之转为H型，再用蒸馏水冲洗为中性；然后用5倍量的5% 氢氧化钠水溶液冲洗树脂使之转为Na 型，再用蒸馏水冲洗为中性；最后用7倍量的5%盐酸水溶液冲洗树脂使之转为H型，用蒸馏水冲洗为中性，待用。3交换 将样品的水溶液从色谱柱上端加入，按流出液约24滴/秒的速度进行交换。4. 再交换（洗脱） 用合适的方法再将交换到树脂上的成分交换下来并接收。5再生 将使用完后的树脂采用活化的方法进行再生。（二）注意事项1离子交换树脂的交换容量一般在110mmol/g，选择树脂时要看说明书的技术指标。但实际的交换容量受溶液的pH值及生产批次等的影响，都比理论值要小。2始终保持液面高度高于树脂，以免发生树脂中溶液干涸。树脂内部不能有气泡空洞。3在树脂柱上部再加盛有待交换的样品溶液的滴液漏斗，方便加液。4随时检查交换情况。五、渗漉提取技术（一）操作技术及程序1准备仪器及试剂 渗漉筒、铁架台、霍夫曼夹、接收瓶、相关试剂等。2粉碎药材 将药材粉碎成50目左右，以利于提取溶剂进入药材内部。3配制提取溶剂 4渗漉及接收 将渗漉筒固定在铁架台上，调节合适高度以方便接收，筒内下端放置纱布或滤纸，关闭霍夫曼夹。将药材放在烧杯中，加少量提取溶剂搅拌润湿后，放入渗漉筒中，将药材适当压紧。从渗漉筒上部加入提取溶剂将药材浸没，保持浸泡一定时间。打开霍夫曼夹，从下端接收提取溶液（渗漉液），渗漉速度一般为36ml/min。5即时检查 用合适的方法随时检查是否含有待提取的成分。（二）注意事项1在渗漉提取中应始终保持提取溶剂完全浸没药材。2当渗漉液中检查不出提取成分或低于要求时，即可认为提取结束。渗漉装置 六、索氏提取技术（一）操作技术及程序1准备仪器及试剂 索氏提取器、铁架台、热源（如电热套或水浴）、相关试剂等。2安装仪器 选取合适规格的索氏提取器，按照由下到上的顺序安装固定好索氏提取器（即先放置好热源，其次固定好溶剂瓶，再安装提取器中心部分，最后安装冷凝器）。整套仪器应保持垂直。3处理样品及加样 将待提取的固体样品用滤纸包好，放入索氏提取器的中心部分。4加提取溶剂 取适量提取溶剂放入溶剂瓶中，并加沸石。5加热回流提取 打开冷凝水，调节热源进行加热回流提取。6提取结束 首先关闭热源，待提取液完全冷却后再按由上到下的顺序拆缷仪器，并将提取液转移到合适的容器中。（二）注意事项1如果用非水溶剂提取则整套索氏提取器应无水干燥。2待提取样品要用滤纸包紧，上端用重物（如玻璃球）压住，以免受溶剂浸泡时上浮飘起。待提取样品放置的高度不应超过仪器中心部分中的虹吸管高度。3加热回流前要在溶剂瓶中放沸石，溶剂使用量不应超过溶剂瓶体积的2/3。4加热前应检查整套仪器磨口连接部分是否密闭。1.冷凝器2.溶剂蒸气上升管3.虹吸管4.装有药物的滤纸筒5.溶剂6.水浴索氏提取装置七、回馏（提取）技术（见有机化学实验操作规范）八、蒸馏及减压蒸馏（浓缩）技术（见有机化学实验操作规范）九、重结晶及抽滤技术（见有机化学实验操作规范）十、分液漏斗萃取技术（见分析化学实验操作规范）第二部分 天然药化实验内容实验一 大黄中蒽醌苷元的提取、分离和检识一、实验目的和要求1学习从大黄中提取分离蒽醌类化合物的方法。2掌握硅胶柱色谱的原理和操作技术，学会干法及湿法装柱。3了解蒽醌类化合物的检识方法。 二、实验原理 （综合性实验）大黄记载于神农本草经等许多文献中，具有泻热通肠、凉血解毒、逐淤通经之功效，用于泄下、健胃、清热、解毒等。自古以来，大黄在植物性泻下药中肯有重要作用，是一味很早就被各国药典所收载的世界性生药。