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拟衰老耳聋模型的建立及利水药对模型动物听功能的影响

赵丽楠 曹筱筱 张丹丹 茹魏哲 杨意 闻徐剑
指导老师：王静
上海中医药大学2005级中西医结合七年制、2006级中西医结合，201203

[摘要] 目的：探讨拟衰老耳聋动物模型的建立方法，并在此基础上研究利水中药泽泻对于模型动物听功能的影响。方法：选用耳廓声反射良好的白色豚鼠，通过腹腔单独注射D-半乳糖或联用庆大霉素试建立衰老耳聋模型，中药干预组采用泽泻水煎液进行灌胃治疗。实验以过氧化氢酶（CAT）活力作为衰老检测指标，以听性脑干反应（ABR）检测豚鼠听阈的变化。结果：与正常对照组相比，D-半乳糖注射组动物听阈在2K-12K频率范围内均明显下降，但D-半乳糖与GM联用动物听阈较正常对照组无显著性差异，利水药干预组动物与相应D-半乳糖与庆大霉素联用组动物相比，听阈有降低趋势，但无统计学意义。结论：D-半乳糖单独用药即能造成老年性耳聋模型，D-半乳糖与庆大霉素联用模型动物听力下降不明显，提示二者联用可能存在拮抗效应；利水药对D-半乳糖与GM联用模型动物显示一定的治疗作用。
[关键词] 拟衰老；耳聋；泽泻；D－半乳糖；庆大霉素

