王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响_黎长龙.pdf

2023，45（2）DOI：10.13836/j.jjau.2023042Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensishttp:/江西农业大学学报 王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响黎长龙1，刘一博1，王守程1，何旭江1，2*，刘光楠3，袁芳4（1.江西农业大学 蜜蜂研究所，江西 南昌 330045；2.江西省蜜蜂生物学与饲养重点实验室，江西 南昌 330045；3.江西省石城县农业农村局，江西 赣州 342700；4.江西省养蜂研究所，江西 南昌 330052）摘要：【目的】蜜蜂蜂王的质量是影响蜂群生产的首要因素。旨在探究蜜蜂王台产卵育王技术培育蜂王的质量（生产力和免疫能力等），以期为如何提高蜂王质量和促进蜂群生产提供新思路。【方法】以西方蜜蜂（Apis mellifera）为试验对象，控制F1蜂王在王台产卵育王器中直接产卵，待产卵后转移至育王条，并放入继箱育王区中进行培育F2蜂王，为培育王台产卵组F2蜂王；对照组为人工移虫育王方式，即利用移虫针移取2日龄工蜂巢房幼虫至王台进行育王，培育对照组F2蜂王。通过测定分析F2蜂王个体形态、卵巢数量，以及分析两种育王方式培育F2蜂王Jhamt，Hex110，Defensin1和CYP9Q1 4种基因的相对表达丰度，以科学评估培育蜂王质量水平。【结果】王台产卵组蜂王接受率显著低于对照组（P0.05），但王台产卵组蜂王的初生重、前翅长与后翅长均显著高于对照组蜂王（P0.05）；王台产卵组蜂王的右侧卵巢管数也显著高于对照组（P0.05）；3个与蜂王发育和免疫相关基因（Jhamt，Hex110，Defensin1）在王台产卵组蜂王体内的表达量显著高于对照组蜂王，而与解毒相关的蜂王发育和免疫相关基因（CYP9Q1）则差异不显著（P0.05）。【结论】蜜蜂王台产卵育王技术培育蜂王的个体发育、卵巢发育、免疫力优于人工移虫育王技术。王台产卵培育蜂王可改善蜂王品质，为提高整个蜂群生存繁衍和环境抵御能力提供科学基础，有助于扭转人工移虫育王对蜜蜂的质量不良影响，推动蜜蜂健康和养蜂业良性发展，在保护和利用蜜蜂这种宝贵资源方面具有重要意义。关键词：西方蜜蜂；王台产卵育王；蜂王质量；初生重；卵巢管数；基因表达中图分类号：S892.5 文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：文章编号：1000-2286（2023）02-0434-10Effects of a Queen Rearing Method Using Queen-cell Egg Laying Device on Apis mellifera Queen QualityLI Changlong1，LIU Yibo1，WANG Shoucheng1，HE Xujiang1,2*，LIU Guangnan3，YUAN Fang4收稿日期：20221214 修回日期：20230111基金项目：国家自然科学基金项目（32160815）、江西省重点研发计划项目（20181BBF60019）和江西省主要学科学术和技术带头人项目（20204BCJL 23041）Project supported by the National Natural Science Foundation of China（32160815），Key Research and Development Project of Jiangxi province（20181BBF60019）and Major Discipline Academic and Technical Leaders Training Program of Jiangxi Province（20204BCJL23041）作者简介：黎长龙，硕士生，orcid.org/0000-0001-6588-4474，；*通信作者:何旭江，副研究员，博士，主要从事蜜蜂生物学研究，orcid.org/0000-0001-7445-8944，。黎长龙，刘一博，王守程，等.王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响 J.江西农业大学学报，2023，45（2）：434-443.LI C L,LIU Y B,WANG S C,et al.Effects of a queen rearing method using the queen-cell egg laying device on Apis mellifera queen qualityJ.Acta agriculturae universitatis Jiangxiensis,2023,45(2):434-443.