硫酸长春新碱热敏脂质体的制备和质量评价.pdf

基金项目:重大新药创制 “十二五”综合性新药开发大平台，药物新制剂技术平台(2012ZX09301003-001-009)作者简介:李明媛，女，硕士研究生研究方向:药物新技术与新剂型*通讯作者:梅兴国，男，教授，博士生导师研究方向:药物新技术与新剂型Tel/Fax:[phone]E-mail:硫酸长春新碱热敏脂质体的制备和质量评价李明媛，张慧，杨臻博，李晗，梅乐，梅兴国*(军事医学科学院毒物药物研究所，北京 100850)摘要:目的制备硫酸长春新碱(vincristine，VC)热敏脂质体，测定其粒径及体外释药热敏特性，建立脂质体含量、包封率及有关物质的测定方法。方法pH 梯度主动载药法制备长春新碱热敏脂质体，激光粒度分析仪测定脂质体粒径;以水为释放介质，分别考察脂质体在 37 和 42 的释放特性;超滤离心法测定脂质体包封率;HPLC 测定脂质体中长春新碱的含量及有关物质。结果长春新碱热敏脂质体的平均粒径为(86 6)nm，37 几乎不释放，42 30 min 内释放约 90%;3 批样品包封率均高于 95%;含量为 1.92 mgmL1，有关物质符合药典要求。结论长春新碱长循环热敏脂质体的制备工艺简单稳定，所制备的脂质体粒径均一，具有明显的热敏特性，包封率高，适于 20 长期储存。脂质体含量、包封率及有关物质测定方法简便、快速、准确。关键词:硫酸长春新碱;热敏脂质体粒径;热敏特性;包封率;超滤离心;含量;有关物质doi:10.11669/cpj.2014.18.009中图分类号:944文献标志码:A文章编号:1001 2494(2014)18 1615 05Preperation and Quality Evaluation of Vincristine Sulfate Thermosensitive LiposomesLI Ming-yuan，ZHANG Hui，YANG Zhen-bo，LI Han，MEI Le，MEI Xing-guo*(Institute of Pharmacology and Toxicology，Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100850，China)ABSTACT:OBJECTIVETo prepare vincristine sulfate(VC)thermosensitive liposomes，and evaluate its particle size and re-lease characteristics in vitro and establish the methods for determination of content，entrapment efficiency and related substances.METHODSpH gradient active drug-loading was used to prepare VC liposomes;photon correlation spectroscopy was used to determinethe particle size;the in vitro release properties of VC liposomes in 37 and 42 water were compared;the entrapment efficiency of theliposomes was determined by using centrifugal ultrafiltration;HPLC was applied for the determination of content and related substances.ESULTSThe average particle size of VC liposomes was(86 6)nm，and the liposomes hardly released at 37 and released about90%within 30 min at 42，showing obvious thermosensitive property;the entrapment efficiencies for 3 batches were higher than 95%;the content was 1.92 mgmL1，with the related substance in line with the pharmacopoeia requirements.CONCLUSIONThe prepa-ration process for VC liposome is simple and stable.The liposomes have narrow particle size distribution as well as obvious thermosensi-tive property，and it also has high drug encapsulation efficiency and is stable at 20 in long-term