老年聋是因年龄增长、听觉器官及身体其他不同组织与器官共同发生的缓慢进行性老化过程，并出现听力减退的生理现象，随着社会人口老龄化的加剧，老年聋的发病率也居高不下[1]，研究老年聋具有重要的意义。
老年动物模型的建立方法有：臭氧损伤法、D-半乳糖法、胸腺摘除法、快速老化模型等，其中D-半乳糖法操作简单，所需经费少，见效明显，与自然衰老相似，为国内常用的衰老模型造模方法。有文献报道[2]，D-半乳糖可以诱导大鼠内耳拟老化模型，该模型对卡那霉素耳毒性的易感性增强，本研究在此基础上加以修改，采用D-半乳糖单独使用或与庆大霉素（GM）联用建立拟衰老耳聋模型，从而探索可行的老年聋建模方法。
中医理论认为，肾开窍于耳，耳为肾之官，肾又为先天之本，主水液代谢。中医多定义老年性耳聋为年老渐致肾虚引起，所以在治疗耳鸣耳聋一证时好投调肾壮肾之品。我们发现，中医从肾论治耳聋的常用方剂如六味地黄汤，耳聋左慈丸，五苓散等，配伍时均选用了泽泻这味利水药。研究发现，泽泻具有利水渗湿作用，能够缓慢穿透内耳，在血-外淋巴及外淋巴-内淋巴之间形成渗透梯度，可促使内淋巴外排，降低内淋巴积水，从而降低内淋巴有害代谢物浓度。因此本研究选用中药常用利水药泽泻，在D-半乳糖以及庆大霉素造成的衰老耳聋动物模型上，观察利水药对模型动物听功能的影响。
1.材料与方法：
1.1.材料
1.1.1实验动物
1月龄白色驯化豚鼠110只，250－300g，清洁级，耳廓声反射良好。由上海中医药大学动物房提供。常规饲养1周。
1.1.2药物和试剂
D-半乳糖（D-gal），25g/瓶，国药集团化学试剂有限公司，批号F20080721。
硫酸庆大霉素（Gentamicin，GM）注射液，8万单位/2ml，开封制药（集团）有限公司，批号：07040403。
中药泽泻，购于上海中医药大学附属曙光医院。
试剂盒：过氧化氢酶（CAT）试剂盒，南京建成生物工程公司，批号：20090509。
1%戊巴比妥钠，由上海中医药大学教学实验中心提供。
1.1.3仪器和设备
Neuropack 2型诱发电位仪（日本光电公司）
80-1离心机
电热恒温水浴锅
紫外分光光度计
其它仪器：电子秤；天平；手术器械等。
1.2.方法
2.2.1药物制备
泽泻的用量参照经典方耳聋左慈丸确定用量，60kg成人标准用量为9g。豚鼠按成人用量的20倍灌胃给药，即用量3g/kg。
称取中药泽泻，10倍量双蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮30min，取药液。再加入8倍量双蒸水浸泡2h，武火煮沸后，文火煎煮30min，取药液。将两次药液合并，纱布过滤，制得中药水煎液。中药水煎液再浓缩至含生药量1.0g/ml。
2.2.2动物分组及用药
将豚鼠按体重随机分为6组：
正常对照组（N组） 10只
半乳糖衰老模型组（D组） 20只
半乳糖+GM低剂量组（DGL组） 20只
半乳糖+GM高剂量组（DGH组） 20只
半乳糖+GM低剂量+泽泻治疗组（ZXL组） 20只
半乳糖+GM高剂量+泽泻治疗组（ZXH组） 20只
除正常对照组外，其它各组用D－半乳糖配置的注射用液以150mg/kg每日腹腔注射，连续51d，建立拟衰老动物，正常对照组每日腹腔注射等量生理盐水。
D－半乳糖用药后期20d（32d-51d），对DGL组、ZXL组每日腹腔注射GM 40 mg/kg，对DGH组、ZXH组每日腹腔注射GM 80mg/kg，建立耳聋模型。
中药泽泻治疗组ZXL组和ZXH组在腹腔注射GM低、高剂量的同时按3g/kg灌服等量泽泻水煎液，即1ml/kg，从第32d开始连续用药21d，其他组灌服等量饮用水。
1.23观察指标
①用药过程中，主要对豚鼠进行行为学指标观察，包括豚鼠的体重变化、毛发、行为活动等。
②过氧化氢酶（CAT）活力的测定
腹主动脉取血，测定豚鼠血清中过氧化氢酶（CAT）的活力。
具体操作方法参照南京建成生物工程公司过氧化氢酶（CAT）测定试剂盒说明书方法测定，单位用U/ml表示。
③听性脑干反应（ABR）检测
操作在隔音屏蔽室内进行。用1%戊巴比妥钠进行腹腔麻醉注射（40mg/kg体重），并维持麻醉状态。剪去头顶部的毛，将针电极的正极插入动物头顶正中皮肤，负极插入紧靠右耳外耳道下的皮肤，声刺激通过耳机输入右侧外耳道，刺激声为短音（tone pip）：上升/下降时间为1ms，持续时间为5ms，频率为2-12Hz。NeuropackⅡ系统控制给声及数据收集，叠加1000次，阈值判断以Ⅲ波为准。
1.2.4统计方法
各组实验数据均用SPSS15.0统计软件作统计学处理，结果以 表示，进行单因素方差分析，组间比较用T检验。
2.结果
2.1 行为学观察结果
2.1.1 D-半乳糖用药4周后，肉眼观察D-半乳糖用药组豚鼠在外观与体重上与正常对照组差别明显，表现为：用药组豚鼠毛发干枯无光泽，有大量脱落，行动迟缓，自发性活动减少，体重明显减轻；正常对照组毛发光亮顺滑，活泼好动，体重增长快。
2.1.2 DGL组DGH组、ZXL组和ZXH组从第32d开始注射庆大霉素，1周后，部分豚鼠出现啃食其它豚鼠毛发的奇怪现象，原因不明，可能与庆大霉素和D-半乳糖相互有所反应有关。随用药时间的延长，豚鼠死亡数量逐渐增多，身体健康状况不佳。
2.2 过氧化氢酶（CAT）活力检测结果（见表1）
由表1可见，D组CAT酶活力较正常组明显下降，但由于样本数太小，无法进行统计学比较。其他组与正常对照组相比，CAT活力无统计学差异。
取样少的原因：D-半乳糖对机体损伤大，实验过程中该组豚鼠死亡较多，
D-组豚鼠精神状态差，腹腔取血时大多腹膜粘连和肠粘连严重，腹腔积水多（见图2），局部有出血情况，加之血液粘稠，较正常豚鼠更易凝血，取血困难。
表1 CAT活力检测 （U/ml）
组别
n

N组
7
5.12±5.98
D组
2
1.17±3.7
DGL组
5
6.04±6.16
DGH组
8
14.24±17.07
ZXL组
8
4.18±6.61
ZXH组
7
7.07±5.92