第 2 期黎长龙等:王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响（1.Institute of Honeybee，Jiangxi Agricultural University，Nanchang 330045，China；2.Jiangxi Key Laboratory of Honeybee Biology and Bee Rearing，Nanchang 330045，China；3.Agricultural Rural Bureau of Shicheng County，Ganzhou，Jiangxi 342700，China；4.Jiangxi Institute of Apiculture，Nanchang 330052，China）Abstract：Objective The quality of the queen is the primary factor affecting honeybee colony production.This study aims to explore the effects of a queen rearing technology by queen-cell egg laying device on queen quality，in order to provide a new method to produce high quality queens and improve the development of apiculture.Method The Apis mellifera was used as the experiment material.The mother queen（F1）was controlled to lay eggs directly in queen cells of the queen-cell egg laying device，and then eggs were transferred to rearing strips and placed in the queen rearing area of the bee hive to breed queen-cell-egg queens（QC，F2）；2 d worker larvae were transplanted into queen cells by a traditional transferring tool to rear queens（2WL，F2）which were considered as the control group.The queen s newborn weight and morphological indexes including the length and width of fore wing，the length and width of hind wing，thorax length and width were measured，as well as the number of ovarioles by tissue section and expression of four key genes（Jhamt，Hex110，Defensin1 and CYP9Q1）by RT-qPCR，to explore differences in the qualities of queens from the above two groups.ResultsThe acceptance rates of queen larvae and rates of emerging queens in QC group were all significantly lower than that of the control group（P0.05），but the newborn weight，forewing length and hindwing length of QC queens were significantly higher than that of the control group（P0.05）；the number of ovarioles of QC queens was also significantly higher than that of the control group（P0.05）；the expression of three genes related to queen development and immunity（Jhamt，Hex110 and Defensin1）was significantly higher in QC group compared with the control，while the gene related to detoxification（CYP9Q1）was not significantly different（P0.05）.Conclusion The queens from QC group had much better qualities in terms of body and ovary development as well as a better