storage.The determination methodsfor the content，encapsulation efficiency and related substances of VC liposomes are simple，rapid and accurate.KEY WODS:vincristine sulfate;long-circulating thermosensitive liposomes;particle size;thermosensitive property;entrapment ef-ficiency;centrifugal ultrafiltration;content;related substance长春新碱是夹竹桃科植物长春花中提取出的生物碱，通过抑制微管蛋白的聚合影响纺锤体微管的形成，使有丝分裂停止于中期，其抗肿瘤作用约为长春碱的 10 倍，是急性淋巴细胞性白血病的一线用药，对何杰金氏病、绒毛膜上皮癌、淋巴肉瘤、网状细胞肉瘤、乳腺癌、肾母细胞瘤、卵巢癌、睾丸癌、神经母细胞瘤和恶性黑色素瘤也有疗效1-2。美国食品药品监督管理局(FDA)于 2012 年 8 月 9 日已批准硫酸长春新碱脂质体注射液用于费城染色体阴性成人急性淋巴细胞白血病(ALL)的治疗3。热敏脂质体又称温度敏感型脂质体(thermosen-sitive liposomes，TSLs)是 由 具 有 特 定 相 变 温 度(phase temperature，Tc)的磷脂制成。当环境温度低于脂质体的相变温度时，流动性和通透性均较小，当脂质体受热达到相变温度时，脂质体膜的流动性和通透性大大增加，短时间内释放内容物到受热部位。应用该原理，设计相变温度稍高于生理温度(41 42)的热敏脂质体，可以在生理温度下稳定，而在5161中国药学杂志 2014 年 9 月第 49 卷第 18 期Chin Pharm J，2014 September，Vol.49 No.18热处理的肿瘤或炎症病灶部位立即释放药物。作为抗肿瘤药物载体，热敏脂质体与传统脂质体相比，至少有两大优势:靶向性增强，增加脂质体在肿瘤部位的聚集;控释，能够增加脂质体中药物在肿瘤内部的释放，提高生物利用度，增强疗效。本实验中拟将 VC 制备成热敏脂质体制剂，以期增强 VC 的靶向性，提高治疗指数，并对其体外性质进行了研究4-7。1仪器与试药1.1仪器Agilent 1200 Series DAD 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Narophox 激光粒度分布仪(美国 Sym-patec 公司);IEC Micromax 高速离心机(美国 Ther-mo Electron 公司);DF 101S 磁力搅拌水浴锅(河南予华仪器有限公司);Vivaspin 500 L 超滤离心管(德国 Sartorius 公司);BT 125D 电子天平(德国Sartorius 公司);E2000 旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);ZD79 4 真空干燥箱(北京兴争仪器设备厂);YX 280 手提式压力蒸汽灭菌器(合肥华泰医疗设备有限公司);PB 10 pH 调节计(玻璃微电极，德国 Sartorius 公司);EmulsiFlex C3 高压均质机(加拿大 Avestin 公司);2130 型高效液相色谱仪(日本 Hitachi 公司);Waters 高效液相色谱合并 Co-rona 电喷雾检测器(美国 Waters 公司，美国 ThermoFisher 公司)。1.2试药硫酸长春新碱(批号:20130420，广州白云山现代汉方药业);硫酸长春新碱标准品(北京世纪奥科生物技术有限公司);DPPC(美国 Northern Lipids 公司);DSPE-PEG(美国 Genzyme 公司);MSPC(美国Genzyme 公司);甲醇为色谱纯;氯仿、二乙胺为分析纯，水为蒸馏水，其他试剂均为分析纯。2方法和结果2.1硫酸长春新碱(VC)热敏脂质体的制备8 2.1.1空白脂质体的制备称取 DPPC DSPE-PEG MSPC(质量比 7.5 1 0.8)混合磷脂适量，用氯仿-甲醇(3 1)溶解，真空旋转蒸发除去有机溶剂，在茄形瓶内壁形成均匀的薄膜，加枸橼酸-枸橼酸钠缓冲液(300 mmolL1，pH 3.5 3.8，磷脂质量浓度约为 100 mgmL1)旋转水化，得乳白色多室脂质体溶液，均质机加压均质，得到蓝色乳光半透明液体即脂质体溶液。2.1.2载药取空白脂质体、VC 溶液适量(按药/磷脂质量比 1 25 投药)混合均匀，30 35 水浴静置孵化 60 min 即得 VC 热敏脂质体(药物质量浓度为 1.5 mgmL1)，制备的脂质体为略带蓝色乳光的胶体溶液，过滤除菌，即得 VC 热敏脂质体，超净工作台分装，20 储存。2.2粒径利用 Narophox 激光粒度分布仪测定空白脂质体和载药脂质体的粒度。实验结果见表 1。粒径分布见图 1。载药前后脂质体平均粒径均在(86 6)nm 内，且载药后脂质体粒径比载药前略有增加。