铁皮石斛SPL膜结合(ST...子的全基因组鉴定及表达分析_杨乐.pdf

，（）：杨乐，聂聪，龙小琴，等，铁皮石斛 膜结合（）转录因子的全基因组鉴定及表达分析 广西植物，（）：，（），（）：铁皮石斛 膜结合（）转录因子的全基因组鉴定及表达分析杨 乐，聂 聪，龙小琴，何基泽，颜超越，朱乾坤，王万军（西南交通大学 生命科学与工程学院，成都 ）摘 要：转录因子广泛参与植物生长发育、胁迫响应等过程。目前，没有关于铁皮石斛 膜结合（）转录因子即 转录因子的研究。为了探究 转录因子在铁皮石斛生长发育及胁迫响应等方面的作用，该文在铁皮石斛全基因组水平鉴定出 个 转录因子，并对 基因家族成员进行生物信息学分析，又利用逆转录 研究了 在不同组织部位及不同逆境处理下的表达情况。结果表明：（）为亲水蛋白，均具有 保守结构域和一些激素响应位点。（）个 在根茎叶中均有表达，在叶中的相对表达量最低；的相对表达水平均无明显差异。（）在低温、高温、干旱胁迫下的相对表达水平都有显著变化，的表达量降低最为明显，故推测 与植物体内激素响应、温度变化响应及抗旱性有关。这些结论为后续进一步开展铁皮石斛 转录因子的研究提供了参考。关键词：铁皮石斛，转录因子，基因鉴定，功能分析，基因表达中图分类号：文献标识码：文章编号：（）（），（，）：，（）收稿日期：基金项目：国 家 自 然 科 学 基 金（）；中 央 高 校 基 本 科 研 业 务 费（）；西 南 交 大 个 性 化 实 验 项 目（）。第一作者：杨乐（），硕士，主要从事植物生长发育与次生代谢研究，（）。通信作者：王万军，博士，教授，主要从事植物生长发育与次生代谢研究，（）。，：（）（），；（），：，石斛主要分布在东南亚和大洋洲的热带及亚热带地区，喜生长在温暖潮湿的环境中，附着在树干 或 岩 石 上（罗 凯 等，）。铁 皮 石 斛（）为兰科石斛属多年生草本植物，具有极高药用价值，是一种药食两用中药材，其成分主要包括多糖类、生物碱类、黄酮类以及酚酸类等，在抗肿瘤和增强免疫力等方面具有功效（唐文文等，）。近年来由于过度挖采导致野生资源大量减少，故从分子水平研究铁皮石斛的生长发育对其保育有重要意义（曾丹琦等，）。（）基因家族作为植物特有的一类转录因子，主要通过结合下游基因启动子区的顺式作用元件来调控下游基因表达。转录因子在植物的生长发育、信号传导、胁迫响应等方面有着重要的作用（吴艳等，）。这类转录因子最早在金鱼草中被发现（，）。之后有更多研究发现 转录因子在植物生长发育以及在胁迫响应中起着重要作用（，；，）。在甘蓝型油菜的愈伤组织、根、茎、叶、芽、花和角果中有大量 表达，并且这些基因可能在甘蓝耐寒性中起重要作用（，）。据最近报道，拟南芥 可能参与其从幼年到成年的营养转化、生殖期的形态变化、花青素生物合成和防御胁迫（，）。其中，在花序和花器官的发育中发挥重要作用（，），在各种低磷胁迫反应以及低磷条件下磷饥饿诱导基因表达中都有 的参与介导（雷凯健等，）。转录因子的研究是植物分子生物学的重要内容，在植物抗逆等方面起着重要作用。转录因子和基因顺式作用元件的相互作用激活了相关抗逆基因的表达，提高了植物的抗逆性。有一类特殊的转录因子存在，因其含有一段跨膜区被称为膜结合转录因子，可直接整合在细胞内的膜结构上（如细胞质膜、内质网膜、核膜等），一般处于休眠状态，当受到外界环境变化刺激后，膜结合转录因子便从膜上释放，转变为激活状态，并转运到细胞核内行使功能（王楠等，）。转录因子中也有这类膜结合转录因子，且目前并没有专门研究 膜结合转录因子的报道，因此，本研究通过 在铁皮石斛全基因组中鉴定出 个 膜 结 合 转 录 因 子，命 名 为 （）转录因子，并进行后续生物信息学及表达分析。