miRNA的研究方法.docx

科研中的miRNA研究方法总结

microRNA(miRNA) 是一类长度在22nt左右的内源非编码小RNA，广泛存在于动物、植物、病毒等多种有机体中。1993年，Lee等人在秀丽新小杆线虫(C.elegans)中发现了控制着线虫时序性发育的lin-4。2000年，Reinhart等发现了另一个具有转录后调节功能的小分子RNA：let-7。随后的几年时间里，许多研究人员相继发现了这类RNA，并将这些具有时空表达特异性的非编码小分子RNA命名为microRNA(miRNA)。
从长的初级miRNA(pri-miRNA)到形成成熟的单链miRNA到与靶标RNA结合，至少需要四步：首先是由核糖核酸酶ⅢDrosha和DGCR8组成的复合物将初始miRNA 转录本（pri-miRNA）加工成miRNA前体（pre-miRNA）；接着由转运蛋白Exportin-5和Ran GTP酶将miRNA从细胞核转运到细胞质中；第三步是由另一种核糖核酸酶ⅢDrosha将miRNA前体剪切成成熟的miRNA双链，miRNA双链打开，其中一条进入到RNA诱导的沉默RISC复合体（RISC）中，该复合体还包含TarRNA结合蛋白（TRBP）；最终RISC复合体根据miRNA与靶标RNA的互补配对，对靶基因进行剪切，或者翻译抑制。

图 1 miRNA生物学调控过程（摘自文献8）
miRNA通过作用于相应靶mRNA，参与细胞增殖、凋亡、分化、代谢、发育、肿瘤转移等多种生物学过程。预测超过1/3的人类基因都是保守的miRNA靶基因。近些年，随着科学研究的进展，大量的miRNA已经被鉴定出来，截至目前发现的人的成熟的miRNA有2578条，小鼠的有1908条。虽然miRNA的数量很多，但大多miRNA的功能并不为人所知。因此，准确快速地预测并鉴定miRNA的靶基因，对研究miRNA的功能具有十分重要的意义。下面本篇文章将着重介绍一下在医学科研领域中如何快速高效的鉴定与人类疾病相关的miRNA及其功能研究方法。
一、miRNA的定量检测
成熟miRNA的片段小，只有21bp左右，变异较大，在不同细胞中的表达差异较大，低表达的miRNA为其定量检测带来了很大的困难和挑战。尽管如此，随着科学的进步，越来越多的miRNA检测方法被建立起来，极大程度的促进了miRNA研究进展。下面介绍下在疾病研究中常用的五大miRNA定量检测方法。
Northern blotting: 是较为经典的检测各组织和器官中RNA的量和大小及估计其丰度的实验方法。主要实验步骤包括：①完整的RNA的分离；②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离；③将RNA转移到固相支持物上，在转移过程中，要保持RNA在凝胶中的相对分布；④将RNA固定到固体支持物上；⑤固相RNA与探针分子杂交；⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子；⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。优点：高度灵敏，而且通过结合RNA marker可以检测出miRNA的片段大小，能够排除实验被其他小分子RNA污染的可能性性，但Northern blotting对样品的需求量较高，操作步骤繁琐，不适用高通量分析。
微阵列芯片技术（microarry）：也称生物芯片、DNA芯片或者基因芯片技术，是一种平面的基质载体，上面规则地、特异性地吸附着基因或基因的产物。当与荧光标记过的样本杂交后，相应位置荧光信号的强弱即可反映对应基因表达的丰度。其优点是能够同时检测多个样本的表达量，实现miRNA的高通量分析。但芯片检测技术对miRNA的纯度质量要求较高，现行的RNA提取为了获取高质量了RNA，往往会在纯化过程丢失掉许多小分子RNA，影响一些低表达RNA的检测。另外芯片技术的一个突出的缺点就是信息质量的稳定性和可重复性较差。这些方面都需要改进。
