实验室透析常见问题解答.pdf

Spectrum Laboratories Inc.China Mail Suite 1509 No.58 Changliu Rd.Shanghai,China Tel[phone] Fax[phone] Email Technical Support 400 628 4448 实验室透析实验室透析常见问题解答常见问题解答 Q1：如何准备透析膜管？透析膜管的准备因膜管材质和生产工艺的差别而有所不同。注意，我们不推荐煮沸处理，因其可能损坏膜管并改变膜孔径。A)生物技术级 RC、CE 及 PVDF 膜可以用 DI 水冲洗 15-30 分钟，去除防腐剂叠氮化钠。B)Spectra/PorR 7 标准级 RC 膜已经预处理，去除了重金属和硫化物，只需在去离子水中浸泡 15-30 分钟，去除叠氮化钠即可。C)Spectra/PorR 1-6 标准级 RC 膜，一般情况下，在水中漂洗足以去除甘油或防腐剂，而对于亲和研究之类极其敏感的透析应用或者重金属及硫化物会影响透析样品下游分析的应用，可能需要一些额外的处理以去除在生产过程中引入的痕量水平重金属及硫化物，仕必纯提供两种膜预处理溶液：重金属漂洗液及硫化物清除液，具体产品信息请参考“膜透析配件”网页说明。Q2：透析的原理是什么？一般需要多长时间才能完成？透析是指溶质在浓度梯度的驱使下，选择性扩散通过半透膜从而达到大/小分子分离，膜两侧浓度平衡，即小颗粒的溶质通过膜，而大分子物质不能通过，被截留在膜另一边。如果将样品置于透析膜管内，通过置换膜管外部的透析缓冲液，可将小颗粒物质清除，从而达到纯化大分子物质的目的。一般来说，一天之内置换 3-5 次缓冲液，然后在室温条件下，放在搅拌台上隔夜透析，即可达到高效的透析结果。标准的透析操作一般需要 16-24 小时。许多因素会影响透析效率，包括：扩散系数、pH 值、温度、时间、物质浓度、样品体积、透析缓冲液体积、透析缓冲液的置换次数、膜表面积、膜厚度、分子带电荷及缓冲液搅拌速率。Q3：透析一个样品需要多少体积的透析缓冲液？缓冲液置换频率怎么安排？透析缓冲液的体积越大，小分子扩散的驱动力越大。我们一般推荐缓冲液和样品的体积比为100:1。当扩散速率降低，膜两侧溶液趋于平衡时，通过置换缓冲液，可维持小分子扩散驱动力和透析速率。我们一般推荐在 12-24 小时内，置换缓冲液 2 到 3 次，具体安排如下：第一次缓冲液置换：透析开始后 2-3 小时 第二次缓冲液置换：透析开始后 4-5 小时 最后一次缓冲液置换：透析隔夜之前 Q4：如何选择正确的截留分子量（MWCO）？截留分子量应该竟可能的大，以使透析速率最大化。但是，为了获得最大的样品回收率，选择的截留分子量应至少为需纯化的大分子物质分子量的一半。对于需对几种分子进行分离的应用，分子之间的分子量差至少为 5 倍，才能完成有效的膜透析。若不能满足分子量差的要求，可能需要使用其它的分离技术，如色谱方法或切向流过滤。Q5：那种膜的蛋白质结合率最低？每种膜对不同的分子具有不同的亲和性。对于球状蛋白，相对的结合亲和性由低到高为 CE RCPVDF。Q6：怎样为膜管选择合适大小的膜夹？标准 RC 膜(Spectra/Por 1-7)和生物技术级 RC 膜由柔韧的再生纤维素聚合物制造，可使用任何一种透析膜夹密封。生物技术级 CE&PVDF 膜由相对刚性的聚合物制造，需要使用相对温和的通用膜夹。鉴于通用膜夹对于所有类型的膜管都能起到很好的密封作用，如不确定选择哪种膜夹合适，使用通用膜夹即可。标准膜夹一般只用于标准级 RC 膜管。膜夹的密封宽度一般需比膜管的扁平宽度长 4-10 mm。通用膜夹的最小密封宽度为 50 mm。对于所有扁平宽度规格的仕必纯生物技术级膜管，均有相应的膜夹可供选择。Q7：透析膜的保存时间为多长？干包装的透析膜可保存 5 年。湿包装的透析膜（0.1%的叠氮化钠溶液）保存期限为 3 年。辐照灭菌的透析膜可保存 1.5 年。Q8：透析膜变干或冻存之后是否仍可使用？湿润的透析膜变干之后，孔径受到不可逆的影响，膜变得脆弱易碎，容易泄露，不推荐继续使用。透析膜冻存之后，冰晶会使膜破裂，导致泄露，此时不推荐使用该膜。Q9：透析膜完全不含内毒素吗？仕必纯确认所有透析膜不含有内毒素，符合普通实验室使用规格要求。Q10：我需要担心透析膜上的皱纹、滚痕或折线吗？只要膜是完整的，滚痕或者折线不会影响膜的扩散特性。Q11：CE 膜比 RC 膜更具刚性，且不透明吗？纤维素酯（CE）膜内的聚合物交联形成相对刚性的晶格，而再生纤维素（RC）聚合物形成更加柔韧的网格结构。