材料与方法 材料将铁皮石斛幼苗分别置于 培养基、含 的 液体培养基、含 脱落酸的 液体培养基、质量分数为 的 液体培养基、液体培养基、液体培养基中处理 ，吸干水分后将幼苗按 装入 离心管中，并做好标记，迅速置于液氮中 ，取出放入 冰箱保存待用。以盆栽铁皮石斛幼嫩的根茎叶组织作为原材料，进行根茎叶差异表达分析。广 西 植 物 卷 试剂 多糖多酚植物总 提取试剂盒（北京擎科）、琼脂糖（北京擎科）、（北京擎科）、无酶水（北京擎科）、试剂盒（宝生物）、（上海生工）。方法 铁皮石斛 蛋白的理化性质及亚细胞定位分析从 数据库中下载拟南芥 蛋白序列，将物种限定在铁皮石斛（）并进行 搜索，下载搜索到的铁皮石斛的 蛋白序列，去除冗余序列，利用（：）预测跨膜结构域，最终选取、这 个蛋白进行研究，并分别命名为、。利用（：）分析铁皮石斛 蛋白家族的理化性质。用（：）（，）对 蛋白家族进行亚细胞定位分析。铁皮石斛 家族的系统进化树分析从 数据库中下载野蕉（）、铁皮石斛（）、拟南芥（）、蝴蝶兰（）、毛白杨（）、扇 形 文 心 兰（）、玉米（）、水稻（）、生姜（）的 蛋白序列 格式。用 邻近法构建进化树，序列比对采用，选 择，选择，选择，选 择 ，设定为，进行建树。建树结果在（：）中进行美化。铁皮石斛 蛋白质二级结构预测利用（：？）在线网站对铁皮石斛 蛋白质的二级结构进行分析，参数为默认值。铁皮石斛 蛋白质序列比对及保守基序分析 将 个 蛋白导入 （，）在 线 网 站（：）进行分析，将 的数量设定在，其他参数默认，进行分析。将铁皮石斛 蛋白序列 格式导入 中进行构树，序列 比 对 采 用，选 择，选择，选择，选择，设定为，进行构树。从 数 据 库 中 下 载 铁 皮 石 斛 蛋 白 的，利用 （，）对 保守基序、保守结构域、进化树进行绘图。将铁皮石斛 蛋白的 比对结果导入 在线网站（：）进行分析。铁皮石斛 基因结构及顺式作用元件分析从 数据库中下载铁皮石斛的基因组信息，用 进行基因结构绘制，同时获得启动子上游 的序列信息，获得的序列信息用（，）网 站（：）进行顺式作用元件预测，并用 进行绘图。引物设计利用 个 的 序列，将所得的 序列用 进行引物设计，引物大小设定为 ，产物大小设定为 ，其他参数均为默认参数，在输出的引物中选择靠近 端的作为试验所用引物，选用 做内参，相应的引物序列如表 所示。表 引物序列 基因名称 引物序列：铁皮石斛 基因表达分析将铁皮石斛幼苗分别置于 液体培养基、含 的 液体培养基、含 脱落酸的 液体培养基、含 的 液 期杨乐等：铁皮石斛 膜结合（）转录因子的全基因组鉴定及表达分析体培养基、液体培养基、液体培养基中处理 ，迅速置于液氮中 ，取出放入 冰箱保存待用。首先，用 多糖多酚植物总 提取试剂盒提取 种处理的铁皮石斛幼苗的 和铁皮石斛幼苗根茎叶 的，并 用 进行 第一链的合成。然后，以 第一链为模板，及引物进行 扩增。反应程序：预变性 ；变性 ，退火，延伸 ，变性退火延伸 个循环；继续延伸 。最后，进行 凝胶电泳，拍照记录电泳条带。数据处理及分析 用 测定电泳条带的灰度值，对所得灰度值进行处理，将处理后的数据导入 中进行分析及作图，分析方法选用 ，显著水平均设为。结果与分析 铁皮石斛 蛋白家族理化性质及亚细胞定位分析 蛋白家族的理化性质分析结果表明，的 氨 基 酸 数 目 分 别 为 、，相对分子质量分别为、；等电点 在 之间；不稳定系数在 之间，较为不稳定；脂肪系数在 之间；总平均亲水系数均为负数，在 之间，表明 蛋白均为亲水蛋白质（表）。亚细胞定位预测结果显示 定位在细胞核，定位在叶绿体。将筛选到的铁皮石斛 蛋白 进行跨膜结构域预测（图），结果显示跨膜结构域位于 末端 个氨基酸残基处。表 蛋白家族理化性质 基因符号 基因名称 蛋白 氨基酸大小 （）分子量（）等电点不稳定系数脂肪系数总平均亲水系数 铁皮石斛 基因家族的系统进化分析系统进化分析显示 个物种的 个 蛋白聚为 组（）（图），组的 蛋白共有 个，组的 蛋白共有 个，组的 蛋白共有 个，组的 蛋白共有 个。