图1 各组CAT活力比较

图2 D组豚鼠打开腹腔后照片
2.3 不同造模方法致ABR反应阈的改变（见表2、表3）
由表2、表3可以看出，D-半乳糖以150mg/kg日剂量连续用药51d能够使得豚鼠听性脑干反应阈值较正常对照组明显升高，造成中度聋耳聋模型，造模成功率为72.7％（TS>10 dB SPL）。D-半乳糖与不同剂量庆大霉素联合用药组动物，除低剂量组有1只动物出现明显耳聋，高剂量组有2只动物出现轻度耳聋外，其他动物均听力正常，表明D-半乳糖与庆大霉素联用可能不能有效造成耳聋模型。

表2 造模后D组、DGL组、DGH组ABR阈移（threshold shift, TS=T造模组-T正常对照组均值，dB SPL）
组别
例数
2k
4k
6k
8k
10k
12k
D组
11
28.71±33.72*
31.52±36.07*
36.29 ±28.94**
33.18±29.60**
40.30±33.99**
46.82±32.88**
DGL组
8
8.45±22.81
9.05±15.92
10.12±20.50
5.83±25.38
17.50±26.72
20.83±27.46
DGH组
11
2.50±8.16
4.17±8.61
0.83±7.07
-6.00±5.48
7.67±7.42
12.00±7.58
注：*p<0.05， **p<0.005。

表3 0分布能30.034nablish tamycin via 造模后动物听功能改变分布
组别
TS<10 dB SPL
1040
D组
27.3％
18.2％
9.1％
45.4％
DGL组
87.5％
0
0
12.5％
DGH组
81.8％
18.2％
0
0
注：以2～12k中阈移最大者为准。
*
*
**
**
**
**

图3 不同造模方法致ABR反应阈的改变
2.4 泽泻对D-半乳糖与GM联用模型动物听功能的影响（见表4、表5）
本实验结果显示，ZXL组连续进行泽泻灌胃21d后，阈移与DGL组相比有降低的趋势，显示利水药对老年药毒性耳聋有一定疗效。而ZXH组连续用药泽泻21d的听阈与DGH组相比听阈无明显差异。结果提示庆大霉素与D-半乳糖联合用药可能产生拮抗作用，导致毒性降低，拟进行进一步研究分析。

表4 造模后各组ABR阈移（threshold shift, TS=T造模组-T正常对照组均值，dB SPL）
组别
例数
2k
4k
6k
8k
10k
12k
DGL组
8
8.45±22.81
9.05±15.92
10.12±20.50
5.83±25.38
17.50±26.72
20.83±27.46
ZXL组
10
0.17±15.24
-1.67±15.63
-0.67±14.35
-5±14.72
7.67±14.49
10±16.33

表5 造模后各组ABR阈移（threshold shift, TS=T造模组-T正常对照组均值，dB SPL）
组别
例数
2k
4k
6k
8k
10k
12k
DGH组
6
2.5±8.16
4.17±8.61
0.83±7.07
-6±5.48
7.67±7.42
12±7.58
ZXH组
6
-3.33±7.58
-7.5±3.76*
-4.17±7.75
-6.67±7.53
2.5±8.61
12.5±8.8

