微波辅助酶提取驱虫斑鸠菊中总黄酮_李霞.pdf

第 3 期第 53 卷工业微生物作者简介：李霞（1972.01），女，汉族，山东淄博人，本科，高级实验师，研究方向：中草药提取。E-mail：。微波辅助酶提取驱虫斑鸠菊中总黄酮李霞齐鲁医药学院，山东 淄博 255300摘要：文章采用微波辅助酶法提取驱虫斑鸠菊中的总黄酮，利用单因素实验和正交试验进行数据分析，以总黄酮提取率为评价指标，筛选提取总黄酮的最佳工艺。关键词：驱虫斑鸠菊；微波辅助酶法；总黄酮；正交试验doi：10.3969/j.issn.1001-6678.2023.03.041第 53 卷第 3 期2023 年 6 月工业微生物Industrial MicrobiologyVol.53 No.3Jun.2023驱虫斑鸠菊，为菊科一年生草本植物，味苦性寒，有清热消炎、活血化瘀、祛风、驱虫、消肿、散寒止痛等功效，多用于治疗湿寒性胃痛、肝病、白癜风等病症1,主要含有半萜及二聚体、黄酮、甾体等成分2。袁媛等3采用对比浸提法、微波提取法和超声提取法等方法，提取出了桃金娘果实中花青素和黄酮。根据提取出的黄酮含量得出，这几种方法提取黄酮的能力排序为：微波辅助提取法浸提法超声波辅助提取法。曹稳根等5采用响应面法优化纤维素酶，用优选工艺微波提取油菜蜂花粉中的总黄酮，对乙醇提取法、纤维素酶辅助提取法、微波辅助提取法、纤维素酶-微波辅助提取法 4 种工艺进行了对比，结果表明酶法提取技术快速、高效、反应条件温和且污染较小，有利于保持有效成分原有的药效4。采用纤维素酶-微波辅助提取法的工艺效果最佳。1实验部分1.1仪器UV-2550 岛津分光光度计：上海精宏实验设备有限公司；FA2204B 分析天平：上海精科天美科学仪器有限公司；XL-20B 密封型摇摆式粉碎机：广州市旭朗机械设备有限公司；WD800G 微波炉；格兰仕微波炉电器有限公司；SHB-III 循环水式多用真空泵：上海申生科技有限公司。1.2试剂驱虫斑鸠菊（产地：新疆。将驱虫斑鸠菊干燥、去杂、粉碎、过筛备用）。芦丁标准品：江西佰草源生物技术有限公司；乙醇、氢氧化钠：莱阳市康德化工有限公司；柠檬酸、磷酸氢二钠、氯化铝、亚硝酸钠：天津恒兴化学试剂有限公司。纤维素酶、果胶酶：上海华上翔洋生物科技有限公司。1.3提取工艺研究1.3.1对照品溶液的制备准确称取 10.40 mg 芦丁对照品置于 50 mL 容量瓶中，加 30%乙醇 40 mL，水浴加热使其溶解。放冷，加 30%乙醇至刻度线处，摇匀，制得浓度为0.208 mg/mL 的芦丁对照品溶液。1.3.2最大吸收波长的确定取配好的中间浓度对照品溶液，经 NaNO2-Al（NO3）3-NaOH 法显色，于 460 nm700 nm 进行扫描，确定最大吸收波长为 508 nm，并将 508 nm 作为测定波长。1.3.3标准曲线绘制分别量取 0.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00 mL的芦丁对照品溶液置于 25 mL 容量瓶中，各加水 6mL，加入 5%的 NaNO2溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min。加 10%的 Al（NO3）3溶液 1 mL，摇匀，放置 6 min，加4%的 NaOH 试液 10 mL，再加水至刻度线处，摇匀，静置 15 min，以相应试剂作为空白对照，采用紫外分光光度法进行测定。以芦丁浓度为横坐标，溶液吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，线性回归方程为 Y=11.49X+0.003 6，相关系数为 0.999 6。图 1 为芦丁标准曲线。166-第 3 期第 53 卷图 1芦丁标准曲线1.3.4供试品溶液的含量测定取供试品溶液 1.0 mL，置于 25 mL 容量瓶中，加水 6 mL，加 5%的 NaNO2溶液 1 mL，摇匀，放置 6min。加 10%的 Al（NO3）3溶液 1 mL，摇匀，放置 6min，加 4%的 NaOH 试液 10 mL，再加水至刻度线处，摇匀，静置 15 min，以相应试剂作空白对照，采用紫外分光光度法，测定供试品溶液的吸光度，将供试品溶液的吸光度代入标准曲线中计算含量。