大黄的种类繁多，优质大黄是蓼科植物掌叶大黄（Rheum palmatclm L）、大黄（R. officinale Baill）及唐古特大黄（R. tangutium Maxim.et Regll）的根茎及根，大黄中含有多种游离的羟基蒽醌类化合物以及它们与糖所形成的苷。已经知道的羟基蒽醌主要有下列五种：R1R2名 称晶 形熔 点-H-COOH大黄酸(Rhein)黄色针晶318320-CH3-OH大黄素(Emodin)橙色针晶256257-H-CH2OH芦荟大黄素(Aloe-emodin)橙色细针晶206208-CH3-OCH3大黄素甲醚(Physcion)砖红色针晶207-H-CH3大黄酚(Chrysophanol)金色片状结晶196 大黄中蒽醌苷元，其结构不同，因而酸性强弱也不同。大黄酸连有-COOH，酸性最强；大黄素连有-OH，酸性第二；芦荟大黄素连有苄醇-OH，酸性第三；大黄素甲醚和大黄酚均具有1,8-二酚羟基，前者连有-OCH3和-CH3，后者只连有-CH3，因而后者酸性排在第四位。为提高游离的蒽醌苷元的提取收率，先采用酸水解使大黄粉中苷元含量增加，因苷元的亲脂性强，水解物再用乙醚进行提取；提取后再依据苷元的不同结构及极性，采用柱色谱的技术进行分离。三、实验内容（一）实验仪器及药品玻璃色谱柱（21mm200mm）及配套分液漏斗，100ml三角瓶，蒸发皿，试管，玻璃板（520cm），色谱缸，滤纸，玻璃漏斗，铁架台，脱脂棉，250ml园底烧瓶，恒温水、浴锅，抽滤瓶，布氏漏斗，冷凝器，紫外灯。大黄粉（购）。硅胶（柱色谱用100200目）；硅胶G（薄层色谱用），乙醚（分析纯），石油醚（6090），乙酸乙酯（分析纯），20H2SO4，1%NaOH ，0.5%CMC溶液，1%茜草素乙醇溶液，0.5%醋酸镁甲醇溶液。（二）实验操作1总蒽醌苷元的提取 取大黄粉5g放于250ml的圆底烧瓶中，加入20%H2SO4水溶液60ml，在水浴上加热2小时，抽滤，滤饼用水洗近中性后于70左右干燥。滤饼干燥后，加入乙醚20ml浸泡，放置23天。2硅胶柱色谱分离蒽醌苷元 （1）装柱：【干法】色谱柱用铁架台固定后，将一小团脱脂棉放于柱底部使形成一个较松的垫层，打开活塞。称取柱色谱用硅胶25g，通过玻璃漏斗加入到色谱柱中，加时要轻轻敲打柱壁使之均实。【湿法】色谱柱用铁架台固定后，将一小团脱脂棉放于柱底部使形成一个较松的垫层，关闭活塞，倒入少量洗脱剂。取柱色谱用硅胶25g，置于100ml烧杯中，加入约40ml石油醚（6090）搅拌使硅胶完全湿润并无气泡，然后将硅胶加入到色谱柱中。要注意加硅胶时要始终将液面在硅胶固体之上，且不要有气泡，可打开活塞调节液面高度，加完后液面比硅胶固体高约510mm。（2）拌样：过滤乙醚提取液，将滤液慢慢滴加到盛有约0.51g硅胶的蒸发皿中，使液体挥干，得完全干燥的拌样硅胶。（3）加样：将拌样硅胶加入到柱色谱的顶端，然后再加入少量硅胶或脱脂棉，以防洗脱时冲乱顶部的拌样硅胶。（4）洗脱及收集：用石油醚乙酸乙酯（7:3）为洗脱剂进行洗脱（配制洗脱剂约200ml），待最初的有色段向下移动到距硅胶柱底端约10mm左右时，开始收集，约57ml为一份，至主要成分洗脱完全为止。（5）TLC检识：制备硅胶GCMC板4块，制备方法见实验技术操作规范第4页。展开剂为石油醚（6090）乙酸乙酯（7:3），配10ml。点样：总提取物（乙醚浸泡液）和各份洗脱收集液。