猪肺炎支原体的分离方法.pdf

江苏农业学报(Jiangsu J of Agr Sci)，2012，28(1):104 107韦艳娜，白昀，孔猛，等 猪肺炎支原体的分离方法 J 江苏农业学报，2012，28(1):104-107猪肺炎支原体的分离方法韦艳娜1，白昀1，2，孔猛1，冯志新1，刘茂军1，熊祺琰1，白方方1，吴叙苏1，邵国青1(1 江苏省农业科学院兽医研究所，农业部兽用生物制品工程技术重点实验室，国家兽用生物制品工程技术研究中心，江苏南京 210014;2 南京天邦生物科技有限公司，江苏 南京 211102)收稿日期:2011-08-27基金项目:国家自然科学基金项目(31001080);江苏省农业自主创新基金项目CX(10)215、CX(11)2059作者简介:韦艳娜(1986-)，女，广西河池人，学士，实习研究员，主要从事动物重要传染病研究。(Tel)025-84390334;(E-mail)weiyanna05163 com通讯作者:邵 国 青，(Tel)025-84391973;(E-mail)84391973 163 com摘要:为了寻求分离猪肺炎支原体更好的方法，本试验采用剪碎法、研磨法、匀浆法和灌洗法对猪肺组织进行处理，并研究了不同肺脏组织处理方法对猪肺炎支原体活力的影响。结果显示，剪碎法与灌洗法获得的处理液对猪肺炎支原体的影响小于研磨法与匀浆法。采用剪碎法、灌洗法和研磨法对 100 份猪肺组织进行猪肺炎支原体野毒株分离的结果显示，经 PCR 鉴定，剪碎法分离到1 株猪肺炎支原体，分离率为1%;研磨法分离到7 株猪肺炎支原体，分离率为 7%;灌洗法分离到 2 株猪肺炎支原体，分离率为 2%。以上结果表明，研磨法获得的组织处理液对支原体活力有一定的影响，但其分离率好于剪碎法和灌洗法。因此，研磨法是一种较好的猪肺炎支原体分离方法。关键词:猪肺炎支原体;分离培养中图分类号:S858 28文献标识码:A文章编号:1000-4440(2012)01-0104-04Ways to isolate Mycoplasma hyopneumoniaeWEI Yan-na1，BAI Yun1，2，KONG Meng1，FENG Zhi-xin1，LIU Mao-jun1，XIONG Qi-yan1，BAIFang-fang1，WU Xu-su1，SHAO Guo-qing1(1 Institute of Veterinary Medicine，Jiangsu Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Veterinary Biological Engineering and Technology，Minis-try of Agriculture，National Center for Engineering Research of Veterinary Bio-products，Nanjing 210014，China;2 Nanjing Tech-Bank Bio-Industry CoLtd，Nanjing 211102，China)Abstract:Four methods(shearing directly by scissors，grinding by mortar，stirring by homogenate machine，andlavaging from bronchus)were designed to deal with swine lung tissue to study the effects of treating methods on the isolationof Mycoplasma hyopneumoniae The results showed that the methods of shearing and lavaging had less influence on the ac-tivity of Mycoplasma hyopneumoniae than the methods of grinding and stiring Three methods of shearing，lavaging andgrinding were used for the isolation experiment of 100 lung tissues samples One virulent strain was obtained by the methodof shearing，with the isolation rate of 1%Seven strains were obtained by the method of grinding，with the isolation rate of7%Two strains was obtained by the method of lavaging，with the isolation rate of 2%The results indicated that themethod of grinding for isolation and culture of Mycoplasma hyopneumoniae was better than the methods of lavaging andshearing The method of grinding offered a fairly good ref-erenceKey words:Mycoplasma hyopneumoniae;isolationand culture猪 支 原 体 肺 炎(Mycoplasma pneumoniae ofswine，MPS)又 称 猪 气 喘 病 或 猪 地 方 性 肺 炎(Enzootic pneumonia of swine，EPS)，是由猪肺炎支401原体(Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp)引起的一种猪慢性呼吸道传染病。