immunocompetence than those queens reared by traditional domestic queen rearing practice.This study demonstrated that using queen-cell egg laying device to rear queens could significantly improve the queen quality and thereby raise the survival ability，reproductive and environmental resistance of the whole colony.Using this technology would alleviate the adverse effects of domestic queen rearing technology on queen quality and improve honeybee health as well as accelerate the development of apiculture industry，which has an important significance for the application and protection of honeybee resources.Keywords：Apis mellifera；queen-cell egg laying device；queen quality；newborn weight；number of ovarioles；gene expression【研究意义】蜜蜂是重要的授粉昆虫，为全球85%以上农作物授粉，在维护生态平衡和粮食安全方面发挥着重要作用1-3。同时，蜜蜂也是重要的经济昆虫，为人类提供营养丰富的蜂产品4。然而，2006年以来全球各大洲均出现“蜂群衰竭失调症（Colony collapse disorder，CCD）”，导致大量蜜蜂离奇死亡，其中蜂王质量下降是主要因素之一5-6。近年来，蜜蜂又面临着过冬时期高死亡率的问题。北美地区蜂群数据统计显示，其冬季损失率已经高达48%7。我国虽然没有出现CCD和越冬蜂高死亡率现象，但蜂王质量也有不断下降的迹象。如今，杀虫剂、气候变化以及寄生虫和疾病的传播等，也威胁着蜜蜂的生存与繁衍8。因此，如何提高蜂王质量，提升蜂群的生存与繁衍能力已成为养蜂业的焦点问题。培育优质的蜂王对养蜂业发展具有重要意义。正鉴于此，本研究通过开发并应用王台产卵育王技术培育优质蜂王，并对该技术所培育蜂王的质量进行评估。【研究进展】蜜蜂蜂王专职产卵，它是蜂群中唯一生殖器官发育完全的具有繁育能力的雌性个体，是整个蜂群的核心，在蜂群发展中具有决定性的作用9-10。而前人研究发现，蜜蜂群势的强弱除了受外界环境条件影响，蜂王质量的优劣也会对蜂群产生重要影响11-12。蜂王质量的高低对蜂群的生长与发展非常重要，它决定了后代蜂群的生存能力、免疫能力，以及蜂群的产量和蜂产品质量13。从1568年Nickel Jacob利用自然王台成功育王，到1888年Doolittle14总结育王经验并 435江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷著 科学育王法，蜜蜂人工移虫育王技术在全球范围内得到广泛传播与应用。这种传统的育王方式是利用移虫针移取工蜂巢房中的小幼虫（12 d）至王台培育蜂王。然而，有研究表明，蜂王浆所含成分如糖类、维生素、氨基酸、蛋白质和核酸等方面均与工蜂浆不同，且蜂王幼虫比工蜂幼虫获得更多的食物15-20。本团队前期研究发现，利用工蜂巢房卵所培育的F2蜂王质量显著高于人工移虫育王所培育的F2蜂王，且与发育、繁殖与免疫相关基因的甲基化水平会发生明显改变21。易瑶等22报道了人工移虫育王不仅会降低蜂王质量，其引起的甲基化变化还可以累代遗传。最新研究表明，蜜蜂蜂王会在王台中产更大更优质的卵，所培育的蜂王初生重等指标也显著高于工蜂巢房卵和工蜂幼虫培育的蜂王23。本团队前期基于蜂王在王台中产更大更优卵的生物学特性，研发了蜜蜂王台产卵育王技术及设备24。【本研究切入点】蜜蜂的育王方式不同对蜂王发育和质量的影响也不同，从而影响整个蜂群的生长与繁衍。某些蜜蜂育王技术，例如通过人工移取工蜂巢房幼虫的方式培育蜂王，会显著降低蜂王的质量21-22。与此同时，通过检测蜂王的形态指标、卵巢管数等生理指标和关键基因表达等分子指标来评估蜂王的质量，可较好地评估蜜蜂育王技术的优劣性。本团队前期研发了蜜蜂王台产卵育王技术，但尚未对该技术所培育的蜂王质量水平进行有效评估。【拟解决的关键问题】研究拟利用形态学分析、组织切片技术和实时荧光定量qRT-PCR技术，比较分析蜜蜂王台产卵育王和人工移虫育王技术所培育蜂王的发育水平、繁殖性能和免疫能力等方面进行评估，为该技术在蜜蜂优质育种中的应用提供科学基础，在保护蜜蜂这种重要的授粉昆虫和促进养蜂业发展方面具有重要意义。1 材料与方法1.1试验蜂群本研究共选取了6群群势较强（10足脾）的西方蜜蜂（Apis mellifera），均来自江西农业大学蜜蜂研究所的饲养蜂群。