毛细管电泳涂层柱技术的进展.pdf

文献综述毛细管电泳涂层柱技术的进展康经武?陆豪杰?欧庆瑜?中国科学院兰州化学物理研究所?兰州?提?要?毛细管电泳涂层柱是解决蛋白质在毛细管壁吸附的最有效的方法较为系统地综述了毛细管电泳涂层柱的几种制作方法?指出了毛细管电泳涂层柱?包括毛细管电色谱柱?的发展趋势?引用文献?篇关键词?毛细管电泳?涂层柱?蛋白质?吸附分类号?前言?年代以后?毛细管电泳?分离技术得到了迅速发展?并日益受到重视根据?等?的理论?蛋白质等生物大分子由于具有很小的分子扩散系数?因此在?体系中分离时就可能达到上百万的理论塔板数然而?由于毛细管内壁对蛋白质的吸附作用?实际的分离柱效很难达到理论预测的那样高?对于碱性蛋白质更糟?常使谱带拖尾?分离度变差?吸附严重时甚至测不出信号为了克服毛细管壁对蛋白质的吸附作用?人们采用各种方法?采用极端?值?或?的缓冲溶液?采用无机和有机添加剂的方法?缓冲液中含有高浓度的中性盐?或有机添加剂如二胺类?两性电解质?等都能有效地抑制蛋白质的吸附?对毛细管内壁进行改性?这主要是指采用物理涂敷或化学键合以及交联等方法?在毛细管壁形成单分子层或交联的涂层通过涂层来阻止蛋白质与毛细管壁的相互作用?以达到减小蛋白质吸附的目的由于涂层改变了毛细管壁的状态?因而也会引起电渗流的变化电中性的涂层会抑制电渗流?若是带正电的高分子涂层则会使电渗流减小甚至反转比较而言?第三种方法最有效一些重要的?分离模式?如毛细管等电聚焦和区带电泳?用于分离蛋白质时?以及最近发展起来的无胶筛分在分离分析核酸时?对毛细管柱涂层都有很强的依赖性近年来?随着毛细管电泳涂层柱技术的不断成熟和发展?一些商品化的?涂层柱开始被越来越多的用户所接受本文对?涂层柱技术的发展进行了系统的综述?并对其发展前景进行了预测?毛细管电泳涂层柱制备的几种方法?单分子层化学键合型毛细管电泳柱在?发展初期?在毛细管壁表面键合一层二醇基的硅烷化试剂用以抑制毛细管壁对蛋白质的吸附作用?效果并不理想?等?将麦芽糖键合于毛细管壁?在?之间能有效地抑制毛细管壁对蛋白质的吸附?但使用寿命很短他们将?缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅氧烷二醇基键合于毛细管壁?缩水甘油基经水解后?形成二醇基型的单分子涂层?分离效果比前者要差?将五氟苯甲酰基通过?键合于毛细管壁?在?的?的?缓冲液条件下?对?种酸性和碱性蛋白质进行了分离?对溶菌酶的分离柱效为?塔板数?但是作者采用的缓冲溶液浓度很高?和?先用十八烷基三氯硅烷对毛细管壁进行处理?然后用?等非离子表面活性剂在形成的?涂层上涂敷一层亲水性的顶层?以阻止蛋白质与毛细管壁和?涂层的相互作用由于在运行过程中表面活性剂会逐渐流失?因此需要在缓冲溶液中加入?的?该柱在?之间运行时?电渗流随溶液?值的变化比较平缓?在?时?溶菌酶的分离柱效可达?塔板数?各种酸?碱性蛋白质的回收率大于?等?以?缩水甘油醚基丙基三甲氧基硅氧烷作为双官能团试剂将第?卷第?期色?谱?年?月?本文系国家自然科学基金和中科院兰州化学物理研究所所长择优基金资助项目?通讯联系人?本文收稿日期?修回日期?键合于毛细管壁?起到了一定的抑制毛细管壁对蛋白质的吸附作用?但是效果并不理想?等?用上述方法重复键合?次?分离碱性蛋白质的效果要好得多?说明对毛细管柱进行多次涂敷可以与毛细管壁上的硅羟基充分键合?这样就有效地覆盖了毛细管壁上的活性吸附点在?的?磷酸盐缓冲液的条件下?对?种碱性蛋白质进行了有效的分离?平均分离柱效可达到?塔板数?柱寿命超过了?等?以双?羟乙基?胺基丙基三乙氧基硅烷作为硅烷化试剂处理毛细管壁?然后与聚乙二醇?反应?在毛细管表面形成一层聚乙醇?单分子涂层?