西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定.pdf

【目的】获取西藏沙棘根瘤内生菌中具有生物学活性的假单胞菌。【方法】采用细菌纯培养方法，从西藏沙棘根瘤中分离假单胞菌，通过细菌染色镜检、生化试验及16S rDNA基因序列分析等方法进行鉴定，通过生长曲线、耐受性、解磷及固氮能力定性筛选等实验对分离菌株生物学特性进行检测。【结果】分离菌株在YMA培养基上呈白色或乳白色，革兰氏阴性菌，杆状，16S rDNA序列比对结果表明分离株与参考假单胞菌属同源性为99%，命名为QY-X8。QY-X8在pH为58、氯化钠浓度0%2%仍能存活，具有较强的抗逆性，溶解无机磷和有机磷的溶磷圈/菌圈均大于2 mm，具有较好的溶磷能力，但不具有固氮能力。【结论】QY-X8菌株具有较强的耐受性和解磷作用，可为研发生物菌肥提供基础材料。关键词：假单胞菌属；西藏沙棘；菌种鉴定中图分类号：S144 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1003-4315（2023）03-0076-06Identification of Pseudomonas an endophytic bacterium from root nodules of Hippophae thibetanaMA Fulin，WANG Changling，RENZENG Zhuoma，LIU Rui，YE Guisheng，MA Yuhua（Department of Agriculture and Forestry，College of Agriculture and Animal Husbandry，Qinghai University，Xining 810016，China）Abstact：【Objective】To obtain Pseudomonas with biological activity from endophytic bacteria of Hippophae thibetana root nodules.【Method】The Pseudomonas was isolated by bacterial culture method，and the isolated bacteria were identified by staining microscope，biochemical test and 16S rDNA gene sequence analysis.The biological characteristics of the isolated strains were tested by growth curve，tolerance，qualitative screening for phosphorus solubilizing and nitrogen fixing ability.【Result】The isolated strains were white or milky white on YMA medium,Gram-negative bacteria，rod-shaped，and 16S rDNA sequence alignment showed that the isolated strains had 99%homology with the reference Pseudomonas，named QY-X8.QY-X8 can survive at pH 58 and sodium chloride concentration 0%2%，and has strong stress resistance，and has the ability to dissolve inorganic phosphorus and organic phosphorus simultaneously.The phosphorus dissolving circle/bacteria circle is larger than 2 mm，indicating that it has good phosphorus dissolving ability，but the nitrogen fixing transparent circle cant be detected on the solid medium.【Conclusion】QY-X8 has strong tolerance and dephosphorization，which can provide basic materials for the research and DOI：10.13432/ki.jgsau.2023.03.010第一作者：马福林，硕士研究生。E-mail：通信作者：马玉花，博士，教授，硕士生导师，主要从事森林培育理论与技术、植物资源开发利用方面的研究。