1.2试验器材与试剂1.2.1试验主要器材DHI型恒温恒湿培养箱（中国上海埃开仪器设备有限公司），ME204型电子分析天平（瑞士METTLER TOLEDO公司），WSI型蜜蜂形态指标测定系统（中国重庆奥特光学仪器有限公司），OPTPro型体式显微镜（中国重庆奥特光学仪器有限公司），TP1020型自动组织脱水机（德国徕卡公司），HistoCore Arcadia H型包埋机（德国徕卡公司），HistoCore Arcadia C型冷凝机（德国徕卡公司），Model RM2245型石蜡切片机（德国徕卡公司），KD-H型摊片机（中国浙江科迪仪器设备有限公司），KD-P型烘片机（中国浙江科迪仪器设备有限公司），Autostainer XL染色器具（德国徕卡公司），DP80型显微镜（中国奥林巴斯有限公司），AG R404A型离心机（德国艾本德生命科技公司），T100型反转录仪器（美国伯乐公司），QuantStudio型qRT-PCR仪器（美国赛默飞世尔科技公司），蜡盘，解剖针，手术剪，尖口镊子，铁质、塑料包埋盒，载玻片与盖玻片，中性树脂，载玻片和盖玻片，计数器，移液枪，灭菌枪头，96孔荧光定量板以及封口膜等。1.2.2试验试剂4%多聚甲醛固定液，无水乙醇，二甲苯，石蜡，伊红染液，苏木精染液，R6734型RNA提取试剂盒（美国Omega公司），巯基乙醇，RR047A反转录试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司），RR420A型荧光定量试剂盒（北京宝日医生物技术有限公司）。A：王台产卵育王设备实物全景图，B：王台产卵育王蜂王。A：The physical panorama of queen-cell egg laying device，B：The Queen from queen-cell eggs.图1王台产卵育王设备与蜂王全景图Fig.1The physical panorama of queen and queen-cell egg laying device 436第 2 期黎长龙等:王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响1.3王台产卵育王设备采用本团队前期研发的蜜蜂王台产卵育王技术及方法进行优质蜂王培育试验24。1.4育王方式1.4.1王台产卵育王参考袁芳等25试验方法，先将产卵器与王台等喷洒50%糖水，放入蜂群中清理1 d。然后把蜂王关入产卵器，控制在王台区域产卵。待F1蜂王在王台内产卵后，将王台转移至育王框上，放入已调整出哺育区域的继箱中培育F2蜂王。记录王台产卵率。产卵率=产卵数/王台总数100%；幼虫接受率=幼虫存活数/产卵总数100%；出房率=处女王出房数/产卵总数100%，试验重复3次。1.4.2人工移虫育王参考庞倩等26试验方法，以2日龄（孵化后48 h）的工蜂幼虫作移虫育王，移入和王台产卵育王相同的王台，并与王台产卵育王的王台放置在一起培育F2蜂王，以此作对照组。1.5蜂王数据测定1.5.1初生质量的测定蜂王出房后会因进食和水分丧失等出现体质量变化，且蜂群内蜂王出房时为方便取样与测取数据，所以试验时在蜂王出房的前一天，将育王框或封盖王台等，转移至恒温恒湿培养箱。每隔30 min观察F2 蜂王出房情况，在F2蜂王出房半小时内利用分析天平称取蜂王初生质量。试验组和对照组各测定8只F2蜂王。1.5.2形态指标测定参考Reeves等27试验方法，利用蜜蜂形态指标测定系统分别测定两种F2蜂王前翅长和前翅宽、后翅长和后翅宽、胸长和胸宽等形态指标。两组蜂王个体形态和卵巢切片样品测定各含8个生物学重复。1.6卵巢切片、染色及观察计数参考改进甘海燕等28，陈品素等29，卢凤兰等30试验方法，取材：F2蜂王出房并培育3 d后（卵巢发育较好），解剖显微镜下进行解剖，取其腹部，并除去卵巢之外的消化道、中肠以及蜜囊等。固定：将蜂王躯体装入盛有1 mL 4%多聚甲醛固定液的1.5 mL EP管内，常温状态下4 h或者4 状态下12 h。经此固定后，蜂王卵巢表现为聚拢状，借助尖镊能稳定取出。根据Jackson31关于蜜蜂卵巢管数的标准测定方法，将右侧卵巢转移至塑料包埋盒中。为防止卵巢在下一个试验环节中从塑料包埋盒漏出，在卵巢外周裹一层纱布，保护卵巢不丢失，脱水时的蜡液也能透入包埋盒。脱水：将处理好的塑料包埋盒放置在自动组织脱水机内，进行脱水处理。包埋：经自动组织脱水机处理后的卵巢，转移至包埋机。将卵巢垂直包埋在铁质包埋盒中，以获得清晰的卵巢管横截面。盖上塑料包埋盒另一半（底部），然后迅速放入冷冻机中进行冷凝。待温度降下之后，分离塑料包埋盒底座与铁质包埋盒，此时的包埋样品可放置在4 冰箱保存。切片：石蜡组织块安置在切片机上，调整刀片角度以及刀片与蜡块的距离，切取79 m的切片。然后用镊子夹取切片，正面平铺在40 的摊片机水面中进行加温摊片，使切片完全展开。直至切取到在显微镜下能清晰见到卵巢管的切片，而后在42 的烘干机中烘干3 h。染色并封片：烘干后带有卵巢切片的载玻片，经过HE染色程序处理。取出载玻片，并滴树脂进行盖玻片封片，以防止二甲苯挥发导致切片组织颜色变黑。