再用碘甲烷与仲胺基反应使其转化为季铵离子?最后用三甲氧基硅烷将毛细管壁上剩余的硅羟基反应掉这种涂层的特点在于当溶液的?值低于?时电渗流会发生反转?物理吸附涂层?等?在毛细管内壁涂敷一层聚乙烯亚胺?该涂层通过亚胺离子所带的正电荷与毛细管壁上的负电荷相互作用使涂层吸附在毛细管壁上然后将三乙胺和双缩水甘油醚基乙二醇的混合溶液注入毛细管中与涂层进行交联反应经这样处理的涂层在一定的酸度范围内带正电?因此在?的酸度范围内电渗流随溶液?值的增大而减小?甚至出现电渗流的反转在?的?磷酸盐缓冲溶液条件下?依靠反转的电渗流对?种酸性和碱性蛋白质进行了同时分离?他们对分离柱效和柱的重现性未作报道另一种这一类涂层方法是由?等?报道的?他们将预先涂敷于毛细管壁上的谷胺酸甲酯?羧酸酐通过热交联方法使其在毛细管壁上形成一层谷胺酸甲酯的交联聚合物涂层?但是未能取得好的结果?等?采用动态涂柱法在毛细管壁涂敷一层聚乙烯醇?然后加热使其固化在毛细管壁上?由于经热处理的聚乙烯醇发生晶形变化后难溶于水?所以该涂层柱在?的范围内都能保持稳定?并且使电渗流降至很低在?时?对?种碱性蛋白质进行了分离?分离柱效为?塔板数?而且该制柱方法简单?容易操作最近?等?用?聚氧乙烯溶液作涂柱液?用动态法将聚氧乙烯涂敷在毛细管壁上?聚氧乙烯分子与毛细管壁上的硅羟基通过氢键相互作用吸附于毛细管壁上?能较好地抑制蛋白质吸附和电渗流?等?发现将高分子量的聚乙烯亚胺涂在毛细管壁上?不经过固载化处理?在?范围内也能保持较好的稳定性?并且起到了很好的抑制蛋白质吸附的作用选用?的缓冲液?分离柱效为?理论塔板数?化学键合的高分子交联涂层?通过双官能团试剂在毛细管壁上键合一层线性的聚丙烯涂层?起到了很好的抑制电渗流和毛细管壁对溶质吸附的作用?等?用这种涂层柱成功地在毛细管中实现了等电聚焦分离方法之后?许多?工作者大都采用这一方法进行毛细管壁的修饰为了提高涂层在碱性溶液中的抗水解能力?等?用格氏试剂?代替?所用的双官能团试剂对毛细管内壁的?进行处理?生成的?键比?具有更好的抗水解能力经这样预处理的毛细管柱再键合上线性的聚丙烯酰胺?可以在?的酸度范围内使用但是该方法对操作条件要求比较苛刻?而且在进行柱的预处理时容易堵柱?等?采 用 长 碳 链 的 硅 烷 化 试 剂?对毛细管壁进行预处理?然后再键合上线性或交联的聚丙烯酰胺用这种方法制备的毛细管涂层柱在?的酸度范围内均保持稳定在?条件下?对碱性蛋白质的分离柱效高达?塔板数?在?的碱性条件下对酸性蛋白质的分离柱效也达到了?塔板数?该涂层具有很好的柱稳定性和迁移时间重现性?等?将各种亲水性的凝胶通过双官能团键合在毛细管壁上?这种涂层的特点既可抑制毛细管壁对蛋白质的吸附?又可以保持较大的电渗流对碱性蛋白质分离柱效最高可达?塔板数?对酸性蛋白质的分离柱效可达?塔板数?等?报道了一种快速而简便的制柱方法他们将各种中等极性的气相色谱固定相?如?等?分别与六甲基二硅胺烷以及引发剂制成混合溶液涂在毛细管壁上?通过热处理使涂层的交联和键合同时发生该柱用于分离碱性蛋白质时分离柱效最高可达?塔板数?我们也建立了一次性制备交联键合型聚丙烯酰胺涂层柱的方法?分离碱性蛋白质的平均柱效可达?塔板数?等?采用了一种新的思路对毛细管电泳柱的表面进行预处理?使涂层的抗水解能力得到很大的提高他们采用的硅烷化试剂是含?的乙烯基和?甲基的端羟基聚硅氧烷?用静态法涂敷在毛细管中在室温下交联并键合于毛细管壁?期?康经武等?毛细管电泳涂层柱技术的进展?然后将丙烯酰胺和引发剂混合溶液注入毛细管中?在疏水的硅氧烷亚涂层上键合一层亲水的线性聚丙烯酰胺涂层?实验表明经甲醛交联的聚丙烯酰胺涂层不仅在分离柱效上比线性的涂层高?而且稳定性也要好得多他们使用这种涂层柱在?