湘派卤制品卤汁中黄曲霉毒素...的筛选鉴定及其产毒能力测定_林丽丹.pdf

食品与发酵工业 （）：引用格式：林丽丹，赵良忠，黄展锐，等 湘派卤制品卤汁中黄曲霉毒素产毒菌的筛选鉴定及其产毒能力测定 食品与发酵工业，（）：，（）：湘派卤制品卤汁中黄曲霉毒素产毒菌的筛选鉴定及其产毒能力测定林丽丹，赵良忠，黄展锐，周晓洁，艾道迎，周衡平，周劲松，郑奕柔，周凯（邵阳学院 食品与化学工程学院，豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室，湖南 邵阳，）（平江县劲仔食品有限公司，湖南 岳阳，）（深圳市通量检测科技有限公司，广东省高特异性生物快速检测工程技术研究中心，广东 深圳，）摘 要 以湘派卤制品卤汁为研究对象，对其贮存过程中产黄曲霉毒素的微生物（产毒菌）进行筛选鉴定并对产毒能力进行测定。采用平板稀释涂布法和紫外荧光法对湘派卤汁进行产毒菌的初筛；对初筛菌株的 序列进行 扩增、测序，测序结果经 同源性对比、软件构建系统发育树进行分子生物学鉴定；应用 检测各产毒菌培养液中黄曲霉毒素（，）含量，确定各产毒菌的产毒能力。经平板稀释涂布法、紫外荧光法和分子生物学共筛选鉴定出 株产毒菌株，其中有 株是黄曲霉（），株为寄生曲霉（）；经 法确定 株黄曲霉均不产生，寄生曲霉产生黄曲霉毒素（）和黄曲霉毒素（）。在第 天和第 天的含量分别为 、，在第 天和第 天的含量分别为 、；湘派卤汁由于贮存条件不当，易受霉变原辅料及环境的影响，存在产 的曲霉菌，警示湘派卤制品卤汁中存在 污染的安全风险问题。关键词 卤汁；产毒菌；产毒能力；黄曲霉毒素；黄曲霉；寄生曲霉第一作者：硕士研究生（赵良忠教授和黄展锐讲师为共同通信作者，：；）基金项目：邵阳学院研究生科研创新项目（）；湖南省自然科学基金青年科学基金项目（）；湖南省教育厅科学研究优秀青年项目（）；湖南省科技创新计划资助目（；）收稿日期：，改回日期：湘派卤制品起源于卤菜之都 湖南邵阳，是我国的传统休闲美食。年，我国休闲卤制品市场规模已达 亿元，其中湘派卤制品因独特的风味和丰富的营养物质而颇受消费者喜爱。湘派卤制品是将原料放入事先熬制的卤汁（猪大骨、香辛料、菜籽油、调味料等）中多次卤制而成，所用卤汁的好坏直接决定卤制品的风味和品质。近年来，伴随着湘派卤制品市场规模持续快速增长，缺乏安全管理的作坊式加工、采用廉价原材料、卤汁粗放保存及反复循环使用等现象已成为卤制品生产的趋势，而原材料不合格和加工工艺不规范易引起卤制品品质劣化，进而导致严重的经济损失。卤汁中潜在危害因子较多，一方面是原料带入的，另一方面是循环使用发生复杂化学反应产生的，主要分为化学性（美拉德反应产物、亚硝酸盐、重金属、过氧化值等）和生物性（微生物污染及其毒素残留）危害因子。近年来，卤汁微生物污染引起国内外学者的广泛关注。但关于卤汁中生物安全性危害因子的识别和监测，研究人员仅关注腐败菌和致病菌含量变化，或粗略地以样品中的菌落总数进行品质评价，忽略了真菌及其毒素污染的监控。此外，由于湖南邵阳地域属亚热带季风性湿润气候，温暖潮湿的气候适宜真菌生长繁殖，因此极易引起卤汁霉变和真菌毒素污染，已成为制约休闲卤制品产业发展的瓶颈。黄曲霉毒素（，）是一类主要由曲霉属真菌产生的有毒次生代谢物，是已知毒性最大的霉菌毒素。包括、等多种亚型，其中 是迄今发现毒性最强的真菌毒素。