E-mail：基金项目：国家自然科学基金项目（31660071）；青海省科技厅项目（2017-ZJ-734）。收稿日期：2022-04-13；修回日期：2022-06-16第 3 期马福林等：西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定development of biological bacterial fertilizer.Key words：Pseudomonas；Hippophae thibetana；strain identification沙棘是典型的非豆科结瘤植物，沙棘根瘤是由弗兰克氏菌（Frankia）侵入沙棘根系形成的瘤状结构，具有固氮作用1-3；中国境内主要有中国沙棘（Hippophae rhamnoidoes）、西 藏 沙 棘（Hippophae thibetana）、肋果沙棘（H.neurocarpa）等4-5。研究表明沙棘根瘤内生菌菌群丰富，并不是单一的弗兰克氏放线菌6，前人用高通量测得215属，纯培养8属7，沙棘根瘤内生菌不仅在菌属数量上丰富，而且功能上也是存在多样性8-9。假单胞菌属广泛存在于土壤及植物根瘤中，属革兰氏阴性菌，呈杆状或短杆状10。虽然已有从多种植物中分离出具有生防、固氮、解磷、解毒等作用的假单胞菌属的研究报道11-12，但是微生物种群、微生物作用常常因为土壤环境及宿主植物的不同而产生差异13，因此从高海拔、干旱或半干旱等恶劣环境生长的植物根瘤中分离筛选出具有多重作用的假单胞菌属具有重要意义，为后续菌株的产IAA、铁载体等促生性能研究提供材料。本研究从青海玉树地区西藏沙棘根瘤内生菌中进行假单胞菌的分离、纯化及鉴定，并对菌株的耐受性、解磷及固氮能力进行测定，研究结果将为开发微生物菌肥提供基础材料。1材料与方法1.1试验材料1.1.1供试植株西藏沙棘采自中国青海省玉树藏 族 自 治 州 治 多 县 加 吉 博 洛 镇（E 95.622267，N 33.849483，海拔4 141.75 m），采集生长良好、成熟的植株。1.1.2培养基及试剂YMA培养基14；BTB培养基；MR-VP培养基；解无机磷培养基；解有机磷培养基；阿须贝固氮培养基；革兰氏染液、甲基红试剂及V-P试剂等等。1.2试验方法1.2.1样品的处理将采集的西藏沙棘植株连根及根际土一起装到密封袋带回实验室。自来水冲洗后挑选饱满的根瘤经75%乙醇初步灭菌，4 冰箱保存。挑选个大饱满、鲜嫩的根瘤置于超净工作台，用95%乙醇、0.2%HgCl2对根瘤进行灭菌，最后无菌水冲洗，取冲洗无菌水用于灭菌是否彻底检测，涂布于YMA固体培养基上15。1.2.2菌株的分离与纯化将无菌根瘤用镊子夹破，将挤出液在YMA固体培养基上划线，28 恒温培养25 d，在无菌环境下挑取单一菌落的一半进行革兰氏染色镜检。如果菌株不纯可重复进行单菌落划线分离和镜检，直至分纯。1.2.3菌株的生理生化测定参照 常见细菌系统鉴定手册16测定分离菌株的生理生化，参考菌株以恶臭假单胞菌为标准，恶臭假单胞菌不产生硫化氢，甲基红和 V-P 均阴性，革兰氏染色阴性菌，呈短杆状。1.2.416S rDNA基因片段的PCR扩增提取分离菌株基因组 DNA，以 16S rDNA 基因通用引物27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）进行扩增。PCR扩增产物进行电泳检测，将电泳检测长度正确的PCR产物测序送公司测序，将测序结果在NCBI进行对比分析，Megalign构建系统发育树。1.3菌株生物学特性研究1.3.1生长曲线及产酸能力的测定将菌液按照3%的接种量接种于 YMA 液体培养基，在 28，170 r/min恒温振荡培养0至34 h，期间每隔2 h测定菌液D600值及相对应的pH值，3次重复。1.3.2耐受性测定耐酸性测定：将分离菌株按3%的接种量接种于pH为3、4、5、6、7、8的YMA液体培养基，氯化钠浓度为0.01%，28，170 r/min恒温振荡培养24 h，以对应不同pH不接菌为对照，测定不同pH下的菌液D600值，3次重复。耐盐性测定：将分离菌株按3%的接种量接种于氯化钠浓度为0%、0.01%、1%、2%、3%和4%的YMA液体培养基上，pH=7.0，28，170 r/min恒温振荡培养24 h，测定不同氯化钠浓度下的菌液D600值，3次重复。1.3.3解磷、固氮能力定性测定将菌株接种于YMA 液体培养基，28，170 r/min恒温振荡培养77甘肃农业大学学报2023 年24 h，在打好孔的解无机磷、解有机磷培养基内注入分离菌株 20 L，28 恒温培养 4 d，测量透明圈（D）/菌圈（d），按照十字交叉法测定，将接活菌株点接于阿须贝固氮培养基，28 恒温培养4 d，查看是否有菌落生产，3次重复。1.4数据分析测量数据用Excel 2019统计，数据以平均值标准偏差输入。2结果与分析2.1分离菌株的形态染色特征将通过划线分离纯化1株西藏沙棘根瘤内生菌的单一菌落进行革兰氏染色，分离株为红色（图1），杆状或短杆状，部分弯曲，属于革兰氏阴性菌，为方便阐述，本文将获得菌株编号为QY-X8。