图4 DGL组合ZXL组阈移比较

图5 DGH组合ZXH组阈移比较
3.讨论
D半乳糖亚急性衰老动物根据衰老代谢紊乱学说研制而成，方法是一定时间内给动物连续注射D-半乳糖，引起体内糖代谢紊乱，使得动物多种组织、器官形态及生理、生化指标出现明显变化，呈现与自然衰老相似的改变，这一过程与自然衰老相似。氨基糖苷类抗生素耳毒性作用的发生机制主要有以下几种学说：蓄积中毒学说；屏障受损学说；线粒体损伤学说；自由基和活性氧的大量产生； 钙蛋白酶与钙超载学说；细胞凋亡学说等。本实验采用2种工具药进行单独或联合用药，尝试建立老年性耳聋模型，现就具体结果分别讨论如下：
3.1模型衰老程度讨论
对于实验动物衰老程度的检测采用过氧化氢酶（CAT）试剂盒检测。具体方法严格按照说明书操作。
1）D-半乳糖组CAT活力与正常组相比有所降低，可以初步判断D-半乳糖对衰老大鼠造模成功，但是由于该组豚鼠实验后期死亡数量多，采血样本少，此结果不具有说服力，P>0.05，不具有统计学意义。
分析原因，可能为D-半乳糖用药时间长，对机体毒性强损伤大，豚鼠对D-半乳糖的耐受不高等因素，导致该组豚鼠精神状态差。腹腔取血时大多数豚鼠腹膜粘连和肠粘连严重，腹腔积水多，有些还有局部出血情况，加之血液粘稠，易凝血，造成取血困难。
2）D-半乳糖与不同剂量庆大霉素共同用药组的动物CAT活力有偏高的趋势，但无统计学差异（P>0.05），说明二者共同用药动物未出现明显衰老，具体原因有待进一步实验研究。
32关于衰老耳聋模型的建立
由于现今国际上对于老年聋动物模型的建立没有统一的标准，所以我们试采用腹腔注射D-半乳糖先导致豚鼠衰老，之后腹腔注射庆大霉素致聋的方法。两种方法均为动物实验常用造模方法，并分别得到了验证，建立模型操作方法简单，所需经费少，见效明显。此次研究结果显示：
1）D-半乳糖与不同剂量庆大霉素共同用药组的动物，除DGL组有1只动物出现明显耳聋，DGH组有2只动物出现轻度耳聋外，其他动物均听力正常。D－半乳糖与GM联用后造模的效果不理想。
此次的实验结果与我们的预期相悖，推测可能原因有：1、GM给药时间或量不足；2、我们是两药同时给药，文献报道多为相继给药，由于药物在体内代谢产物的复杂性，我们大胆猜想，两药的代谢产物可能存在相互作用的可能，从而导致一定的拮抗作用？联系过氧化氢酶（CAT）检测结果显示，D-半乳糖与庆大霉素联用组动物血清中CAT活力有升高趋势，与预期结果相反，似乎D-半乳糖的致衰老作用在与GM共同给药时未充分表现出来。以上讨论为我们的推测，且无相关实验报道，均需要进一步的实验验证以及新的实验证据的支持。在实验用药过程中，本组豚鼠在同时腹腔注射D-半乳糖和庆大霉素一周后，部分豚鼠出现了啃食其它豚鼠毛发的奇怪现象，具体原因有待探究。
庆大霉素和D-半乳糖结构式如图6、图7所示。