封片在通风机下通风1 d，并静置3 d后，在显微镜下观察F2蜂王右侧卵巢形态组织并拍照计数。1.7基因水平检测1.7.1RNA提取参考Deng等32试验方法，取两种F2蜂王的头部。分别放入EP管，每管1个头，放入液氮迅速冷冻处理和保存。两组蜂王各含3个生物学重复。根据Omega公司的RNA提取试剂盒指导方法提取样品总RNA：每管样品加入350 L的GTC-buffer（1 mL的buffer中加入20 L的巯基乙醇），研磨捣碎，匀浆。将DNA结合柱套入2 mL离心管中，把裂解液转移到柱子，13 000 r/min离心1 min，滤液用于RNA提取。向滤液中加入0.5倍体积的无水乙醇，涡旋15 s混匀，然后转移到RNA结合柱的管中，13 000 r/min离心1 min。再将结合柱套入新的收集管，加入500 L的RNA Wash Buffer，13 000 r/min离心1 min，弃滤液。结合柱重新套回收集管，加入 500 L 的 RNA Wash Buffer，13 000 r/min 离心1 min，弃滤液，然后重复此步骤 1次。RNA 结合柱套回收集管，14 000 r/min离心空甩柱子 2 min。将RNA结合柱套入新的1.5 mL离心管中，加入40 L提前水浴加热至70 的DEPC-treated water，室温孵 437江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷育5 min。室温下离心1 min，然后将离心下去的DEPC-treated water吸取上来并打回结合柱，重复洗脱，提高RNA提取产量，获得样品总RNA。1.7.2反转录参考Deng等33试验方法，选用Takara 反转录试剂盒，并建立20 L体系进行反转录。先去除基因组DNA反应1（42，2 min；表1），在冰上配制以下反应混合液，加入RNA样品。进行反转录反应2（37，15 min；85，5 s；表1），同样在冰上配制以下反应混合液，加样然后按照反应条件进行即可获得cDNA。1.7.3基因引物设计选取根据参考文献34-38选取 Antimicrobial peptide gene defensin-1（Defensin1）、Juvenile hormone acid methyltransferase（Jhamt）、Honey bee hexamerin110（Hex110）和 Cytochrome P450 monooxygenase（CYP）家族中的 CYP9Q1。Defensin1基因反映蜜蜂的免疫能力34，Jhamt基因被证实与蜂王的级型分化有关35，Hex110基因影响蜂王的卵巢发育36，CYP9Q1基因则关系到蜜蜂解毒性能37-38。因此试验选择这4种基因进行荧光定量分析。在NCBI上查询相关基因编号和基因序列，各基因编号分别为 Defensin1：LOC406143；Jhamt：LOC724216；Hex110：LOC551648；CYP9Q1：LOC410492。以 GAPDH（LOC410122）为内参基因，在 Primer 5软件上设计引物序列（表 2），由上海生工生物工程股份有限公司合成。1.7.4qRT-PCR反应条件荧光定量反应体系如表3所示，PCR扩增反应条件：95 预变性5 min；94 变性2 min，60 退火45 s，72 延伸15 s，循环40次；72 终延伸10 min。RT-qPCR试验每组样品含7个生物学重复，并且每个cDNA样品进行3次技术重复。1.8数据处理基因相对表达量数据使用2-CT进行计算，其中Defensin1、Jhamt、Hex110和CYP9Q1作为目的基因，GAPDH为内参基因。相对表达量以及卵巢管数等各项测定数据在检验其为正态分布后，采用STATVIEW分析软件中的ANOVA分析和Fisher s PLSD方法检验进行方差分析，P0.05为差异显著。2 结果2.1王台产卵育王与人工移虫育王的幼虫接受率与出房率表4表明，蜜蜂王台产卵育王的蜂王接受率随幼虫日龄的增长而下降。王台产卵育王的幼虫接受率与处女王出房率均显著低于人工移虫育王（P0.05）。表1反转录试验的反应液体系Tab.1Reaction fluid system for reverse transcription experiments反应1体系 Reaction 1 system试剂 ReagentgDNA Eraser5gDNA Eraser BufferRNase Free dH2ORNATotal体积/L Volume1.02.06.01.010.0反应2体系 Reaction 2 system试剂 ReagentPrimeScript RT Enzyme Mix IRT Primer Mix5PrimeScript BufferRNase Free dH2OAdd step 1 reaction solution to体积/L Volume1.01.04.04.020.0表2实时荧光定量PCR的各基因引物信息Tab.2Primer sequences of each gene in quantitative real-time PCR基因名称Gene