总黄酮提取率（%）=CKV/m100%106式中：C 为样品中黄酮浓度，ug/mL；K 为溶液稀释倍数；V 为提取液体积，mL；m 为样品质量，g。2结果与分析2.1提取方法将驱虫斑鸠菊果实捣碎，过 0.180 mm 孔径筛备用。取干燥粉末 2.0 g 置于 250 mL 锥形瓶中，根据料液比加入乙醇提取剂，加适量酶（纤维素酶/复合酶/果胶酶），使用 pH 为 4.2 的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液作为调节剂，调节溶液 pH 至 5.0。将溶液置于 50 的水浴锅中酶解 40 min，完成后，迅速升温水浴锅至 95，灭活 5 min，在一定微波条件下进行微波处理。处理后过滤取滤液，用紫外分光光度计测滤液吸光度，计算黄酮提取率，确定适宜条件。2.2单因素试验2.2.1酶的用量（纤维素酶/复合酶/果胶酶）精确称取 5 份 2.0 g 的驱虫斑鸠菊果实粉末，料液比为 130（g/mL），分别加入三种酶：纤维素酶、复合酶（纤维素酶果胶酶=11）和果胶酶，酶的质量分数分别为 3%、4%、5%、6%、7%，调节 pH为 5.0。50 水浴锅中酶解 40 min，待酶解完成后，迅速升温水浴锅至 95，灭活 5 min。微波火力30%处理 60 s。过滤，取滤液，测吸光度。结果显示，纤维素酶添加量为 3%、4%、5%、6%、7%时，提取率分别为 12.56%、2.54%、2.62%、2.78%、2.77%。随着纤维素酶用量的增加，总黄酮得率明显升高。继续增加酶量使驱虫斑鸠菊的总黄酮得率基本保持不变，说明到达一定酶量后继续增加酶的用量对黄酮提取率的影响较小，在正交试验中去除该因素。确定提取的最佳酶用量为 6%。2.2.2微波时间精确称取 5 份 2.0 g 的驱虫斑鸠菊果实粉末，料液比为 130（g/mL），酶用量为 6%,微波火力为30%，微波分别处理 20 s、40 s、60 s、80 s、100 s，过滤，取滤液，测吸光度。结果显示，提取率分别为2.22%、2.47%、2.67%、2.93%、2.52%。最佳的微波提取时间初步确定为 80 s。2.2.3微波火力精确称取 5 份质量为 2.0g 的驱虫斑鸠菊果实粉末，料液比 130（g/mL），酶的用量为 6%,分别在微波火力 10%、20%、30%、40%、50%的条件下，处理80 s，过滤，取滤液，测吸光度。结果显示对应的提取率分别为 2.27%、2.48%、3.10%、2.63%、2.47%。总黄酮的提取率，在微波火力为 10%30%时提高较为明显，当微波火力大于 30%时总黄酮提取率不升反降。故提取的最佳微波火力初步定为 30%。2.2.4乙醇体积分数准确称取 5 份 2.0g 的驱虫斑鸠菊果实粉末，乙醇体积分数为 50%、55%、60%、65%、70%，料液比1：30（g/mL），酶的用量 6%,微波火力 30%，微波处理80s，过滤，取滤液，测吸光度，提取率分别为 3.01%、3.05%、3.20%、3.56%、2.89%。在乙醇体积分数 65%时达到最大值，乙醇的最佳体积分数初步定为65%。2.2.5料液比准确称取 5 份 2.0g 的驱虫斑鸠菊果实粉末，乙醇体积分数 65%，料液比 120、125、130、135、140（g/mL），酶的用量 6%，微波火力 30%处理80 s，过滤，取滤液，测吸光度。提取率分别为 2.43%、2.89%、3.76%、2.67%、0.010.020.030.040.050.060.070.6710.5820.4790.3840.292Y=11.49X+0.003 6R2=0.999 60.80.70.60.50.40.30.20.10李霞：微波辅助酶提取驱虫斑鸠菊中总黄酮芦丁浓度/mg mL-1167-第 3 期第 53 卷工业微生物2.59%。料液比 130（g/mL）时，总黄酮的提取率最高。故将最佳料液比初步定为 130（g/mL）。