结果在可见光下总提取物可看见5个斑点，依Rf值大小分别为大黄酚、大黄素甲醚、芦荟大黄素、大黄素、大黄酸（基本在原点），也可在紫外光下观察。根据TLC检查结果， 将相同成分洗脱液合并，水浴回收溶剂，即得分离后的单体化合物。3蒽酯类化合物的检识（1）碱液试验：取样品洗脱液及1% 茜草素乙醇溶液各2ml，分别加入1%NaOH水溶液2ml ，振摇放置分层后，观察颜色变化。（2）乙酸镁试验：在一小张滤纸上滴加样品溶液及1%茜草素乙醇溶液各1滴，干燥，喷0.5%乙酸镁甲醇溶液，于80加热5min，观察斑点颜色。四、思考题1大黄中总蒽醌苷元的提取分离原理是什么？2大黄中5个蒽醌苷元用硅胶薄层色谱进行检识，以石油醚乙酸乙酯（7:3）为展剂，其结果如何？实验二 芦丁的提取、水解、黄酮类与糖类化合物的鉴别芦丁（Rutin）亦称芸香苷（Rutoside）广泛存在于植物界中，现已发现含芦丁的植物至少在70种以上，如烟叶、槐花、荞麦和蒲公英中均含有。尤以槐花米（为植物Sophora japonica的未开放的花蕾）和荞麦中含量最高，可作为大量提取芦丁的原料。 芦丁具有维生素P样作用，有助于保持及恢复毛细血管的正常弹性，主要用作防治高血压病的辅助治疗药。一、实验目的和要求1掌握从槐花米中提取与精制芦丁的原理和方法。2掌握由黄酮苷水解制取黄酮苷元的方法。3掌握纸色谱的操作技术。4了解黄酮类化合物和糖类的一般性质。5通过测定芦丁及槲皮素的紫外光谱，了解如何利用紫外光谱对黄酮类化合物进行结构测定。 二、实验原理（综合性实验） 芦丁为浅黄色粉末或极细的针状结晶，含有三分子的结晶水，mp 174178，无水物mp 188190。溶解度：冷水中为1:10000；热水中1:180；冷乙醇1:650；热乙醇1:60；冷吡啶1:12。微溶于丙酮、乙酸乙酯，不溶于苯、乙醚、氯仿、石油醚，溶于碱而呈黄色。本实验利用芦丁具有弱酸性在碱水中成盐而增大溶解能力，用碱水（石灰水）为溶剂煮沸提取，碱水提取液加酸酸化后又可析出芦丁的结晶，并利用芦丁对冷水和热水溶解度相差悬殊的特性进行精制。 芦丁是由槲皮素（Quercetin）3位上的羟基与芸香糖（Rutinose）为葡萄糖（Glucose）与鼠李糖（Rhamnose）组成的双糖脱水合成的苷。所以芦丁酸水解可得到苷元槲皮素和葡萄糖、鼠李糖。 Rutin Quercetin三、实验内容（一）实验仪器及药品烧杯（500ml、1000ml、50ml）园底烧瓶（250 ml），玻璃漏斗，抽滤瓶，布什漏斗，三角瓶（100ml），蒸发皿，浓氨水，试管，玻璃板（520cm），色谱缸，滤纸，铁架台，脱脂棉，冷凝器，紫外灯等。槐花米，氧化钙，10 HCl，1 H2SO4，无水吡啶，醋酐，95乙醇，氢氧化钡，冰醋酸，乙酸乙酯，甲酸，浓硫酸，镁粉，浓盐酸，氢氧化胺，硅胶G，葡萄糖、鼠李糖的水溶液，邻苯二甲酸-苯胺试剂，标准芦丁、槲皮素的乙醇溶液，1AlCl3的乙醇溶液，1的葡萄糖溶液，1的蔗糖溶液，1的可溶性淀粉溶液，-萘酚试液，1 芦丁乙醇溶液，1槲皮素的乙醇溶液，1 橙皮苷的甲醇溶液，黄芩苷的乙醇饱和溶液，1FeCl3试液，2% ZrOCl2的甲醇溶液，2%柠檬酸的甲醇溶液，0.5 醋酸镁甲醇溶液，甲醇钠试液，无水醋酸钠，硼酸，无水三氯化铝溶液等。