2.3包封率超滤离心管(Vivaspin 500 L)的预处理:新的超滤离心管在使用前需先在蒸馏水中浸泡，湿润滤膜;再过滤 30 gmL1VC 溶液，饱和膜的吸附作用，蒸馏水洗净(不可使滤膜重新干燥)，待用。超滤离心法:分别移取 200 L VC 热敏脂质体到 2 个 2 mL 量瓶中，一份加甲醇破膜，测定总药量(Qz，同“2.5.2”含量测定方法);另一份蒸馏水稀释定容，摇匀后移取脂质体稀释液 500 L 到超滤离心管(预处理过的 Vivaspin 500 L)中，10 000 rmin1离心 10 min，测定滤出液中药物含量(Qy，滤液含量即为脂质体外水相的含量)。根据如下表 1硫酸长春新碱热敏脂质体粒度分布表Tab.1Particle size distribution of VC thermosensitive lipo-somesBanth No.xD10/nmxD50/nmxD90/nm20130815Blank66 7482 92102 95VC65 6081 47101 1720130828Blank68 2585 12106 14VC73 4891 57114 1220131015Blank64 6779 4297 8VC66 6782 02101 02图 1硫酸长春新碱热敏脂质体粒度分布图Fig.1Particle size distribution of VC thermosensitive lipo-somes6161Chin Pharm J，2014 September，Vol.49 No.18中国药学杂志 2014 年 9 月第 49 卷第 18 期公式计算包封率(EE):EE%=(1 QYQZ)100%利用超滤离心法测定 3 批 VC 长循环热敏脂质体的包封率，结果 20130815 脂质体 98.77%，20130828 脂 质 体 99.06%，20131015脂 质 体99.84%。重复性实验:利用超滤离心法平行测定 6 次20131015 VC 脂质体包封率，结果见表 2。SD 2%，说明超滤离心法测定脂质体包封率的重复性好。2.4热敏特性于 10 倍体积生理盐水中测定 VC 在 37 和 42的体外释放速度，0、1、3、5、10、30 min 取样，超滤离心后测定脂质体外水相中药物浓度。以时间为横坐标，药物释放百分比为纵坐标(药物释放百分比%=脂质体外水相中药物浓度/脂质体药物总含量 100%)，脂质体体外热敏释放见图 2:37 基本不释放，42 迅速释放，30 min 内约释放 90%。2.5含量测定参考文献 9 建立 VC 热敏脂质体 HPLC 含量测定方法。表 2超滤离心法测定 VC 脂质体包封率的重复性实验Tab.2The reproducibility of centrifugal ultrafiltration methodfor determination of entrapment efficiency of VC thermosensi-tive liposomesNo.QyQzEntrapmentefficiency/%SDAverage/%SD/%17.32 784.399.7425.52 707.799.8033.62 701.099.870.0699.840.0643.62 800.799.8753.22 736.799.8863.62 855.999.87图 2硫酸长春新碱热敏脂质体 37 与 42 体外释放曲线n=3，珋x sFig.2In vitro releasing curves of VC thermosensitive lipo-somes at 37 and 42 n=3，珋x s2.5.1色谱条件色谱柱:ZOBAX SB-C8(4.6mm 250 mm，5 m);流动相:甲醇-二乙胺溶液(0.3%，磷酸调节 pH 7.0)(70 30);流速:1 mLmin1;柱温:30;检测波长:297 nm。2.5.2含量测定移取 200 L VC 热敏脂质体到 2 mL 量瓶中，加 400 L 甲醇，45 水浴加热震荡，使澄清透明。蒸馏水稀释定容，快速摇匀后12 000 rmin1离心 8 min，上清液即为供试品;另用蒸馏水配制成 VC 浓度为 200 gmL1的对照溶液。高效液相测定供试样品与对照溶液，外标法计算脂质体中 VC 的含量，测得平均含量为 1.55mgmL1。2.5.3专属性取空白脂质体、VC 脂质体适量，并配制一定浓度的 VC 水溶液，按照 VC 脂质体含量测定方法处理样品，依法分析并记录色谱图。结果见图 3，表明在该色谱条件下，处方中其他成分不干扰 VC 的定量分析。2.5.4线性及范围称取 VC 标准品12 mg 到10mL 量 瓶 中，蒸 馏 水 溶 解 稀 释 定 容，摇 匀 后 得1.2 mgmL1储备液。取储备液8.33 mL 到10 mL量瓶，稀释定容得 1.0 mgmL1溶液;移取 1.0mgmL1溶液 5、2 mL 到 2 个 10 mL 量瓶中，稀释定容得 500、200 gmL1溶液;移取 500 gmL1溶液 1 mL 到 10 mL 量瓶中，稀释定容得 50gmL1溶液，移取该溶液 2 mL 到 10 mL 量瓶中，蒸馏水稀释定容得 10 gmL1溶液。