2.2分离菌株生理生化测定结果分离菌株在七叶苷和果糖下呈阳性，在麦芽糖、纤维二糖、乳糖、L-鼠李糖、蔗糖、菊糖、甘露醇、山梨醇及棉子糖呈阴性，不产生硫化氢，在MR和V-P试验中呈阴性；在BTB培养基上产碱，符合假单胞菌属（Pseudomonas sp.）的特征，但无法确定到种。2.3分离株16S rDNA扩增结果1%琼脂糖凝胶电泳结果显示从分离菌株中成功扩增出1 500 bp左右的16S rDNA基因条带，条带单一，符合预期大小（图2）。2.4分离菌株16S rDNA同源比对分析将分离菌株16S rDNA序列与在NCBI上进行Blast分析，挑选出相似度较高的11株对比菌株（图3），结 果 显 示，分 离 菌 株 与 假 单 胞 菌 属（AY131214.1、EF540467.1、KJ482869.1、KT3505 01.1、KY962737.1）同源性为100%。系统进化结果显 示 分 离 菌 株 与 Pseudomonas baetica（MZ4562 73.1）为一个进化类群（图4），同源性达99.9%，结合生理生化试验表明，分离菌株为假单胞菌属。2.5生长曲线及产酸能力的测定由图5可见，QY-X8在2 h内处于迟缓期，生长较为缓慢；从2 h到22 h处于对数生长期，生长速度最快；从22 h到28 h处于稳定期，生长速度变慢，28 h后进入衰亡期。从0 h到34 h菌株的培养液pH由6.3持续上升到7.0，提示QY-X8菌株在生长过程中产碱。2.6耐受性测定2.6.1耐酸性测定图6为QY-X8在不同pH下的生长变化。由图6可见QY-X8在pH为48均可图1革兰氏染色镜检Figure 1Gram staining microscopic examination表1分离菌株QY-X8生化鉴定结果Table 1Biochemical identification test results of isolated strain QY-X8项目Project七叶苷纤维二糖麦芽糖甘露醇山梨醇棉子糖结果Result+项目Project乳糖L-鼠李糖甲基红试验V-P试验硫化氢水杨苷结果Result项目Project蔗糖菊糖果糖BTB反应运动性结果Result+产碱运动+表示阳性，-表示阴性。+indicates positive，-indicates negative.图2菌株16S rDNA 电泳图谱Figure 2Electrophoresis patterns of 16S rDNA genes of strains78第 3 期马福林等：西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定生长，说明菌株具有较广的酸碱适应范围；pH为3时培养24 h的菌株与培养0 h的菌株D600值变化不明显，而pH在58时二者的生长量差异明显，菌株较适合生长的pH为57，其中pH为7时，菌株D600值最大。2.6.2耐盐性测定图7为QY-X8在不同氯化钠浓度下的生长变化。由图7可知，QY-X8在氯化钠浓度0%2%下均可以生长，说明该菌株有较强的耐盐性，在氯化钠浓度为3%4%时，菌株生长缓慢，不适合QY-X8菌株的增殖培养。2.6.3解磷、固氮能力的定性测定表2显示分离菌株QY-X8具有较强的溶解无机磷和有机磷的能力，在第4 天溶解无机磷和溶解有机磷的D/d的比值分别为2.02 mm和2.27 mm（溶磷圈大小/菌落大小2mm），表明该菌同时兼具两种生物作用；但是QY-X8未能在阿须贝固氮培养基上生长，表明QY-图3菌株同源性对比分析Figure 3Sequence homology of strains图4基于16S rDNA构建系统发育树Figure 4Phylogenetic tree based on 16S rDNA图5生长曲线和产酸能力曲线Figure 5Growth curve and acid production capacity图6QY-X8耐酸性测定Figure 6Acid resistance of QY-X879甘肃农业大学学报2023 年X8可能没有固氮作用或者固氮作用弱，后续研究需结合定量测定，才能更准确的得出QY-X8的生物作用。3讨论目前对微生物种群的研究主要以高通量测序和纯培养两种方法，高通量测序能够较为全面的揭示菌种数量和分布情况17，而纯培养是获得实体菌株的前提，也是提供开发微生物菌肥所需菌种的基础18。本研究通过纯培养的方式从西藏沙棘根瘤中获得1株QY-X8菌株，通过革兰氏染色、16S rDNA序列分析，表明QY-X8菌株隶属变形菌门中的假单胞菌属，这与之前的研究表明假单胞菌属存在于沙棘根瘤一致19。假单胞菌属广泛存在于土壤及植物根际中，具有固氮、解磷、解毒、生防及产IAA等生物功能。