感受态细胞的制备(DH5α大肠杆菌).doc

感受态细胞的制备（DH5α）
一、 准备工作
所有试剂、容器均需提前预冷。
1、实验器械
4℃离心机（50ml离心管），37℃恒温箱，37℃摇床，超净台（使用前需要紫外消毒15min至少）；0.22μm的滤器2个（过滤灭菌TfB2种溶液），10ml注射器2个；冰盒；高压灭菌的1.5mlEP管1盒，与离心机配套的50ml离心管6个（高压灭菌），高压灭菌的500ml锥形瓶2个，高压灭菌的100ml玻璃瓶2个，高压灭菌的1ml枪头和200μl枪头各一盒。
2、试剂配制（甘油特别难吸，用蓝枪头慢慢吸吧）
① LB平板：单纯LB平板，加有amp或有kana的（制板时需标注好类型，时间
② SOB培养基（Super Optimal Broth）
③ TfBⅠ：（100ml制备量）分别称取乙酸钾0.294g，MnCl2 0.99g，KCl 0.146g，CaCl2 0.111g，置于200ml烧杯中，加入15ml甘油和85mlDDW，摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，置于高压灭菌的100ml玻璃瓶中，4℃保存，使用前必须预冷。（装在50ml离心管，封口4度保存）
④ TfBⅡ（20ml制备量，每次现用现配，装在50ml离心管）：分别称取MOPS 0.046g，CaCl2 0.167g，KCl 0.015g，置于50ml烧杯中，加入3ml甘油和17mlDDW, 摇晃，使其全部溶解。然后在安全橱中用孔径为0.22μm的滤器过滤混合液，使用前必须预冷。

终体积
TFB1
浓度
100ml
200 ml
250 ml
1L
KAc
KCl
CaCl2
MnCl2·4H2O
Glycerol
30 mM
100 mM
10 mM
150 mM
15%
0.249g
0.146g
0.111g
0.99g
15ml
0.588 g
0.292 g
0.223 g
1.98 g
30 ml
0.623 g
0.365 g
0.278 g
2.475g
37.5 ml
2.49 g
1.46 g
1.11 g
9.9 g
150 ml
先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用0.2 M醋酸调pH值至5.8（非常关键），用针式过滤器过滤除菌，4度保存。

TFB2
浓度
20ml
200 ml
MOPS
CaCl2
KCl
Glycerol
10 mM
75 mM
10 mM
15%
0.042g
0.164g
0.015g
3ml
0.42g
1.64 g
0.15g
30 ml
先用部分去离子水溶解，后定容至要求体积。用1 M KOH调pH值至6.5，用针式过滤器过滤除菌，放在冰上当天现配现用
SOB培养基
配制量 1 L
配制方法 1.配制250 mM KCl溶液。（50ml离心管分装）
在90 ml的去离子水中溶解l.86 g KCl后，定容至100 ml。
2.配制2 M MgCl2溶液。（50ml离心管分装）
在90 ml去离子水中溶解4.06g MgCl2 6H2O后，定容至100 ml，高温高压灭菌。
3.称取下列试剂，置于l L烧杯中。

Tryptone
20 g
Yeast Extract
5 g
NaCl
0.5 g
4.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。
5.量取10 m1 250 mM KCl溶液，加入到烧杯中。
6.滴加NaOH小块，调节pH值至7.0。
7.加入去离子水将培养基定容至l L。
8.高温高压灭菌后，4℃保存。
9.使用前加入5 ml灭菌的2 M MgCl2溶液。
LB培养基
配制量 1 L
配制方法 1.称取下列试剂，置于l L烧杯中。
Tryptone
10 g
Yeast Extract
5 g
NaCl
10 g
2.加入约800 ml的去离子水，充分搅拌溶解。
3.滴加固体 NaOH，调节pH值至7.0。
4.加去离子水将培养基定容至1 L。
5高温高压灭菌后，4度保存。

二、 实验步骤
1、第一天：下午3点取出-80°的感受态细胞DH5a，冰浴，用枪头沾一点（就可以带出很多细菌，剩余的不要了），在500ul的LB液体培养基中吹打（轻柔），取50ul至另一个500ul的LB中再稀释，取100ul涂板。37度恒温箱培养过夜约16h（具体时间观察单克隆，可以顺利挑菌就行）。
2、 第二天早上，观察是否长出单个菌落，菌落大小合适时，向2个无菌的摇菌管分别加入5ml高压过的SOB培养液，标注为对照管和DH5α管。从LB平板上挑取单个菌落加入DH5α管中，220rpm，37℃，5h，OD550达0.3，将5mlSOB倒入100mlSOB，37度，220rpm，3.5h后，OD550达0.36（T43.7%），取出冰上放置5min；
3、 将100ml菌液转入两个离心瓶中（平底），spin 3K,5’,4℃，倒净上清，倒置于吸水纸上吸干剩余上清。之后步骤必须冰上进行，盐处理细胞后，操作轻柔;
4、 每管加入20ml TbfI 重悬，轻柔操作，冰上放置5’, spin 3K,5’,4℃。倒去上清，并倒置于吸水纸上;
5、 每管加入2ml Tbf ll 重悬，轻柔操作，冰上放置15’;
6、 每管50ul 分装。液氮速冻，-80度储存，标明制作日期，细菌种类;
7、留出一管做鉴定，分别直接涂布阴性，含AMP，含Kana的板子；再分别转化抗AMP和抗Kana的质粒，分别涂布含AMP，含Kana的板子，第二天验证感受态状态。
8、正常感受态在阴性板子中长，在含AMP，含Kana的板子中不长；转化抗AMP和抗Kana的质粒后分别后分别在含AMP，含Kana的板子中生长。（每个都需涂2个板，含AMP，含Kana的板子）