2.3正交试验酶的用量对总黄酮提取率的影响较小，选择微波时间（60、80、100 s）、微波火力（20%、30%、40%）、乙醇体积分数（60%、65%、70%）、料液比（125、130、135（g/mL）等 4 个因素作为变量，进行 L9（34）正交试验。以驱虫斑鸠菊总黄酮的提取率为评价指标，确定最佳提取工艺结果见下表 1。表 1正交试验结果表在 A 因素中，K3K2K1，可知 A3水平最优；在 B因素中，K2K3K1，可得 B2水平最优；在 C 因素中，K3K1K2，可见 C3水平最优；在 D 因素中，K2K3K1，可知 D2水平最优。因此可得出最佳提取工艺为A3B2C3D2，即微波火力 40%，微波时间 80 s，乙醇体积分数 70%，料液比 130（g/mL）。通过比较极差 R 可得，以上四个因素对提取效果的影响大小依次为：微波火力乙醇体积分数微波时间料液比。2.4验证性实验为进一步验证正交试验结果，在最佳工艺条件下进行 3 次平行试验，由下表 2 显示，经过 3 次平行试验，总黄酮平均提取率为 4.06%，重现性较好。表 2最佳条件下黄酮的提取率3结论基于单因素试验结果，设计 L9（34）的正交试验来优化提取工艺，结果表明，对提取效果影响最大的是微波火力，其次是乙醇体积分数，对料液比的影响较小。从正交试验可得出最佳提取工艺为 A3B2C3D2，即料液比 130（g/mL），微波时间 80 s，乙醇体积分数 70%，微波火力 40%。在最佳条件下，平行试验三次，得到平均提取率为 4.06%。参考文献1 王加利.驱虫斑鸠菊化学成分及其药理活性评价研究D.北京:北京中医药大学,2018.2 刘宗洋,昝珂,吴霞,等.维药驱虫斑鸠菊化学成分、质量控制及其药理活性的研究进展 J.药物分析杂志,2020,40(2):199-208.3 袁媛,余修亮,陈宇欢,等.桃金娘花青素和黄酮的提取方法比较及其抗氧化能力研究 J.中国食品学报,2018,18(9):144-151.4 郭跃山.酶法在中药有效成分提取中的应用 J.首都食品与医药,2019,26(14):195-196.5 曹稳根,方琪琪,方思佩,等.响应面法优化纤维素酶-微波提取油菜蜂花粉总黄酮工艺 J.基因组学与应用生物学,2020,39(7):3190-3196.编号取样量吸光度黄酮提取率/%平均提取率/%11.000 80.4854.024.0621.000 50.4814.0731.000 60.4834.10编号A 微波火力/%B 微波时间/sC 乙醇体积分数/%D 料液比/（g mL-1）总黄酮提取率/%111113.46212223.50313333.65421233.52522313.93623123.98731323.88832133.94933213.72K13.5373.623.793.69K23.8103.793.583.79K33.8473.783.823.70R0.3100.170.240.10AbstractThe total flavonoids in Vernonia anthelmintica were extracted by microwave-assisted enzyme method.The data wereanalyzed by single factor experiment and orthogonal experiment,and the extraction rate of total flavonoids was used as the evaluationindex to select the best extraction process.Key wordsinsect-repellent turtledove chrysanthemum;microwave-assisted enzymatic method;flavonoids;orthogonal testStudy on Microwave Assisted Enzyme Extraction of Total Flavonoids From VernoniaAnthelminticaLI XiaQilu Medical College,Zibo 255300,China168-