性质十分稳定，在加工过程中难以破坏，暴露剂量为 时即可诱发强致病、致癌、致畸等毒性作用，已被国际癌症研究机构划定为类致癌物。因此，研究湘派卤制品卤汁中 产毒菌的筛选鉴定及其产毒能力测定对湘派卤制品质量安全控制具有重要意义。本研究对湘派卤制品卤汁在贮存过程中产 的微生物进行筛选鉴定及其产毒能力测定。采用平板稀释涂布法和紫外荧光法对湘派卤汁进行产毒菌研究报告 年第 卷第 期（总第 期）的初筛，并应用 检测各产毒菌培养液中 含量，确定各产毒菌的产毒能力。该研究将为揭示湘派卤汁贮存过程中 消除机制奠定基础，并为卤制品加工产业的健康发展提供参考依据。材料与方法 实验材料 样品采集卤汁由豆制品加工与安全控制湖南省重点实验室提供。仪器与设备高压蒸汽灭菌锅，宁波甬安医疗器械制造有限公司；恒温培养箱，上海三腾仪器有限公司；双人单面净化工作台，江苏通净净化设备有限公司；梯度 仪，杭州柏恒科技有限公司。试剂 培养基，上海博微生物科技有限公司；甲基化 环糊精，天津市大茂化学试剂厂；对照品（、），深圳市通量检测科技有限公司；甲醇，盐城纳科医药有限公司。实验方法 产毒菌筛选在无菌室内将收集的样品吸取 于装有 无菌生理盐水的三角瓶内，用涡旋振荡器将样品混匀，得到 匀浆液，从 的匀浆液中吸取 加入到 支装有 无菌生理盐水的试管中，依次进行 倍稀释，得到 个梯度的稀释液，分别吸取 稀释液注入含有 的平皿中，用涂布棒涂布均匀，于 培养箱中倒置培养。每个稀释梯度设置 个平行。将疑似霉菌的菌落挑取出来在含有甲基化 环糊精的 培养基上进行纯化，采用点种法接种，继续培养 ，将长出菌落的平皿倒置于 的紫外灯下观察，若看到菌落周围有蓝紫色或黄绿色的荧光则初步判定为 产毒菌，将产生荧光的菌落再次划线分离、纯培养，最终得到的纯菌株采用甘油管藏法保存并编号。菌株鉴定 形态学鉴定挑取产生荧光的单菌株于载玻片上，滴 滴乳酸石碳酸棉蓝染液，盖上盖玻片后静置，擦镜纸吸去盖玻片周围多余染色液，用光学显微镜先在低倍镜下观察菌株整体形态，后转高倍镜观察菌株的菌丝、孢子等形态。并结合真菌鉴定手册对初筛菌进行初步鉴定。分子生物学鉴定基因组 的提取按照提取试剂盒说明书提取各产毒菌株的，采用通用引物 扩增 序列。引物序列为：，：。反应体系为 ；引物各；基因组 ；聚合酶 ；。反应程序为预变性 ，；变性，；退火 ，；延伸 ，；终延伸，；扩增循环次数为 次。扩增产物用 琼脂糖凝胶电泳，将 产物送上海生工生物工程有限公司测序。得到的测序结果在 网站上进行比对后，下载同源性高的序列用 软件中 法上构建系统发育树。法测定产毒菌的产 的能力 色谱条件色谱柱：（，）；进样量；柱温；流动相：甲醇；一级水。采用梯度洗脱，条件见表。流速 。表 梯度洗脱条件 时间 质谱条件电喷雾离子源，正离子模式；离子源温度；离子喷射电压 ；加热气，雾化气，气帘气体。扫描方式为多重反应监测。标准溶液的制备准确称取、的标准品，用甲醇溶解、稀释制备成质量浓度分别为、共 个梯度的标准溶液。产毒培养液的制备霉菌产毒培养：将筛选得到的产毒菌株接种于 固体培养基上，培养 ，用已灭菌的（体积分数）吐温 洗取平板上菌落的分生孢子，得到 株菌的孢子悬浮液备用。将制备好的孢子食品与发酵工业 （）悬浮液置于电子显微镜下用血球计数板计数，调整孢子浓度为 ，然后吸取 孢子悬浮液加入装有 沙氏液体培养基的锥形瓶中。