（二）实验操作1芦丁的提取与精制见如下流程 槐花米30g（研碎） 置于500ml烧杯中，加300ml热水，在搅拌下加饱和 【提取】 石灰水调至pH8，加热煮沸10min，趁热用纱布过滤药渣 滤液加pH8（用石灰水 滴加10 HCl调pH=45 ,放置调）水溶液250ml 充分冷却，待沉淀完全后，抽滤，煮提10min，趁热过滤 沉淀用水洗至中性，自然干燥，称重。 合并 药渣（弃去） 滤液 沉淀（芦丁粗品） 【精制】 悬浮于蒸馏水（约600ml）中 加热煮沸10min至溶液澄清，趁热过滤 不溶物（弃去） 滤液 放置充分冷却，抽滤 沉淀用水洗至中性沉淀（精制芦丁）（自然干燥后称重）注：取少量固体氧化钙加水搅拌，至有不溶物存在，放置，取上清液即为饱和石灰水。2芦丁的水解 称取精制芦丁1g置于250 ml园底瓶中，加入1 H2SO4100 ml(V/V) 隔石棉网直火微沸回流约30min（注意观察现象：未加热时，瓶内为混悬液，加热后，混悬液逐渐变为澄清液，继续加热，澄清液体又逐渐变为混悬液。）待水解完毕后，冷却水解液。滤取沉淀，滤液保存于三角瓶中待作糖的检识，所得沉淀用少许水洗除酸，干燥称重，计算苷元与糖的重量比。沉淀用乙醇（95%大约10-20ml）进行重结晶，即得苷元（槲皮素）。3槲皮素乙酰化物的制备取槲皮素200mg，置于50ml圆底烧瓶内，加入4ml无水吡啶，于水浴上加热回流，使其完全溶解，再加入5ml醋酐，摇匀，水浴上加热回流30min，放冷，将反应液在搅拌下倾入150ml冰水中，一直搅拌至油滴消失，固体沉淀析出，抽滤析出的白色沉淀，用水洗至中性，干燥，再用95乙醇重结晶，得细针状结晶，测定其熔点，并与文献记载的五乙酰基槲皮素的熔点（193195）对比。4色谱检识 （1）糖的纸色谱检识糖溶液的处理： 取水解芦丁时的滤液20ml，加适量Ba(OH)2细粉，边加边搅拌，使溶液调到中性（pH7），用玻璃漏斗过滤至蒸发皿中，在水浴上浓缩至约2ml左右，供纸色谱点样用。点样： 标准品：葡萄糖、鼠李糖的水溶液（2mg/ml）。 样品液：酸水解浓缩液展开剂： 正丁醇：冰醋酸：水（4:1:2不分层）配制14ml 正丁醇：冰醋酸：水（4:1:5取上层）配制5倍，放到分液漏斗中，平衡后取上层。展开方式： 用径向纸色谱法，操作见实验技术操作规范第3页显色剂： 喷雾邻苯二甲酸-苯胺试剂，用电吹风加热至出现棕褐色斑点。色谱结果： 将样品色斑与标准品色斑对照并计算Rf值，作出结论。（2）芦丁和槲皮素的色谱检识点样： 标准品：标准芦丁、槲皮素的乙醇溶液（1mg/10ml） 样品液：取少量自制的芦丁、槲皮素放于试管中加少量95乙醇，水浴加热溶解。制板： 制备硅胶G-CMC板，方法见实验技术操作规范第4页展开剂： 乙酸乙酯：甲酸：水（8：1：1）展开方式：上行法显色剂： 喷雾1AlCl3的乙醇溶液或在紫外灯（365nm）下观察荧光。色谱结果：将样品色斑与标准品色斑对照并计算Rf值，给出结论。5. 化学反应检识 （1）糖类成分的检识反应取4支试管，分别加入1的葡萄糖溶液、1的蔗糖溶液、1的可溶性淀粉溶液和蒸馏水各1ml，各试管均加入-萘酚试液23滴，混合后，沿试管壁加浓硫酸1ml，使硫酸层集于下层，观察两相溶液界面处的颜色，并比较4个试管反应的异同。取一滤纸条（约123cm），用铅笔划三个圆圈，于各圆圈内分别点1的葡萄糖溶液、1的蔗糖溶液、1的可溶性淀粉溶液一滴，待干燥后，喷雾邻苯二甲酸苯胺试剂，置100加热数分钟或用电吹风加热，观察并比较三个圆圈斑点的颜色。（2）黄酮类化合物的识别反应 取3支试管，分别加入1 芦丁、槲皮素的乙醇溶液和1 橙皮苷的甲醇溶液各12ml，再各加入1 FeCl3试液1滴，观察现象。 