高效液相测定溶液的浓度，以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标作图。标准曲线方程为:y=15.3x(r2=1)，表明在该色谱条件下，样品质量浓度在 10 1.2 mgmL1内线性关系良好。2.5.5回收率分别称取 8、10、12 mg VC 各 3 份到9 个10 mL 量瓶中，加约1 mL 蒸馏水充分溶解，再按照 VC 脂质体中磷脂比例分别加入空白脂质体214、267、320 L。加甲醇800 L，45 水浴加热震荡破膜，蒸馏水稀释定容，摇匀后12 000 rmin1离心8min，上清即为供试品。测定结果见表 3。回收率在98%102%，且 SD 2%，符合药典要求。2.5.6精密度重复性:平行制备 6 份 VC 中浓度样品，同含量测定方法处理样品，进样，峰面积SD 为 1.41%，小于 2%，符合药典要求。中间精密度:不同时间换用 Hitachi 高效液相色谱，平行制备 6 份 VC 中浓度样品，同含量测定方法处理样品，依次进样，峰面积 SD 为 0.98%，小于2%，符合药典要求。7161中国药学杂志 2014 年 9 月第 49 卷第 18 期Chin Pharm J，2014 September，Vol.49 No.18图 3硫酸长春新碱的 HPLC 图谱A 空白脂质体;B VC 水溶液;C VC 脂质体破膜Fig.3HPLC Chromatograms of vincristine sulfateA blank liposomes;B VC solution;C VC liposomes表 3VC 含量测定方法的回收率Tab.3ecovery rates of analytical method for VC contentConcentration/%ecovery ates/%No.1No.2No.3SD/%8098.8298.53100.060.7610099.2399.0198.241.0112099.7398.45101.030.772.5.7样品稳定性制备 VC 中浓度样品，同含量测定方法处理样品，室温避光放置，于 0、2、4、6、8和 12 h 取样测定，实验结果为 SD 1.68%，小于2%，符合药典要求，说明其稳定性良好，满足测定要求。2.6有关物质根据 中国药典 2010 年版二部10，适当调整，建立 VC 热敏脂质体有关物质测定方法。2.6.1色谱条件流动相 A:二乙胺 15 mL，加水985 mL，磷酸调 pH 值至 7.5;流动相 B:甲醇;色谱柱:ZOBAX SB-C8(4.6 mm 250 mm，5 m)，梯度洗脱时间表:0.0 min，38/62(%A/%B，以下同);12.0 min，38/62;27.0 min，8/92;29.0 min，38/62;34.0 min，38/62。流速:1 mLmin1;进样量:20L;检测波长:297 nm。2.6.2有关物质测定取 500 L VC 热敏脂质体于 2 mL 量瓶中，加 1 mL 甲醇，45 水浴加热震荡，使澄清透明。蒸馏水稀释定容，摇匀，15 000 rmin1离心 10 min，上清液即为供试样品(VC 约为500 gmL1);取 50 L VC 热敏脂质体于 5 mL量瓶中，加甲醇200 L，45 水浴加热震荡，使澄清透明，摇匀，12 000 rmin1离心 8 min，上清液即为对照品(VC 约为 20 gmL1)。分别取 20 L 对照品与供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，测量峰面积，按下列公式计算。最大杂质量不得大于2.0%最大杂质量(%)=rirt+25rv100%;有关物质总量不得大于 5.0%:有关物质总量(%)=rirt+25rv100%ri为除溶剂峰外供试品溶液中最大杂质的峰面积;rt为除溶剂峰外供试品溶液中所有有关物质的峰面积的和;rv为对照品溶液中的长春新碱峰面积。2.6.3系统适用性实验取硫酸长春新碱和硫酸长春碱适量，用水溶解并稀释制成 1 mgmL1的混合溶液，取 20 L 注入液相色谱仪，硫酸长春新碱的保留时间约为19 min，硫酸长春碱约为22 min，二者分离度约为 9.0，远大于 4.0，见图 4，符合药典要求。2.6.4检测限及定量限称取 10 mg VC 标准品到 100 mL 量瓶，稀释定容得 100 gmL1溶液;分别移取该溶液 5、3、1、0.1 mL 到 100 mL 量瓶，配成5、3、1 gmL1和 100 ngmL1VC 溶液;移取100 ngmL1溶液 5、2、1、0.5、0.2 和 0.1 mL 到 10mL 量瓶，配成50、20、10、5、2 和1 ngmL1VC 溶液。上述所有溶液样品，由低浓度到高浓度依次进样，信噪比为 3 1 即为检测限，10 1 为定量限。测定结果为检测限 1 gmL1，定量限 3 gmL1。3讨论磷脂材料的长期储存条件为 20，制成脂质体对其整体稳定性有一定影响，故长期储存仍需选择 20，4 只适宜短期存放。