原位杂交：该技术可以更为直观的显示出miRNA的表达情况，可直接观测到miRNA的表达时间，表达分布范围，具体位置等，不仅可以检测不同细胞系单个细胞中的miRNA表达，还可在不经分类和分离的情况下，比较不同细胞系中miRNA的表达水平。但miRNA分子太小，要对传统的原位杂交技术进一步改进，增加杂交的亲和性，结合牢固性，以防止洗脱过程中的丢失造成结果不准确。
RT-PCR：与杂交方法相比，PCR方法可以高度灵敏的检测出低表达的miRNA，并适合于高通量筛选。由于miRNA分子片段小，研究者们通过对其反转录引物进行特异性设计使得RT-PCR定量检测miRNA成为可能，根据所用引物的不同可以将其分为两大类，一类是Oligo d(T)特异的RT引物，miRNA在反转录前需要对其3’末端加多聚尾Poly(A)，再使用Oligo-Universal Tag通用逆转录引物进行逆转录反应，最终生成miRNA对应的cDNA第一链。茎环结构的RT引物由可以自身呈茎环状的特异序列加上6个到8个miRNA3’端反相互补碱基组成，一条miRNA序列对应一个特异的茎环结构的反转录引物。两者相比，前者引物设计容易且检测通量高，但检测灵敏度和特异性比后者低。荧光定量PCR根据所用荧光来源不同可以分为SYBR Green染料法和TagMan探针法。
miRNA 深度测序：该技术能够直接对样本中特定大小的miRNA分子进行高通量测序，可以在无需任何miRNA 序列信息的前提下研究miRNA的表达谱，并发现和鉴定新miRNA 分子。新一代测序最常使用的3种平台是Illumina的基因组分析仪、Roche454基因组测序仪以及 AB Life Technologies的SOLiD系统。因为miRNA的序列较短，较多应用于miRNA检测的新一代测序技术平台为Illumina基因组分析仪和AB Life Technologies的SOLiD系统。Illumina基因组分析仪具有所需样品少，数据误差小，操作流程简单等特点。SOLiD系统的读长为35nt，且准确度最高，单次运行所得的数据量最大，特别适用于miRNA的研究。而Roche454基因组测序仪测序读长可达400~500碱基，而miRNA序列长度仅为22碱基，所以该测序仪常用于新物种的基因组测序和转录组测序，极少应用于miRNA测序。
二、miRNA的靶基因寻找
研究表明，一个基因可以受多个miRNA调控，而一种miRNA又可以参与调控多个靶基因，据预测，至少有30%的人类基因是miRNA的靶基因。这就足以显示出miRNA群体的重要性。而在人类疾病中多不同程度的表现出大量miRNA的上调和下调，这也足以显示miRNA在疾病发生过程中占据着非常重要的作用。而探讨miRNA的功能作用中最重要的一步就是高效准确的寻找到其所调控的靶基因。目前寻找靶基因主要是从以下两个方面入手。
1．生物信息学方法
miRNA靶基因的预测主要是根据生物信息学的方式进行，主要是根据以下几个方面进行预测：①miRNA与靶基因结合位点的互补性；②miRNA靶位点在不同物种之间的保守性；③miRNA-mRNA结合的热稳定性；④miRNA靶位点处不应有复杂二级结构；⑤miRNA 5′端与靶基因的结合能力强于3′端。除以上几个基本原则外， 不同的预测方法还会根据各自总结的规律对算法进行不同的限制与优化。目前比较常用的靶基因预测软件有：miRanda、TargetScan、PicTar、miRWalk、miRanda、miRDB等，其中在miRWalk中可以查找到已经被研究证实的miRNA的靶基因，也可以查找与某种疾病相关的miRNA等。
虽然靶基因预测软件很多，但其预测特异性和敏感度还有待改善，一个软件针对一个miRNA通常可以预测出上千条靶基因，这就为后续的实验验证带来了许多困难，虽然我们可以结合多个软件进行miRNA的靶基因预测，但在取几个软件预测结果的交集时也忽略了许多真实的靶基因，在这两者之间的权衡就需要我们研究者去综合参考其他方面的因素来抉择。比如，我们可以结合DAVID软件对所选靶基因进行GO分析或通路分析，来针对某一特定功能方面进行靶基因的选择。