其中，蛋白共同聚类在 组，有可能是较近发生的基因复制事件所造成；聚类在 组；蛋白聚类在 组。铁皮石斛 蛋白的二级结构对 蛋白质的二级结构进行分析，二级结构占比如表 所示，二级结构图如图 所示。结果表明，铁皮石斛 蛋白的二级结构包括 螺旋、伸展链、转角和无规卷曲，其中，铁皮石斛 蛋白的 螺旋占比为 ，伸展链占比为，转角占比为，无规卷曲占比为。铁皮石斛 家族蛋白结构分析对 个 蛋白进行多序列比对（图），结果 显 示 蛋 白 序 列 同 源 性 较 高。蛋白的保守基序分析结果表明 个 蛋白均有 保守结构域，而 还同时包含 ，则还包含（图）。同源的 与 含有 ，而 与其相比缺少 ，不仅缺少 ，还缺少 （图）。表明 个 的蛋白结构并不高度保守。铁皮石斛 基因结构及顺式作用元件分析 基因结构分析如图 所示，发现 个 均有 个编码区（由于 未注释，故未标识非编码区）。顺式作用元件分析发现 个广 西 植 物 卷图 蛋白跨膜结构预测 野蕉；铁皮石斛；拟南芥；蝴蝶兰；毛白杨；油棕；扇形文心兰；玉米；水稻；生姜。；图 种植物 蛋白进化关系 中 均 有 光 响 应 区 和 光 响 应 元 件，其 中 共同包含茉莉酸甲酯响应区，而防御应表 铁皮石斛 蛋白的二级结构占比 基因名称 螺旋（）伸展链（）转角（）无规卷曲（）急响应只在 中具备，除此之外 还含有生长素响应元件（图）。而 则可以对脱落酸作出响应，作为包含顺式作用元件最多的 蛋白，它还可以对赤霉素、水杨酸、生长素及低温作出响应。铁皮石斛 的表达分析 铁皮石斛 在根茎叶中的表达情况我们对 在根茎叶 个不同器官的相对表达水平进行了分析（图）。本研究发现，在根茎叶中均有表达，在叶中的相对表达量显著降低，而在茎中的表达 水 平 则 无 明 显 差 异，的 相 对 表 达 水 平 均 无 明 显 差 异，在茎和叶中的表达量相差无几，但略高于 期杨乐等：铁皮石斛 膜结合（）转录因子的全基因组鉴定及表达分析蓝色代表 螺旋，红色代表伸展链，绿色代表 转角，紫色代表无规卷曲。，图 预测的 蛋白二级结构 根，而 则在叶中的相对表达水平高于茎，且都低于根。铁皮石斛 在胁迫处理下的表达情况铁皮石斛多生长在悬崖峭壁，会受到多种非生物胁迫，转录因子也有被报道参与多种抗逆反应（王 楠 等，），故 本 研 究 进 一 步 分 析 了 在不同胁迫条件下的表达情况（图）。结果表明，在 低温、高温和 胁迫处理下的相对表达水平低于对照组，而在 胁迫处理下的相对表达水平无显著差异，但 胁迫处理下，表达量略有降低；在 低温和 高温胁迫处理下的相对表达水平与对照组相比显著降低，在脱落酸、胁迫处理下无明显差异；在、低温和 高温胁迫处理下的相对表达水平与对照组相比显著降低，在脱落酸和 胁迫处理下与对照组相比稍有差异；与 相似的是，在 低温和 高温胁迫处理下有显著变化，在脱落酸胁迫处理下也发生显著变化，但在 胁迫处理下并无明显差异。讨论与结论本研究从铁皮石斛基因组上鉴定出 个 蛋白序列，对 个 编码的蛋白进行生物信息学分析。结果表明，个 蛋白均为亲水蛋白质；的等电点均小于，则大于，这一点与大部分 蛋白家族成员的理论等电点大于 有出入（张晓红等，；刘闯等，；祁香宁等，）。基因家族蛋白含有 个高度保守的 结构域，它是 蛋白和 分子特异性结合所必需的。这与我们在保守结构域预测时的发现一致。李豆等（）将白桦 基因启动子驱动 基因在转基因拟南芥营养生长期的根尖及根的其他部位表达，发现在营养生长时期其在根广 西 植 物 卷图 蛋白的多重序列比对 部的表达也随植物的生长逐渐增加，与前人研究一致，故他推测 基因可能在植物的根发育过程中起作用。这与我们测得 在根中的相对表达水平略高一致，推测 可能参与根的发育。