nameDefensin1JhamtHex110CYP9Q1GAPDH上游引物序列Forward primer sequence（53）AGAATGAAGAACGTGCCGACAGACTGAAAGCCAGCACGATACAATACCGGGAAGTGGCATCGTCGCTAGTGTCGAGAAGTTTTTCCACCGGCTGGTTTCATCGATGGTTT下游引物序列Reverse primer sequence（53）CTCCTTTCTCGCAATGACCTCCAGTCCGCAACCTATGTCCAAACACTTCATTCGCTGACAATCTGGTCCTGAACCTCTTTCCTCCTCGATTGACGATTTCGACCACCGTAAC退火温度/Tm5757575960 438第 2 期黎长龙等:王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响2.2王台产卵育王与人工移虫育王方式蜂王的初生重比较图2表明，利用蜜蜂王台产卵育王所培育的F2蜂王初生质量（249.0319.02）g显著高于人工移虫育王（221.7618.59）g的蜂王（P0.05）。2.3王台产卵育王与人工移虫育王方式蜂王的形态指标比较图3所示，王台产卵育王F2代蜂王的前翅长和后翅长显著长于人工移虫育王F2代蜂王（P0.05），而前翅宽、后翅宽、胸长和胸宽则没有显著差异（P0.05）。2.4王台产卵育王与人工移虫育王的卵巢管数比较图4所示，王台产卵育王的F2代蜂王右侧卵巢的卵巢管数（164.8012.70）显著高于人工移虫育王的F2代蜂王（137.2513.35，P0.05）。表3实时荧光定量qRT-PCR的反应液体系Tab.3Reaction fluid system in quantitative real-time PCR试剂 ReagentSYBR GREENROX correction fluidForward primerReverse primercDNAddH2OTotal体积/L Volume5.00.20.40.41.03.010.0表4王台产卵与人工移虫育王的王台幼虫接受率与出房率Tab.4The acceptance and emerging rates of queen cells from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting育王方式Queen rearing methods王台产卵育王Queen rearing from queen-cell eggs laying2 d幼虫人工移虫育王Queen rearing from 2 d worker larvae-grafting产卵率/%Egg laying rate68.448.323日龄幼虫接受率/%Acceptance rate of 3 d instar larvae21.434.96a75.004.02b6日龄幼虫接受率/%Acceptance rate of 6 d capping larvae12.337.11a33.335.58b处女王出房率/%Queen emerging rate5.192.24a25.008.67b同列数据肩标字母不相同表示差异显著（P0.05），“”表示无对应数据。Different letters indicate a significant difference（P0.05），“”indicates not applicable.数据为MeanSD，不同小写字母代表差异显著（P0.05）。Bars represent MeanSD，different letters on the top of the bars indicate significant difference（P0.05）.图2王台产卵与人工移虫育王蜂王的初生重比较Fig.2Comparison of newborn weight of queens from the queen-cell egg laying and 2d worker larva-grafting 439江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷2.5王台产卵育王与人工移虫育王蜂王的4种基因表达量比较图5所示，Defensin1、Jhamt与Hex110基因在王台产卵育王F2代蜂王的表达量显著高于人工移虫育王F2代蜂王（P0.05），而CYP9Q1基因表达量则差异不显著（P0.05）。数据为MeanSD，不同小写字母代表差异显著（P0.05）。Bars represent MeanSD，different letters on the top of the bars indicate significant difference（P0.05）.图3王台产卵与人工移虫育王蜂王的形态指标比较Fig.3Comparison of morphological indexes of newly emerged queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-graftingA：王台产卵育王与人工移虫育王方式蜂王的卵巢管数，B：人工移虫育王蜂王的右侧卵巢管，C：王台产卵育王蜂王的右侧卵巢管；数据为MeanSD，不同小写字母代表差异显著（P0.05）。