取3支试管，分别加入1 芦丁、槲皮素的乙醇溶液和1 橙皮苷的甲醇溶液各12ml，各均加少许镁粉，混匀，分别缓缓滴加浓盐酸（23滴），观察颜色变化情况。 取3支试管，分别加入1 芦丁、槲皮素的乙醇溶液和1 橙皮苷的甲醇溶液各12ml，再各加入-萘酚试液23滴，混合后，沿试管壁加浓硫酸1ml，使硫酸层集于下层，观察两相溶液界面处的颜色。 取2支试管，分别加入1 槲皮素的乙醇溶液和黄芩苷的乙醇饱和溶液各12ml，然后加入2% ZrOCl2的甲醇溶液数滴，注意观察颜色变化情况；再继续向试管中加入2%柠檬酸的甲醇溶液，观察颜色变化情况。 取一滤纸条(123cm)，用铅笔划三个圆圈，于各圆圈内分别点1的芦丁、1的槲皮素和1 的橙皮苷溶液各一滴，干燥后，a在日光和紫外灯下观察三个样品的颜色，作好记录；b将纸条放在水蒸气流中1分钟，再置氨气流中片刻，观察在日光和紫外灯下颜色变化；c将纸条放在通风处放置10min后，再在日光和紫外灯下观察颜色有什么变化；d最后再于三个圆圈部位喷雾1 AlCl3的乙醇溶液，干燥后，于日光和紫外灯下观察颜色的变化。 取一滤纸条（153cm），用铅笔划三个圆圈，于各圆圈内分别点1的芦丁、1的槲皮素和1的橙皮苷溶液各一滴，干燥后，喷雾0.5 醋酸镁甲醇溶液，于90加热5min，在日光和紫外灯下观察有什么颜色变化。6芦丁及槲皮素的紫外光谱测定 （1）试剂的配制a) 甲醇钠溶液（NaOMe）：取新切割的金属钠2.5g，小心分次加入到100ml干燥的光谱纯的甲醇中，所得溶液密塞贮存于玻璃容器中。b) 无水醋酸钠（NaOAc）：如有粉末状无水NaOAc（A.R），可直接供用。如无，则取醋酸钠（NaOAc.3H2O）置蒸发皿中，于120干燥2小时，粉碎即可。c) 硼酸（H3BO3）：在程序A的情况下，可直接取无水粉末状H3BO3（A.R）。在程序B的情况下，取光谱纯MeOH，加入无水粉末状H3BO3使成饱和溶液后供用。d) 无水三氯化铝溶液（AlCl3）：取1g无水AlCl3（C.P），小心加入到20ml光谱纯甲醇中，放24小时后即溶解。e) 盐酸（HCl）贮备液：取浓HCl（A.R）50ml，与蒸馏水100ml混匀后密塞贮存于玻璃中，备用。以上贮备液可保存半年之久。取30ml滴瓶，每个滴瓶分别盛上述贮备液20ml，放于紫外分光光度计旁，供测定时用。（2）测定方法：精密称取芦丁10mg于100ml容量瓶中，加甲醇溶解，并稀释到刻度，摇匀。从中吸取5ml于50ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀备用（20g/ml）。 甲醇光谱：取样品溶液置石英杯中，在200550nm内进行扫描，重复一次，观察紫外光谱。 甲醇钠光谱：取样品溶液置石英杯中， 加入3滴 NaOMe贮备液后，立即测定“样品+NaOMe”溶液的UV光谱，过5min后重新测定一次，以核对黄酮类化合物的分解情况。 AlCl3光谱：在置有样品溶液的石英杯中，加入6滴AlCl3贮备液，停一分钟测定“样品+ AlCl3”溶液的UV光谱。然后加3滴盐酸贮备液后，立即测定“样品+ AlCl3/HCl”溶液的UV光谱，随即倒掉杯内溶液。 醋酸钠光谱：取样品溶液23ml，加入粉碎的无水NaOAc振摇，至比色杯底约留有2mm厚的NaOAc时，立即测定“样品+ NaOAc”溶液的UV光谱；然后再过5min作第二次测定，以核对分解情况。 