在 、恒温摇床上分别培养 和 。的提取：用 层灭菌纱布过滤菌丝球培养液，收集产毒培养液于 离心管中备用。取 产毒培养液再加 纯水定量至 ，通过免疫亲和柱，控制流速为 ，用 水分 次洗脱，洗脱后将洗脱液弃去，用洗耳球将水吹尽，再加 纯甲醇洗脱，用注射器将管中上清液吸出，将注射器中的毒素提取液过 有机系滤膜，装入进样小瓶用 测定待测 含量。结果与分析 产毒菌的分离与形态学鉴定采用稀释涂布方法，对疑似霉变的湘派卤汁中的产毒菌进行分离、纯化，根据 在紫外作用下可发蓝紫光和黄绿色荧光这一特征，初步筛选得到 株可产生黄绿色孢子的菌株，分别命名为、。菌落 在 培养基上生长较快，表面中间有些许的隆起并有类似褐色的桃胶物分泌，从中心呈圆环状向四周生长，质地呈致密丝绒状。菌落正面色泽随其生长由白色变为黄绿色，菌落背面呈褶皱状，颜色为浅褐色。分生孢子头呈疏松放射状或疏松柱状，分生孢子梗粗糙，顶囊呈近球形；分生孢子较为分散，呈球形或近球形（图）。菌落 生长较快，菌落表面中间隆起，质地为丝绒状且生长茂密。菌落正面初期为白色，直至第 天产生黄色孢子，菌落背面呈褶皱状，颜色为褐色。分生孢子梗的孢梗茎为浅绿色，壁较厚；顶囊呈椭圆形，光滑。该菌落的分生孢子较分散，呈浅绿色，形状为球形或近球形（图）。菌落 生长迅速，表面隆起，质地呈丝绒状，边缘有不规则褶皱。菌落初期为白色，培养 后中间部分分泌黄色孢子，边缘为白色，培养到第 天菌落呈黄绿色。分生孢子头分生孢子梗很粗糙，具有单层分生孢子头的产孢结构，顶囊呈安瓿瓶状；分生孢子较分散，呈球形或椭圆形（图）。菌落 生长较快，质地丝绒状，偶有絮状菌丝。菌落正面由最初的白色变为黄绿色，背面为褶皱状，颜色为深褐色。分生孢子头初为球形，后呈辐射形；分生孢子梗粗糙，产孢结构为单层，顶囊为杵形；分生孢子呈球形（图）。菌落 生长较快，表面中间隆起，质地为致密丝绒状。菌落正面初期为白色，直至第 天分泌黄绿色孢子，菌落背面呈辐射褶皱状。分生孢子头为球形；分生孢子梗壁厚，无色，粗糙；顶囊近球形；分生孢子多为球形或近球形（图）。各菌株在紫外灯照射下产生荧光现象如图 所示。、菌株在 培养基上培养的菌落；菌株的产孢结构（）菌株；菌株；菌株；菌株；菌株 图 五株菌在 上菌落形态和微观结构 分子生物学鉴定在紫外灯照射下呈现蓝紫色或黄绿色的单菌落，经过基因组 的提取，以总 为模板，通过利用 引物，进行 扩增，琼脂糖凝胶电泳检测操作步骤后，发现 株菌在 出现特异性条带（图）。将 株菌测序的结果上传到 网站的的 数据中进行 比对，发现、与已知的黄曲霉（）处于同一分枝，同源性达，与 已 知 的 寄 生 曲 霉（）处于同一分枝，同源性达。将与 株菌相似度高的序列采用 软件中的邻接法构建系统发育树，、与黄研究报告 年第 卷第 期（总第 期）曲霉聚于一支，亲缘关系最近，鉴定为黄曲霉；与寄生曲霉聚于一支，亲缘关系最近，鉴定为寄生曲霉。结果见表 和图。菌株；菌株；菌株；菌株；菌株图 培养皿中产生荧光现象的菌落 图 扩增鉴定胶图 表 产荧光现象微生物 基因序列比对结果 菌株编号基因序列长度 菌株名称相似度 法测定产毒菌的产 能力在所选条件下，得到良好的基线分离，种毒素在 内出峰，先后顺序为、，保留时间分别为 、。以峰面积（）和毒素浓度（）为坐标轴，得到 种（、）的标准曲线，相关系数 均大于 ，说明线性关系良好，如表 所示。