A：The ovariole number（right side ovary）of queens from two queen rearing methods，B：The number of ovarioles（right side ovary）of 2WL queens，C：The number of ovarioles（right side ovary）of QC queens.Bars represent MeanSD，different letters on the top of the bars indicate significant difference（P0.05）.图4王台产卵与人工移虫育王蜂王的右卵巢管数比较Fig.4The ovariole number（right side ovary）of queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting 440第 2 期黎长龙等:王台产卵育王技术对西方蜜蜂蜂王质量的影响3 讨论与总结蜂王是影响蜜蜂蜂群生产的首要因素，在养蜂业中起重要作用39。尤其是在全球蜜蜂面临着疾病、寄生虫、环境污染等诸多挑战的情况下5-6,8，如何培育出高质量的蜂王显得尤为重要。本研究在前期开发的蜜蜂王台产卵育王技术基础上，对该技术所培育蜂王的个体发育、繁殖性能和免疫能力等方面进行了评价和分析。结果表明，蜜蜂王台产卵技术培育的蜂王初生重、前翅长和后翅长均显著高于人工移虫育王技术培育的蜂王（图2、图3），王台产卵育王蜂王右侧卵巢的卵巢管数显著多于人工移虫育王蜂王（图 4）。这是因为蜜蜂的母体效应，王台中的卵含有更丰富的营养物质，有利于蜂王幼虫的发育成长22-23。蜂王卵巢管数是评价蜂王生殖能力的一个重要指标，卵巢管数目越多，则越有利于其性成熟，增加产卵数量，同时也会使封盖子脾面积增大40。因此，采用蜜蜂王台产卵育王技术可以显著地改善蜂王的个体发育和生殖性能。此外，Defensin1基因是反映蜜蜂免疫能力的关键基因，其多肽可以对抗革兰氏阳性细菌感染34。结果显示，人工移虫育王培养的蜂王中，Defensin1基因的表达水平相对较低，而在王台产卵育王的F2蜂王中，该基因的表达水平相对高，表明王台产卵育王F2蜂王的免疫功能更加强大，防御系统更加完善。Jhamt基因则被证实与蜂王的级型分化有关，它的主要作用是防止变态发育和调节生殖成熟35。试验结果显示，Jhamt基因表达量在王台产卵育王的 F2蜂王中含量更高，证明其细胞分化机理更成熟。而Hex110基因主要作用是储备幼虫向成虫发育时所需的氨基酸物质，前人研究证实该基因家族是影响蜂王卵巢发育的关键基因36。而本研究的结果表明王台产卵育王F2代蜂王具有比对照组蜂王更多的卵巢管数，这极可能与其体内高表达的Hex110等关键基因相关。试验结果发现参与蜜蜂解毒相关功能的CYP9Q1基因37-38则未出现明显的差异表达，说明王台产卵育王技术对蜂王解毒相关的能力可能没有潜在影响。总之，本研究发现3个关键基因（Defensin1、Jhamt、Hex110）在王台产卵育王的蜂王体内表达显著高于人工移虫育王培育的蜂王（图5），表明王台产卵育王技术培育的蜂王在个体发育、生产性能及其免疫能力等方面，均优于人工移虫育王。然而，蜜蜂王台产卵育王的接受率显著低于人工移虫育王（表4）。这可能与蜂王的产卵特性有关。蜂王在繁殖季节在自然王台中产约1020个受精卵，培育后代蜂王41。本研究中，蜂王在塑料王台中产卵欲望较低，且王台中产受精卵的数量极可能会受到蜂群限制。同时，试验中还发现，季节对蜂王的王台产卵特性也有较大的影响。因此，蜂王在王台中产卵的内在机制与生物学特性仍需进一步深入研究，进而提高蜜蜂王台产卵育王的接受率。数据为MeanSD，不同小写字母代表差异显著（P0.05）。Bars represent MeanSD，different letters on the top of the bars indicate significant difference（P0.05）.图5王台产卵与人工移虫育王蜂王的4种基因表达量比较Fig.5The expression of four genes in queens from the queen-cell egg laying and 2 d worker larva-grafting 441江 西 农 业 大 学 学 报第 45 卷利用先进的方法培育优质蜂王是促进蜂群健康和养蜂业发展的重要保证。然而，沿用了上百年的人工移虫育王技术不断地降低蜂王的质量，逐渐暴露出了各种弊端，对蜜蜂这一重要的授粉昆虫的生存与繁衍带来诸多不利影响21-22。本团队研发的蜜蜂王台产卵技术充分利用了蜜蜂的母体效应对蜂王发育的促进作用。利用王台中高质量的受精卵培育蜂王可显著提高蜂王的质量，其个体发育水平、繁殖性能和免疫力等均显著优于人工移虫育王所培育的蜂王。为培育优质、高产和抗病力强的高质量蜂王提供了技术支持。