激素参与了植物生长发育的各个方面，已有多项研究表明 基因参与植物的激素响应过程。对白桦 基因启动子的顺式作用元件分析表明（李豆等，），其启动子区含有 种激素响应元件（生长素、赤霉素、水杨酸、脱落酸等）。这与我们得到的 顺式作用元件分析结果类似，并且与在脱落酸胁迫条件下 的相对表达水平发生显著变化一致。利用 研究发现拟南芥 对茉莉酸、水杨酸和生长素等激素响应过程有广泛影响。通过调节生长素的生物合成抑制根的再生（，）。赤霉素通过调节茎分生组织中的 基因促进开花（，）。在 启动子上也发现了多种激素响应元件，故推测 可能参与多种激素响应。大量研究表明 基因能够响应低温、高温等非生物胁迫的信号。如 等（）发现在 期杨乐等：铁皮石斛 膜结合（）转录因子的全基因组鉴定及表达分析图 蛋白保守基序预测 表示编码区，黑线表示内含子。图 基因结构 图 顺式作用元件分析 高 温 条 件 下，基 因 被 和 调控使其表达降低，进而延长植物对高温胁迫的耐受性。除高温条件外，葡萄对低温条件也 较 敏 感，在 低 温 条 件 下（），体 内 的 和 表达均被上调，而 和 表达明显被下调，表明 和 参与葡萄的低温胁迫反应（吴艳等，）。这与 在低温、高温胁迫条件下的相对表达量广 西 植 物 卷 为内参。表示，。，图 在根茎叶中的相对表达水平 ，发生显著变化一致。对白桦 转基因拟南芥进行了 和 胁迫实验，发现受到胁迫后，其表达量有下降（李豆等，），与我们观测到的在 胁迫条件下，的相对表达水平显著下调一致，推测 很可能参与植物的干旱胁迫响应。崔扬等（）发现玉米遭受干旱胁迫时，在根中的表达量显著上调，这与 结果一致，但与 不一致，具体原因有待进一步研究。本研究在铁皮石斛全基因组水平鉴定出 个，生物信息学分析显示他们均为亲水蛋白，大部分定位在细胞核，都具有高度保守的 结构域以及与激素响应有关的顺式作用元件。表达分析显示他们在根中的表达量略高于茎和叶，胁迫分析显示其在低温、高温及干旱胁迫下相对表达水平显著变化，且部分 可以对脱落酸作出响应。以上研究结果为进一步研究 转录因子的生物学功能奠定了基础。参考文献：，对照；含 的 液体培养基中培养 ；含 的脱落酸的 液体培养基中培养 ；含 的 液体培养基中培养 ；液体培养基中培养；液体培养基中培养 ；为内参。表示，表示，表示，。；，图 在胁迫处理 下的相对表达水平 ：，（）：，：，（）：，（）：崔扬，冯彦辉，陈众峰，等，玉米转录因子 的克隆与 功 能 鉴 定 分 子 植 物 育 种，（）：，期杨乐等：铁皮石斛 膜结合（）转录因子的全基因组鉴定及表达分析 ，（）：，（）：，（）：，：，（）：，（）：罗凯，李泽生，白燕冰，等，石斛兰多样性利用及保护现状 黑龙江农业科学，（）：，（）：雷凯健，任晶，朱园园，等，拟南芥 基因参与调节低磷条件下的根际酸化反应 植物学报，（）：，（）：，：李豆，苏功博，胡晓晴，等，白桦 基因启动子的克隆及表达分析 北京林业大学学报：，：刘 闯，个 白 桦 基因的鉴定及 基因的功能分析 哈尔滨：东北林业大学，：祁香宁，猕猴桃 转录因子基因的鉴定、进化及其表达分析 杨凌：西北农林科技大学，（），（）：，（）：，（）：唐文文，夏俊丽，陈垣，铁皮石斛茎、叶、花功能性成分、抗氧化活性及其相关性 食品与机械，（）：，（）：王楠，向凤宁，李朔，植物膜结合转录因子与胁迫响应 生命科学，（）：，（）：吴艳，侯智红，程群，等，转录因子的研究进展 大豆科学，（）：，（），（）：，（）：，（），（）：，（）：杨正婷，熊孟连，简燕，等，内质网应激中膜结合转录因子的活化机制研究进展 分子植物育种，（）：，（）：曾丹琦，张明泽，何春梅，等，铁皮石斛 转录因子的鉴定和分析 热带亚热带植物学报，（）：，：张晓红，陆地棉开花相关基因的功能研究及调控分析 杨凌：西北农林科技大学（责任编辑 周翠鸣）广 西 植 物 卷