该病在世界范围内广泛流行，中国地方猪种和杂交猪种尤为易感，给养猪业造成了重大损失。由于猪肺炎支原体对营养要求苛刻，使得其体外分离培养的难度很大，从而阻碍了后续病原学、血清学、免疫学、致病机制等研究的顺利推进1。因此猪肺炎支原体的分离培养技术对猪气喘病的研究尤为重要。目前国内常用的病肺块浸泡分离法的分离率较低，且杂菌污染的风险率较高。因此，本试验拟采用 3 种不同猪肺组织处理方法对猪肺炎支原体进行分离，试图找到分离率较高的分离方法，以期为猪肺炎支原体分离培养技术的改进与优化提供参考。1材料与方法1 1材料猪肺炎支原体，由江苏省农业科学院兽医研究所提供。新鲜猪肺组织采集于南京孝陵卫屠宰场。江苏二号(KM2)培养基由江苏省农业科学院兽医研究所提供。1 2方法12 1不同处理方法获得的猪肺组织处理液取外观健康正常，经 PCR 鉴定为猪肺炎支原体阴性的猪肺备用，方法参照文献 2。按以下 4 种方法处理。1 2 1 1剪碎法取 0.5 g 健康的猪肺组织，剪碎成芝麻大小后加入 5 ml 生理盐水(含青霉素和链霉素各 125 IU/ml)，混匀后，于3 000 r/min离心1 min，上清液用0.45 m 的滤器过滤，滤液即为猪肺组织处理液。1 2 1 2研磨法取 0.5 g 健康的猪肺组织在研钵里磨碎，加入 5 ml 生理盐水(含青霉素和链霉素各 125 IU/ml)，混匀后，于3 000 r/min离心 1 min，上清液用 0.45 m 的滤器过滤，滤液即为猪肺组织处理液。1 2 1 3匀浆法取 10 g 健康的猪肺组织剪成小块，加入100 ml 生理盐水(含青霉素和链霉素各125IU/ml)，在匀浆机中搅拌匀浆 1 min，匀浆液于3 000r/min离心 1 min，上清液用0.45 m 的滤器过滤，滤液即为猪肺组织处理液。1 2 1 4灌洗法取带支气管的健康的猪肺组织10 g，用注射器吸取 100 ml 生理盐水(含青霉素和链霉素各 125 IU/ml)打入细支气管中并抽吸3 5次，后吸出灌洗液，用 0.45 m 的滤器过滤，滤液即为猪肺组织处理液。1 2 2组织处理液对猪肺炎支原体活力影响的测定先将猪肺炎支原体培养物(109CCU/ml)用KM2 培养基稀释至 105CCU/ml，在此基础上作 2 倍比稀释 10 个滴度。在每个 2 倍稀释滴度中分别加入1 10(体积比)的 4 种方法处理后的组织处理液，对照组加入生理盐水(含青霉素和链霉素各125 IU/ml)，于 37 培养 10 d 后观察结果。并对生长好的培养均进行瑞氏染色，观察培养物中的菌体形态。12 3不同猪肺炎支原体分离方法的比较匀浆法需要较多的病料组织，且其对猪肺炎支原体培养滴度的影响较大，因此不用此法对猪肺炎支原体进行分离。取 100 份病猪肺脏样本，每份肺脏组织分别用剪碎法、研磨法和灌洗法进行处理和培养，比较各方法猪肺炎支原体分离率的差异。1 2 3 1剪碎法无菌采集病变和健康肺脏交界处组织1 2 g，剪成芝麻粒大小，直接放入 KM2 培养基，于 37 培养。1 2 3 2研磨法无菌采集病变和健康肺脏交界处组织1 2 g，剪成芝麻粒大小，按1 1(质量与体积比)加入 KM2 培养基，混合物置于高压灭菌后的研钵中充分研磨，将研磨后的组织混合液通过铜网过滤后，收集滤液，再用 0.45 m 的滤器过滤，滤液接种于 KM2 培养基，于 37 培养。1 2 3 3灌洗法剪取无菌采集病变和健康肺脏交界处暴露支气管的组织，用无菌注射器抽取 5 mlKM2 培养基直接打入支气管中，并从支气管中倒吸KM2 培养基，获得支气管灌洗液。灌洗液可直接用0.45 m 的滤器进行过滤，收集滤液，并将滤液接种于 KM2 培养基，于 37 培养。12 3 4鉴定培养物变色后，参照文献 3 的方法进行 PCR 鉴定。引物序列为:上游引物:5-TTCAAAGGAGCCTTCAAGCTTC-3，下游引物:5-AGAGGCATGATGATTTGACGTC-3。PCR 扩增体系为:10 Buffer 2.0 l，MgCl2(25 mmol/L)2.0 l，dNTP(2.5 mmol/L)2.0 l，引物(10 pmol/l)0.5l，模板 DNA 5.0 l，Taq 酶(5 U/l)0.2 l，加双蒸水至 20.0 l。反应条件为:95 预变 5 min;94变性 30 s，54 退火 45 s，72 延伸 90 s，30 个501韦艳娜等:猪肺炎支原体的分离方法循环;72 延伸10 min。取10 l PCR 扩增产物，用1%的琼脂糖凝胶在 120 V 电压下电泳鉴定，出现1 000 bp 条带的样品，判为阳性。2结 果2 14 种处理方法获得的组织处理液对猪肺炎支原体活力的影响用 105CCU/ml猪肺炎支原体培养物 2 倍比稀释 10 个滴度，加入经过 4 种方法处理的组织处理液，于 37 培养 10 d。结果显示，加入剪碎法或灌洗法处理后的处理液，猪肺炎支原体的生长滴度为210，而加入研磨法或匀浆法处理后的处理液，猪肺炎支原体的生长滴度为 26。