计算各菌产 的能力，结果显示在第 天和第 天的时候 株黄曲霉菌均不产生；株寄生曲霉菌产生 和，定量检测第 天和第 天产 含量分别为 、，产含量分别为 、。结果见表。图 五株菌的系统发育树 表 黄曲霉毒素的回归方程、相关系数、线性范围、保留时间、检出限和定量限 ，回归方程相关系数线性范围（）保留时间检出限（）定量限（）表 各菌产 能力单位：菌株编号菌株名称 黄曲霉黄曲霉黄曲霉寄生曲霉黄曲霉 注：为未检出 讨论 自然荧光比较难观察到，为了使 荧光效果更显著，通常将 环糊精及其甲基化产物添加到培养基中来进行产毒菌的鉴定。、通过与 环糊精和它的甲基化衍生物的空穴形成包含复合物从而增强荧光效果，在紫外灯照射下，可观察到菌株周围发出蓝紫色或黄绿色荧食品与发酵工业 （）光。依据这一原理，本实验将甲基化 环糊精添加到 培养基中，此种方法能够快速检测出湘派卤汁中是否有产 的菌株，操作简单且成本低，适用于产毒菌株的初筛。通过采用紫外荧光检测法，对疑似霉变的湘派卤汁进行产毒菌的筛选，最终获得产蓝紫色和黄绿色荧光的菌落共 株，其中有 株为黄曲霉菌，株为寄生曲霉菌。经过大量实验证实，自然界中污染食品最多的且分布最广泛的是。采用液相色谱串联质谱法检测 株菌的产毒能力的结果显示，株黄曲霉菌均不产生，寄生曲霉菌产毒且检测到和，这一实验结果与寄生曲霉几乎所有的菌株可以产生，黄曲霉则只有部分菌株可以产生 相吻合。同时也与在紫外线下 族发出蓝紫色荧光，族发出黄绿色荧光相一致。筛选到的 株黄曲霉菌均不产生，原因可能是黄曲霉菌在经过一系列传代培养后，出现营养菌丝增多，囊泡直径和大小减少等现象从而使产 能力逐渐降低。同时有研究发现，参与或调控 的生物合成包括 个基因，当某个基因或基因片段的缺失也可导致菌株不合成 或使 减少。等研究 基因在黄曲霉中的作用，发现缺乏 会导致菌落生长、分生孢子数量和硬化产生减少，从而导致 减少。等通过研究 基因在黄曲霉的分生孢子产生和次生代谢中的作用，结果表明 基因的缺失减少了无性孢子的产生，并显著降低了花生和玉米种子的毒力，同时 的产生也显著降低。等研究通过敲除并过表达 基因来研究 的功能，结果显示 缺失导致 生物合成的缺陷。等研究不产 的黄曲霉菌抑制产毒黄曲霉菌的产毒，通过运用转录组测序分析发酵培养物处理黄曲霉的抑制机制，发现 基因和 基因显著下调是导致黄曲霉菌不产毒的重要因素。魏丹丹对 株不产毒黄曲霉菌的基因缺失情况进行研究，得到了 种（）不同的缺失类型，说明了基因的缺失是引起菌株不产毒的关键因素。除此之外，有研究发现紫外线对低浓度 具有一定的破坏性，而本实验筛选到的黄曲霉菌可能含有的是低浓度的，在紫外线的作用下遭到破坏从而检测不到。本实验采 法检测初筛产毒菌株的产毒能力，研究结果显示，株产生荧光的初筛菌株中，株菌未检测到，表明仅通过紫外荧光法来确定产 的菌株可能存在误判的情况，因此还需要使用更准确、更精密的仪器进行检测，如液质联用技术等。根据菌株毒素含量（、种类型毒素含量总和），同时参考相关文献，可将其产毒能力划分为 个水平，根据菌株产毒量分别命名为高产毒菌（）、中产毒菌（）、低产毒菌（）和不产毒菌（），。而本实验筛选到的产毒菌的产毒量为 和 （均在 ），因此筛选出的寄生曲霉菌为低产毒菌。通过 定量检测发现 菌株在培养第 天和第 天均有 和 检出，且第 天的检出量均高于第 天的检出量。