不透明性是由网格中孔眼的大小所决定的，孔眼越大，膜越不透明。Q12：透析膜可以化学密封或热密封吗？CE 和 RC 透析膜只能机械密封，但 PVDF 透析膜可以机械密封或热密封，通常用于样品“封装”目的。Q13：处理相同的蛋白样品，Spectra/PorR 透析膜可重复使用吗？我们不推荐重复使用透析膜，因为特定的处理操作可能会对膜造成污染，一定的透析条件（pH 值、温度、化学接触等）也会对膜的完整性造成损害，和/或导致泄漏，特别是在打开和重新夹上膜夹时。Q14：膜孔径有多精确，什么是 MWCO？透析膜微观下呈海绵状结构，因此，更适合通过评定其截留性能来间接地定义“孔径”，亦即“截留分子量”（Molecular Weight Cut Off，MWCO）。MWCO 定义为在 17 个小时内，膜截留率为 90%的溶质分子量。基于此定义，选择透析膜时，MWCO 应小于需要截留的分子的大小。Q15：透析膜 Spectra/PorR 2 和 4 有什么区别？Spectra/PorR 2 和 4 都有 12-14 kD 的截留分子量。Spectra/PorR 透析膜更适合温和透析，Spectra/PorR 2 可提供特定的更大和更小的扁平宽度，和/或渗透性；也就是说，Spectra/PorR 2 的水渗透性比 Spectra/PorR 4 更优越。Q16：关于膜表面积和样品量之间的关系有没有经验法则？表面积与体积的比值取决于膜管扁平宽度。如果有两段相同长度的膜管，扁平宽度较小的膜管具有较高的比表面积，而扁平宽度较大的膜管比表面积相对较小，也就是说，前者的透析速率更快。原因是扁平宽度较小的膜管，溶质的扩散距离较短，溶质之间通过膜孔的竞争也较小。而扁平宽度大，亦即溶质到达膜表面的距离也较长，溶质之间对膜孔的竞争也较大。一般而言，比表面积越大，透析越快。Q17：如果膜两侧的摩尔渗透压浓度相等，但浓度梯度仍然存在，物质的通过效率如何？大多数透析结束时膜两侧渗透压相同。透析过程是由膜管内外两侧的浓度梯度驱动的。如果渗透压力有很大的差别，水会通过膜以平衡膜两侧的渗透压。如果过多的水通过膜，透析膜管可能会随水运动的方向增大或缩小，在体积增加到一定程度时，有可能导致膜夹松动或膜管破裂。Q18：进行超滤时，透析膜能承受多大的压力？透析膜设计不适合用于压力过滤。在不影响截留分子量的前提下，最大推荐压力为 1.5 psi。Q19：一般推荐使用哪种透析液（缓冲液）？生物分子必须保存在严格的 pH 值控制条件下，以稳定其分子极性典型的透析缓冲液 pH范围为 6-8。以下为常用的几种可以作为缓冲液的生化溶液：水 PBS TBS HEPES 氨基酸缓冲液 Q20：为什么使用微米 vs 道尔顿（MW）单位，怎么转换？溶解的分子大小以分子量来定义，单位为道尔顿，而颗粒和细胞大小常以直径来定义，由于分子的结构和形态不同，相同分子量的物质，分子大小和形态可能相差较大，两者之间没有精确的对应关系。出于这个原因，许多常见的生物材料都已特别定性，并将大约的尺寸标注在转换表上作为估算的参考，以用于透析、超滤和微滤应用。道尔顿与微米单位之间的转化，请参考仕必纯官网“孔径表”。Q21：对于盐浓度较高的样品，最佳的透析方法是什么？如果可能，我们推荐使用低盐浓度的缓冲液。不推荐直接使用纯 DI 水作为缓冲液，因为渗透压力可能将水引入膜管，使样品体积膨胀并可能导致膜管破裂。使用一系列浓度逐渐降低的溶液作为缓冲液可防止渗透压力导致的膜管膨胀。每次缓冲液置换，可将溶质浓度降低十分之一，也就是说，透析一个 5M NaCl 的样品，可使用 500 mM NaCl 的缓冲液。Q22：可以使用绳子结扎膜管，而不使用膜夹吗？我们不推荐使用绳子结扎膜管。因为绳结对膜管的损害具有很大的不确定性，并且可能不能提供有效的密封，而导致泄露。只有膜夹才能提供足够的密封性，从而保护样品。Q23：透析膜管应该剪多长？对于每种膜管扁平宽度，仕必纯提供相关的容积/长度比，可方便计算透析样品所需的膜管长度。如果扁平宽度为 16 mm，容积/长度比为 0.79 ml/cm，要容纳 5 ml 的样品，则需要大约 6.5 cm 长的膜管。但是，为保持样品漂浮，一般需要在顶部空间预留 10-20%膜长（约为1 cm）。此外，也需在两端为膜夹各预留 2 cm。所以总的膜管长度应至少为 11.5 cm。可根据以下公式计算膜管长度：总长度=（样品体积）/（容积/长度）+（额外的 10-20%）+4 cm 浏览网页，使用仕必纯透析膜管计算器，根据样品体积和扁平宽度，计算所需的膜管长度。