由此表明，剪碎法及灌洗法处理的组织液比研磨法及匀浆法对猪肺炎支原体的影响要小。2 24 种方法处理后猪肺炎支原体的培养特性与形态观察将 4 种方法处理后的猪肺滤液分别进行培养后，培养物轻度浑浊，pH 值下降，培养物涂片，经瑞氏染色可观察到具有特征性的多形态菌体，主要有环状、球状和两极状(图 1)，未观察到杂菌，说明不同的处理方法对猪肺炎支原体无形态学的影响。图 14 种方法处理后的猪肺炎支原体培养物涂片Fig 1The morphology of Mycoplasma hyopneumoniae afterfour treatment methods for the pig lung filtrate2 3不同猪肺炎支原体分离培养方法的比较采用剪碎法、灌洗法和研磨法对 100 份猪肺组织进行猪肺炎支原体野毒株分离，经 PCR 鉴定(图2)，剪碎法分离到 1 株 PCR 鉴定为阳性的猪肺炎支原体，分离率为 1%;研磨法分离到 7 株，分离率为7%;灌洗法分离到 2 株，分离率为 2%(虽然同一个病肺组织均用 3 种方法进行处理，但分离到的 10 株猪肺炎支原体野毒株均是从不同的病肺组织中分离到的)。1:剪碎法分离的 1 株样品;2、3、4、5、6、7、8:研磨法分离的 7 株样品;9、10:灌洗法分离的 2 株样品;11:阳性对照;12:阴性对照;M:DL2000 marker。图 2猪肺炎支原体分离株的 PCR 鉴定Fig 2Identification of the new Mycoplasma hyopneumoniaestrains by PCR3讨 论猪肺炎支原体的分离工作程序复杂，进展缓慢，另外，猪肺炎支原体营养要求高且生长缓慢，因此很难获得大量的菌株。要成功分离到猪肺炎支原体，除了要有良好的培养基，分离方法也至关重要。Goodwin 等4 采用正常肺血浆块组织培养法和煮沸组织培养后再接种于无细胞培养基的方法分离到猪肺炎支原体;Etheridge 等5 将病猪肺组织的病变部分浸于培养液中过夜后制成悬浮液分离到猪肺炎支原体;至今国内外分离猪肺炎支原体大多采用病肺块浸泡法6-7。而病肺块浸泡法只是将剪碎的病肺块浸泡于培养基中培养，难免有其他杂菌的生长。本试验采用灌洗法、剪碎法、研磨法和匀浆法对猪肺脏组织进行处理，观察 4 种方法获得的组织处理液对猪肺炎支原体活力的影响。结果显示，剪碎法和灌洗法获得的组织处理液对猪肺炎支原体的影响小于研磨法和匀浆法。可能是因为经研磨或匀浆法处理后，细胞破裂释放的相关酶等物质对猪肺炎支原体的生长产生了一定的影响。在猪肺炎支原体分离试验中，采用剪碎法、灌洗法和研磨法 3 种方法分离猪肺炎支原体的结果发现，研磨法比剪碎法和灌洗法的分离率高。原因可能是剪碎法处理液对猪肺炎支原体生长的影响较小，但剪碎法处理的肺脏无法做到完全无菌，培养后易于杂菌生长，从而影响了猪肺炎支原体在培养基中的生长。灌洗法是利用冲刷原理将猪肺炎支原体从支气管纤毛上冲洗下来。猪肺炎支原体感染时能识别呼吸道黏膜纤毛细胞的特601江 苏 农 业 学 报2012 年 第 28 卷 第 1 期异性受体与其结合，这是引起猪支原体肺炎的先决条件8。灌洗法只能少量地将粘附在呼吸道纤毛上的猪肺炎支原体冲洗下来，在分离培养过程中猪肺炎支原体存活不是很好。而研磨处理法，其处理液虽然对猪肺炎支原体生长的影响较灌洗法和剪碎法高，但也因为研磨使粘附在呼吸道纤毛上的猪肺炎支原体更多地暴露于培养基中，从而加大了分离率。因此，研磨法不失为一种较好的猪肺炎支原体的分离方法。参考文献:1毕丁仁，王桂枝 动物霉形体及研究方法 M 北京:中国农业出版社，1998:53-61 2刘茂军，张映，邵国青，等 猪支原体肺炎可疑肺组织 PCR 检测方法的建立J 山西农业大学学报:自然科学版，2009，29(5):444-447 3STAKENBORG T，VICCA J，BUTAYE P，et al A multiplex PCRto identify porcine Mycoplasmas present in broth culturesJ Vet-erinary Research Communications，2006，30:239-247 4GOODWIN R F，POMEROY A P，WHITTLESTONE P Charac-terization of Mycoplasma suipneumonia:a mycoplasma causing en-zootic pneumonia of pigsJ The Jourral of Hygiene，1967，65:85-96 5ETHERIDGE J R，COTTEW G S，LIOYD L C Isolation of Myco-plasme hyopneumoniae from lesious in experimentally infected pigs J Australian Veterinary Journal，1979，55:356-359 6刘茂军，邵国青，周勇岐，等 一株猪肺炎支原体强毒株的分离和鉴定 J 江苏农业学报，2009，25(2):308-310 7MAROIS J，CARROU J L，KOBISCH M，et al Isolation of Myco-plasma hyopneumoniae from different sampling sites in 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