图6 庆大霉素结构式 图7 D-半乳糖结构式
2）D-半乳糖组连续用药51d后，在衰老的同时有听力下降的表现，经ABR检测发现72.7％豚鼠有中至重不同程度的度耳聋，提示单用D-半乳糖就可建立老年聋模型，且造模成功率较高。
有实验报道，尹志华、董明敏[6]用D-半乳糖300mg/kg每日给豚鼠腹腔注射2次，连续4周，可使ABR阈值升高，肝组织SOD活性不同程度下降；蒋学范、 董雪蕾等[7] 对大鼠腹腔注射D-半乳糖50mg/kg/d，连续6周建立老年聋模型，其听阈照对照组显著升高。但胡钰娟等[2 ]实验报道D－半乳糖单独用药组其听阈较正常对照组无明显改变，我们的研究结果显示，单独腹腔注射D-半乳糖可造成豚鼠听力明显下降。
3.3利水药对模型动物听功能的影响
祖国医学认为“肾主耳”，“耳者肾之官也”。人体是以五脏为中心的有机整体，形体官窍通过经络与内在脏腑相联系，各脏腑的病变均有可能影响到耳，而耳部疾患也可以在辨证论治思想的指导下，通过调整脏腑功能来缓解或治疗。综观近二十多年来中医药防治耳聋的临床和实验研究报道，临床用药、实验研究大复方居多，包含补肾、养肝、健脾、补气养血、活血化瘀、芳香通窍、利水渗湿等多种治则。
肾又为先天之本，主水液，调节人体水液代谢，肾与膀胱互为表里，与肺、脾诸脏协调，共同完成体内水液的输布和排泄。肾的作用贯穿于水液代的始终，所谓“肾者主水，肾为水脏”也。老年人肾气虚弱，肾主水液功能降低，从而升清排浊的功能降低，利水药泽泻具有利水渗湿、清肾火的功效，用于小便不利，水肿胀满，泄泻尿少，痰湿眩晕，热淋涩痛，遗精等证。中医从肾论治耳聋多以补肾为主，主张滋补肾阴，潜扶肾阳，维持体内“阳生阴长”的动态平衡。这类常用方剂如六味地黄汤，耳聋左慈丸，五苓散等，配伍时都选用泽泻这味利水药。
然而应用单味利水药治疗耳聋的研究还不多见。有文献报道[8] ，具有利水作用的印度菝葜，其醇提物对于庆大霉素引起的听毛细胞凋亡有特异性抑制作用。吴水生[9]等观察到泽泻主要活性成分泽泻醇A、泽泻醇B在10μmol、20μmol浓度下出现线粒体代谢活性增强的现象，说明其对细胞线粒体有保护作用。
本实验结果显示，ZXL组连续进行泽泻灌胃21d后，阈移与DGL组相比有降低的趋势，显示利水药对老年药毒性耳聋有一定疗效。而ZXH组连续用药泽泻21d的听阈与DGH组相比听阈无明显差异。结果提示庆大霉素与D-半乳糖联合用药可能产生拮抗作用，导致毒性降低，拟进行进一步研究分析。
表明利水药对老年聋可能具有一定的保护作用，作用机制还有待于进一步探索。
3.4实验总结和科创项目的完善
此次探索性实验肯定了D-半乳糖法建立老年聋动物模型的方法，同时在造模过程中，提出了新的问题：D-半乳糖与庆大霉素是否具有拮抗作用。经过ABR检测，可以初步判断利水药对于老年聋有一定的保护作用，但由于这仅为一次实验的结果，差异不显著，需要进行重复试验加以验证。
经过这次实验，为我们以后的科创课题奠定了基础，确定了可行的造模方法，同时，科创项目应该增加分组，如增加D-半乳糖+泽泻治疗组；庆大霉素模型组，确定更为完善的方案。
针对两种药物拮抗的问题，可以进行单独的实验来判断，通过设定单用组、同一给药方式联用组、不同给药方式联用组，进行动物实验，并对相关指标进行检测来判断。

参考文献
1. 邢光前, 陈智斌. 老年聋的研究进展. 实验老年医学, 2008 , 22(2) : 86-87.
2. 胡钰娟, 孔维佳, 王琼, 等. 大鼠内耳拟老化模型对卡那霉素耳毒性的易感性. 中华耳鼻咽喉头颈外科杂志, 2008, 43(1): 58-61.
3. Song X, Bao M, Li D, et a1. Advanced glycation in D-galactose induced mouse aging model[J]. Mech Aging Dev, 1999, 108(3): 239.
4. Zhang Q, Huang YG, Li XK, et a1. GM1 ganglioside prevented the decline of hippocampal neurogenesis associated with D-galactose[J]. Neuropharmacol and Neurotoxicol, 2005, 16(12): 1297.
5. 李同德, 史永芝, 史献君, 等. 加减味耳聋左慈丸对庆大霉素耳毒性的防治及其机制研究[J]. 中国临床康复. 2004, 8(28): 6150-6151.
6. 尹志华, 董明敏. D-半乳糖制造老年性聋模型方法的改进[J]. 中国中西医结合耳鼻咽喉科杂志. 2004, 12(4): 173.
7. 蒋学范, 董雪蕾, 蒋月星. 老年大鼠听性脑干核团谷氨酸脱羧酶免疫反应的变化. 临床医学. 2005, 25(1): 10-12.
8. Previati M, Corbacella E, Astolfi L, et al. Ethanolic extract from Hemidesmus indicus (Linn) displays otoprotectant activities on organotypic cultures without interfering on gentamicin uptake. J Chem Neuroanat. 2007,34(3-4): 128-133.
9. 吴水生, 郭改革, 施红, 等. 泽泻提取物Alisol Monoacetate A和B对HepG2细胞株胆固醇代谢的影响. 中华中医药杂志. 2007, 22(7): 475-477.