的缓冲液中对碱性蛋白质的分离柱效高达?塔板数?次重复进样的相对标准偏差小于?使用?值的范围为?该柱的电渗流可以降低至未涂层柱的?以下?在?的?硼酸盐缓冲液的条件下运行?后?仍能保持低于未涂层柱?的电渗流将该种类型的涂层柱用于无胶筛分和等电聚焦?等分离模式得到了很好的效果我们?将聚乙二醇?两端的羟基改性为烯丙基?通过动态法涂敷在由含乙烯基的硅烷化试剂预处理过的毛细管中?乙二醇?通过两端的烯丙基可以在较低的温度下与键合在毛细管壁上的乙烯基键合?并且高分子之间也能发生相互键合这种涂层柱在?的范围内能有效地抑制电渗流?在?的?缓冲液?时对?种碱性蛋白质进行分离?平均柱效可达?塔板数?实验表明该种涂层和制柱方法都具有很好的稳定性和重现性?等?报道了环氧树脂涂层柱的制备方法预先键合在毛细管壁上的硅烷化试剂所带的胺基与环氧化合物在毛细管中发生聚合反应?在毛细管壁上形成一层键合的交联环氧树脂涂层该柱在?的范围内保持稳定在?的分离条件下对碱性蛋白质仍表现了良好的分离?说明该涂层能有效地覆盖毛细管壁的活性吸附点?等?采用乙烯基吡咯烷酮和乙烯基吡啶共聚的方法在毛细管壁上键合一层带正电荷的涂层?起到了较好地抑制吸附和电渗流的作用最近?等?对以前的工作?做了改进?他们先在毛细管壁上涂一层环氧树脂?然后涂一层?以?作引发剂?在气相色谱炉内加热交联该涂层在?的范围内保持稳定?毛细管涂层柱的其它用途在毛细管壁上涂敷一层具有一定功能的涂层?使涂层如同色谱固定相一样参与分离?这种分离方式被称为毛细管电色谱法?等?将键合有全甲基化?的二甲基聚硅氧烷涂渍于毛细管壁上?以?形式对?种酸性药物对映体和电中性手性化合物?苯乙醇进行了分离?等人?也进行了?环糊精手性柱的研究?并对?进 行 了 成 功 的 分 离?等?利用?对环糊精羟基上氧的氧化作用将其接枝在线性聚丙烯酰胺涂层上?用于手性分离最近?等?用带胺基或羧基的硅烷化试剂在毛细管壁上键合一层涂层用于分离过渡金属离子此外?在用蛋白质作手性分离添加剂时?吸附在毛细管壁上的蛋白质会引起峰拖尾和分离重现性变坏?采用涂层柱?可降低蛋白质在毛细管壁上的吸附?从而使峰形和分离重现性得到明显的改善?是近年来发展起来的一种?分离模式?尽管具有许多优点?但是它的应用并不多?主要原因是制柱困难?等?采用原位聚合的方法在毛细管壁上形成连续床的聚合物固定相?制柱较为简单?并且可以得到好的分离效果这种制柱方法将会成为一种有代表性的电色谱柱技术?结束语一种理想的涂层应该是?在较宽的酸度范围内能长时间保持稳定?与被分离的物质不发生化学反应?具有一定的亲水性并能够有效地抑制蛋白质的吸附?能够保持一定的电渗流?以便于同时分离酸碱性蛋白质?或者将电渗流完全抑制以用于等电聚焦和无胶筛分等分离模式?制柱方法简单?容易操作?而且制柱重现性要好从上述几种制柱方法中可以看出?交联键合型涂层要好于单分子涂层?而且涂层的抗水解能力越强?涂层的稳定性也就越高由于石英毛细管柱表面的硅羟基较少?所键合的硅烷化试剂的数量有限?因此毛细管表面键合上去的单分子涂层也就不足以覆盖毛细管壁?而涂层的稳定性也将受到影响借助于气相色谱毛细管柱的制备方法?如?等?所采用的方法?采用疏水性好的聚硅氧烷作底层以避免缓冲溶液接触?键?然后用交联的亲水性好的高分子材料作顶层?这样的涂层既具有好的抗水解能力?又具有亲水性的涂层表面这种方法应该是毛细管电泳涂层柱的发展方向之一此外高分子聚合物直接涂在未经预处理的毛细管壁上?再经热交联形成涂层?这类方法简单?有效?快速?也是一个发展方向参考文献?色?谱?卷?李?浪?色谱通讯?毛细管电泳专集?康经武?欧庆瑜?毛细管电泳进展?第二卷?广州?华南理工大学出版社?康经武?欧庆瑜?分析化学?期?康经武等?毛细管电泳涂层柱技术的进展?