预测方法
网址
检索范围
算法特点
miRanda
http://www.microrna.org/
人， 果蝇，
斑马鱼
序列匹配， 双链结合自由能， 物种间保守性
TargetScan/
TargetScanS
http://www.targetscan.org/
人， 小鼠，
大鼠， 狗
提出“miRNA种子区”的概念
RNAhybrid
http://bibiserv.techfak.uni-bielefeld.de/rnahybrid/
哺乳动物
快速准确计算miRNA-mRNA二聚体自由能
DIANA-microT
http://www.diana.pcbi.upenn.edu/
人， 小鼠，
大鼠， 果蝇
考虑miRNA调控单个靶位点的情况
PicTar
http://pictar.bio.nyu.edu/
脊椎动物
区分“完全匹配种子区”与“不完全匹配种子区”
RNA22

哺乳动物
不考虑保守性， 由mRNA入手预测相关miRNA
2． 生物学实验方法
由于计算机模拟在预测miRNA靶基因时存在一定的局限性，因此很多医学科研人员也希望能够利用生物学实验方法直观地寻找miRNA靶基因。
(1) 从mRNA水平寻找miRNA靶基因
一种方法是将miRNA模拟物或过表达载体转染至细胞中，使得miRNA在细胞中过表达， 之后利用基因芯片分析mRNA的变化以找出相应miRNA的靶基因。此外，Beitzinger等人利用AGO蛋白家族既能结合miRNA又能结合mRNA的特性，分别使用AGO-1和AGO-2蛋白的单克隆抗体在人类细胞中进行免疫共沉淀，得到与AGO-1和AGO-2蛋白结合的mRNA各600条， 并通过克隆测序对这些mRNA进行鉴定。同时从与AGO-1蛋白结合的mRNA中随机挑选6条进行荧光素酶报告基因检测， 发现其中有5条都是miRNA的靶基因。Easow等人也是利用纯化miRNP来分析miRNA的靶基因。他们利用基因芯片分析了miRNP结合的mRNA后发现，大量计算机预测的miRNA靶基因得到了富集，同时为了分析单个miRNA的靶基因， 对野生型果蝇和miR-1缺失果蝇的miRNP结合mRNA进行了分析，得到并利用实验方法鉴定miR-1调节的mRNA，为miRNA靶基因的寻找提供了新的思路。最近，Liu等 人在研究Mir-16家族的功能时建立了一种针对miRNA靶基因的反向筛选法。首先，确定了感兴趣的基因ccnd1，将它的3′UTR构建到荧光素酶报告载体中，之后与构建的miRNA表达文库共转染HepG2细胞，得到荧光值明显下降的miRNA，再将得到的miRNA在体内验证其功能，最终得到Mir-16家族能够调节CCND1基因。该方法的关键在于，利用了自行构建的miRNA表达文库，能够方便同时研究多条miRNA，通过体外实验对候选miRNA进行初步筛选，从而快速地鉴定一条mRNA所对应的多条miRNA。
(2) 从蛋白质水平寻找miRNA靶基因
Selbach和Baek两个研究组分别利用蛋白质组学的研究方法，建立了从蛋白质水平寻找miRNA靶基因的新方法。两个课题组分别将成熟miRNA双链转染HeLa细胞，利用细胞培养稳定同位素标记技术(stable isotope labeling with amino acids in cell culture)，将转染了成熟miRNA双链的细胞和正常细胞分别培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中，经过若干次细胞倍增后，稳定同位素按照序列特异的方式完全掺入到新合成的蛋白质中，通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化实现对蛋白质的精确定量。在检测了2000~5000个蛋白后，两个研究组分别发现，转染一条miRNA后有几百个蛋白的表达水平发生了改变，许多改变在mRNA水平上不能得到体现。蛋白质组学相关研究方法的引入，使得人们可以从蛋白质水平上寻找miRNA的靶基因， 从而提高了靶基因的检出率。
三、 miRNA靶基因的验证
与miRNA靶基因的预测方法相比，对miRNA靶基因进行实验验证的方法并不多， 目前还没有一个快速、简便、高通量的鉴定方法。最直接的鉴定方法是， 利用荧光定量PCR及Western blot方法分别检测转染或敲低miRNA后细胞中mRNA水平及蛋白水平的变化，从而确定miRNA与靶基因的对应关系。这种方法能够直接鉴定出miRNA的靶基因， 准确度高但不能鉴定miRNA的靶位点。
转染或敲低miRNA：方式主要有两种，一种是构建miRNA过表达载体的稳定表达系统，一种是人工合成miRNA类似物的瞬时表达方式。miRNA的过表达载体中有插入成熟miRNA、pre-miRNA及pri-miRNA序列三种形式。其中pri-miRNA（含侧翼序列）的方式由于保留了每个microRNA独自的原始天然双臂结构，效果更好，是应用最为广泛的方法。microRNA过表达系统中有CMV启动子（II型启动子）和H1启动子（III型启动子）两种方式供选择。III型启动子（H1、U6等）具有表达效率高、有效的确定终止位置等优点，成为首选。II型启动子适用于pri-miRNA序列中有连续的5个T-导致III型启动子（CMV、Ubi等）终止转录的情况。载体系统也分多种，包括慢病毒载体、腺病毒载体、质粒载体等。瞬时过表达方式主要是经过人工化学修饰的运用化学方法合成的双链RNA，能模拟细胞中内源性成熟miRNA的高水平表达，以增强内源性miRNA的调控作用，进行功能获得性研究。只需直接转染进入细胞，即可检测功能变化，快速，方便。
miRNA靶位点鉴定：目前最为常用的miRNA靶位点鉴定方法是荧光素酶报告基因法。其基本原理是首先构建荧光素酶表达载体，将希望鉴定的miRNA靶基因的3′UTR构建到荧光素酶基因的3′UTR中，之后将构建好的载体转染细胞并改变细胞中相应miRNA的表达水平，最后检测荧光素酶的表达情况以分析转染3′UTR中是否含有miRNA的靶位点。
近几年来，对miRNA的研究已经成为医学科研领域中的一个重要方向。越来越多的研究揭示出其在疾病的发生及发展中处于重要地位，另外，它在疾病诊断、治疗及预后提示方面的作用也被有关研究所证实。在目前很多课题研究都会涉及miRNA领域，而了解miRNA基本研究思路及方法是研究中不可缺少的一步。在设计课题方案时，我们要灵活选择运用这些研究方法，以便使我们的研究方案更加新颖、合理、严谨。

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