陈浩等通过采用高效液相色谱柱后衍生法测定湘派卤汁循环使用过程中 含量，结果表明在循环使用的 内均未检测出。出现这种现象的原因可能是湘派卤汁在循环使用的过程中有多种微生物参与，且在不同的时间点存在的优势菌也不一样，已有许多研究发现细菌和真菌均有抑制产 菌株生长的作用。而本实验在湘派卤汁中不仅筛选出了黄曲霉菌，且筛选出了一株产毒的寄生曲霉菌，说明湘派卤汁存在被霉菌毒素污染的风险，进而引发食品安全问题。由于 耐热性很强，而湘派卤制温度通常不超过，远远低于其被破坏的温度（），因此湘派卤汁一旦被霉菌毒素污染很难将其除去。本研究筛选出的黄曲霉菌虽然没有检测出，但由于霉菌在自然环境中繁殖，不稳定性强、发生突变的概率高，原先不产毒的黄曲霉菌可能存在回复突变的情况，导致其重新产毒。因此从分子生物学的角度去探明其产毒和不产毒机制，并研究湘派卤制品卤汁循环使用过程中是否存在抑制产毒菌生长的微生物是十分必要的，将为湘派卤制品卤制过程中 的防控提供科学依据。结论本研究对湘派卤制品卤汁在贮存过程中产 的微生物进行筛选、序列鉴定，并应用 测定其产毒菌培养液中 含量。结果显示经平板稀释涂布法、紫外荧光法和分子生物学共筛选鉴定出 株产毒菌株，其中有 株是黄曲霉，株为寄生曲霉；经 法确定 株黄曲霉均不产生，株寄生曲霉产 和，在第 天和第 天的含量分别为 、，在研究报告 年第 卷第 期（总第 期）第 天和第 天的含量分别为 、。该研究将为揭示湘派卤制品卤汁贮存过程中 消除机制奠定基础，并为卤制品加工产业的安全、健康发展提供参考依据。参考文献 陈浩，杨莹，赵良忠，等 湘派卤汁循环使用安全监测及预警模型的构建 食品与发酵工业，（）：，（）：杜垒，谢伟，徐幸莲，等 复卤前后盐水鸭老卤基本成分与安全指标变化 食品科学，（）：，（）：伍涛，彭希林，赵良忠，等 湘派豆干及卤汁在卤制过程中的变化规律 食品与发酵工业，（）：，（）：杨莹，唐奕，尹乐斌，等 湘派卤豆干卤汁安全品质分析 农产品加工，（）：，（）：，（）：，（）：，：，（）：，：，：魏景超 真菌 鉴 定 手 册 上 海：上 海 科 学 技 术 出 版社，：，晏丽 黄曲霉毒素产毒菌检测方法的研究及其应用 无锡：江南大学，：，阴佳璐 浑浊红球菌 对黄曲霉毒素 生物降解的研究 广州：华南理工大学，：，：，（）：吴丹 黄曲霉毒素在粮食和食品中的危害及防治 粮食加工，（）：，（）：张初署 中国四个生态区花生土壤中黄曲霉菌分布、产毒特征及遗传多样性研究 北京：中国农业科学院，：，罗自生，秦雨，徐艳群，等 黄曲霉毒素的生物合成、代谢和毒性研究进展 食品科学，（）：，（）：邢福国，李旭，张晨曦 黄曲霉毒素的产生机制及污染防控策略 食品科学技术学报，（）：；，（）：；魏丹丹 不产毒黄曲霉菌不产毒的分子机制及其抑制产毒菌产毒的研究 北京：中国农业科学院，：，（）：，（）：，（）：，（）：，（）：张杏 中国典型花生产区黄曲霉菌分布、产毒力与侵染研究 北京：中国农业科学院，：，姚彦坡，丁丹，张友青，等 玉米黄曲霉毒素污染生防菌筛选及菌株 抗菌活性研究 中国粮油学报，（）：，（）：，食品与发酵工业 （）（），：，（）：刘俊，张国朋，张智猛，等 不产毒黄曲霉菌株的筛选鉴定及分子机理研究 花生学报，（）：，（）：，（，）（，）（，），（），；