醋酸钠-硼酸光谱： 方法，在盛有样品及醋酸钠的石英杯中，加入足量的硼酸使成饱和溶液，然后进行测定。本法适用于在加入醋酸钠5分钟后无分解现象者。方法，于样品溶液约3ml中加入5滴H3BO3贮备液，然后加入NaOAc粉末，使之快速饱和后，测定“样品+ NaOAc/H3BO3”的UV光谱。根据测定结果试解析光谱并初步判断其结构，并说明理由。 四、思考题1提取芦丁工艺中影响产量和质量的因素是什么？2. 提取苷类化合物时应注意什么？3芦丁和槲皮素用不同展开剂系统展开将出现什么结果？ 为什么？ 实验三 苦参生物碱的提取、分离、鉴别和生物碱的检识苦参为豆科(Leguminosae)植物苦参（Sophora flavescens Ait）的根，味苦性寒，有清热利湿、袪风杀虫及解毒等功效。主要用于湿热黄疸、赤白带下、痛肿疮毒、皮肤疥癣以及腮炎、痢疾等。 苦参中主要含有苦参碱、氧化苦参碱、N甲基金雀花碱、氧化槐果碱、槐定碱等成分。苦参总碱及氧化苦参碱都具有减慢心率的作用，可用于心室早博等心律失常之症，苦参制剂也常用于急性菌痢、滴虫病、白细胞减少症、皮肤骚痒等多种疾病。目前药理实验表明苦参碱、氧化苦参碱等具有抗肿瘤作用。一、实验目的和要求1掌握离子交换法提取苦参生物碱的原理及方法2掌握连续回流提取法的基本操作。3了解阳离子交换树脂的性能和处理方法二、实验原理（苦参生物碱的理化性质与结构，综合性实验） 1苦参碱（matrine）：有四种形态，苦参碱为针状或柱状结晶，mp. 76，D39；苦参碱为柱状结晶，mp. 84；苦参碱为液体，bp. 223/6mmHg；苦参碱是柱状结晶，mp. 84。常见是的苦参碱。当苦参碱在石油醚中2224放置后，能析出和型苦参碱的混合结晶，而苦参碱的溶液放置在10时，能析出-苦参碱结晶，用过氧化氢处理苦参碱可转变为氧化苦参碱。四种形态的苦参碱的苦味酸盐相同，mp. 167169。 2氧化苦参碱（Oxymatrine）：C15H24N2O2，无色柱状结晶（Me2CO），mp. 162163（水合物），207（无水物）。D+47.7（EtOH）。可溶于冷水、乙醇、氯仿，难溶于乙醚、石油醚。用SO2处理可转变为苦参碱。 3N氧化槐果碱（NOxysophocarpine）：白色簇状结晶，mp. 2064槐定碱（Sophoridine）：为苦参碱的一种空间异构体，白色棱晶，mp. 106108 苦参碱 氧化苦参碱 N氧化槐果碱 槐定碱5其它生物碱的结构为：（1）安那吉碱Anagyrine：稳定性大，不被皂化，bp. 2102154mmHg（2）苦参烯碱Sophocarpine：mp. 54（3）苦参醇碱Sophoranol：mp. 171 （1） （2） （3）苦参生物碱是喹喏里西丁类生物碱，能与酸成盐而溶于稀酸水，将其盐的水溶液通过阳离子交换树脂柱进行交换，交换树脂用浓氨水碱化，再用氯仿提取得到苦参总生物碱。 三、实验内容 （一）仪器与试剂玻璃色谱柱（21mm200mm）及配套分液漏斗，烧杯（50 ml，500 ml，1000m1），渗漉筒，滤纸，纱布，100ml三角瓶，索氏提取器，恒温水浴锅，蒸发皿，试管，玻璃板（520cm），色谱缸，滤纸，玻璃漏斗，铁架台， 250ml园底烧瓶，恒温水浴锅，抽滤瓶，布氏漏斗，冷凝器等。苦参粗粉，732型强酸性阳离子交换树脂，硅胶G，乙醇，浓氨水，氯仿，无水硫酸钠，丙酮，甲醇，2mol/L HCl，0.1HCl，5NaOH溶液，氢氧