长春新碱与长春瑞滨同属长春碱类生物碱，具有十分相似的化学结构和物理性质。本实验以长春瑞滨热敏脂质体的研究为借鉴，进行了一系列关于8161Chin Pharm J，2014 September，Vol.49 No.18中国药学杂志 2014 年 9 月第 49 卷第 18 期图 4VC 热敏脂质体有关物质测定方法系统适用性图谱A 1 mgmL1硫酸长春碱;B 1 mgmL1硫酸长春新碱及硫酸长春碱Fig.4System suitability chromatogramsA 1 mgmL1vinblastine;B 1 mgmL1VC and vinblastine长春新碱热敏脂质体的研究开发。以空白热敏脂质体为载体，通过主动载药的方式将水溶性药物载入内部，通过 EP 效应及局部加热触发，促进药物在靶部位的释放，减毒增效。与葡聚糖凝胶柱法相比，超滤离心法测定包封率可以快速、有效的分离脂质体与游离药，且操作简便。所制备的热敏脂质体粒径均一、包封率高、体外释药具有显著的热敏特性;工艺稳定重现性好，有望实现工业化生产。EFEENCES1WANG C Y，FENG L L，YANG X K，et al.Folic acid-conjugatedliposomal vincristine for multidrug resistant cancer therapyJAsian J Pharm Sci，2013，8(2):118-127.2ZHANG L，GAO H G，CHEN L F，et al.Tumor targeting of vin-cristine by mBAFF-modified PEG liposomes in Blymphoma cellsJ.Cancer Lett，2008，269(1):26-36.3JEFFEY A S，STEVEN D.Marqibo(vincristine sulfate li-posome injection)improves the pharmacokinetics and pharmaco-dynamics of vincristineJ.Cancer Chemother Pharmacol，2013，71(3):555-564.4CHISTOPHOOS M，ELENI E，MAIE-EDITH M，et al.Invitro localized release of thermosensitive liposomes with ultra-sound-induced hyperthermiaJ.Ultrasound Med Biol，2013，39(11):2011-2020.5TEENCE T，TYONE M P.Thermosensitive liposomes for lo-calized delivery and triggered release of chemotherapyJ.JControlled elease，2013，169(1-2):112-125.6LI L，TIMO L M，MATIN H，et al.Mild hyperthermia triggereddoxorubicin release from optimized stealth thermosensitive lipo-somes improves intratumoral drug delivery and efficacyJ.JControlled elease，2013，168(2):142-150.7SUN M P，MIN S K，SANG J P，et al.Novel temperature-trig-gered liposome with high stability:Formulation，in vitro evalua-tion，and in vivo study combined with high-intensity focused ul-trasound(HIFU)J.J Controlled elease，2013，170(3):373-379.8HUANG H S，GONG W，ZHANG H，et al.Preparation and en-trapment efficiency of Vinorelbine Tartrate thermosensitive lipo-somesJ.Chin Pharm J(中国药学杂志)，2010，45(16):12501254.9LI W J，YANG Z Q，WANG X L.Comparison of two methods fordetermination of entrapment efficiency of vincristine sulfate lipo-someJ.Chin J Exp Tradit Med Form(中国实验方剂学杂志)，2012，18(14):71-75.10Ch.P(2010)Vol(中国药典 2010 年版.二部)S.2010:963-964.(收稿日期:2014-01-17)9161中国药学杂志 2014 年 9 月第 49 卷第 18 期Chin Pharm J，2014 September，Vol.49 No.18