闫双堆等20从11株可以降解多环芳烃的菌株中筛选出1株具有高效降解能力的假单胞菌属，说明假单胞菌具有解毒功能；郭振华等21从不同时期落叶松根际土壤中利用筛选培养基获得112株固氮菌株，其中假单胞菌属是最为丰富的，表明假单胞菌属有较强的固氮能力；罗兴等22从健康乌头植株中分离出24株高产IAA的内生细菌，分别为假单胞菌属和芽孢杆菌属（Bacillus），表明假单胞菌属具有产 IAA 的能力；张笑宇等23利用微生物培养联合高通量测序技术研究玉米-烟草轮作和烟草连作，发现连作土壤中根腐病病原菌腐霉属丰富度高，但轮作壤中未出现腐霉属菌，且轮作土壤中拮抗菌假单胞菌高于连作土壤，说明假单胞菌属是重要的生防菌，有着不可替代的生态价值。此外，研究发现，来自矮火绒草不同组织的假单胞菌属均有较强的抑菌、产IAA、溶磷及固氮的功能24，说明假单胞菌具有功能的多样性，且不同植物根际解磷菌存在差异25-26。本研究从青海高海拔地区筛选出1株兼具溶解无机磷（磷酸三钙）和有机磷（卵磷脂）的多重作用菌株，后续可从不同磷源去研究溶磷的多样性。由上述研究可见假单胞菌在不同植物中均可获得，不同筛选条件能获得具备不同功能的假单胞菌，因此在多条件下筛选多重作用的假单胞菌是研究趋势。植物根际微生物群落结构受植物及土壤养分的影响27，且微生物对植物的促生性及抗逆性都有极大的提高28，基于微生物的众多优良特性及假单胞菌属的普遍功能，本研究从高海拔干旱地区的沙质土壤中采集西藏沙棘根瘤，通过纯培养的方法筛选分离出假单胞菌属QY-X8，该菌具有溶解无机磷和有机磷的能力，并且具有较强的耐酸碱和耐盐性，说明该菌株具有提高植物在极端环境下的耐受性的潜图7QY-X8耐盐性测定Figure 7Salt tolerance of QY-X8表2分离菌株QY-X8解磷、固氮能力测定Table 2The ability of phosphate solubilization and nitrogen fixation of isolated strain QY-X8测定能力Measuring capacity溶解无机磷Dissolves inorganic phosphorus溶解有机磷Dissolves organic phosphorus固氮Nitrogen fixation透明圈直径D/mmPhosphorus dissolving circle11.360.2519.331.04ND菌落圈直径d/mmBacteria circle5.620.158.510.75ND透明圈、菌落直径比值D/dPhosphorus dissolving circle/bacteria circle2.020.062.270.09ND“ND”表示未能检测到。ND indicates that it was not detected.80第 3 期马福林等：西藏沙棘根瘤内生菌假单胞菌属的分离与鉴定力。上述研究结果为发掘多功能菌株提供了基础材料，而该菌是否有促生性及与沙棘根瘤内生菌中其他种属的相互作用有待进一步的研究。4结论从西藏沙棘根瘤中分离筛选出一株假单胞菌属，该菌具有较强的耐酸和耐盐性，可在广谱环境中生存，经筛选培养基定性鉴定，该菌具有溶解无机磷和有机磷的能力，可为研发微生物菌肥提供基础材料。参考文献1 Tian C J，He X Y，Zhong Y，et al.Effects of VA mycorrhizae and Frankia dual inoculation on growth and nitrogen fixation of Hippophae tibetanaJ.Forest Ecology and Management，2002，170（1）：307-312.2 张爱梅，殷一然，孙坤.沙棘属植物弗兰克氏菌研究进展 J.微生物学通报，2020，47（11）：3933-3944.3 王宝山，简成功，屈海林，等.青海湟源县山坡梯田退耕还林还草效果研究 J.草原与草坪，2008（4）：73-76.4 张小民，王岚，林美珍，等.论沙棘根系与功能Frankia菌侵染和结瘤 J.沙棘，2006（1）：1-11.5 杨慧凡，蒋建德，黄家彬，等.沙棘和胡颓子属根瘤放线菌的分离和回接 J.微生物学报，1984，24（4）：315-319.6 樊梦颖，张明明，张情，等.不同月份沙棘根瘤细菌群落结构特征的分析对比 J.西北林学院学报，2020，35（6）：160-167.7 张爱梅，韩雪英，王嘉，等.马衔山中国沙棘根瘤内共生细菌多样性研究J.生态学报，2019，39（1）：294-301.8 张爱梅，殷一然，齐汝楠.产纤维素酶沙棘根瘤内生放线菌的筛选、鉴定及其酶活性测定 J.西北师范大学学报（自然科学版），2019，55（5）：71-76.9 张爱梅，吴菊艳，韩雪英，等.沙棘根瘤内生细菌中抑菌促生菌株的筛选和鉴定 J.微生物学通报，2019，46（5）：1041-1051.10 邹国和，李文灵，甘启芦，等.假单胞菌属的一个新种J.微生物学报，1994，（2）：96-99.11 Broadbent P，Baker K F，Waterworth Y.Bacteria and 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