基因探针富集分析(GSEA).doc

基因探针富集分析（GSEA）翻译+心得（例子部分除外）  
2011-01-04 16:24:44|  分类： 【主】微阵列 |  标签：探针  基因  gsea  富集  表型  |字号 订阅
作者：为为

基因探针富集分析：通过基础知识来揭示基因组表达数据的一种方法

尽管通过RNA表达分析基因组在生物医学研究中已经成为一种直接途径，但从这些信息中能显示出生物学的重大发现（insight）现在仍然是一个大问题（2005）。在这里，我们将讲述一个给力的分析软件（GSEA：Gene Set Enrichment Analysis 基因探针富集分析）是如何揭示基因芯片所表达的数据关系。这个分析软件是源于一个强力的聚集基因理论——有很多基因成组具有共同的生理功能，或染色体位置，或调节位点。我们将讨论GSEA如何在癌症晚期（包括白血病和肺癌）的基因探针集大显身手。尤其是在单独分析两个独立研究组的肺癌病人基因组时，能发现不同基因组的细微类似之处的能力。GSEA的初始数据包已经含有了1325有生物学意义的探针集，并在很多免费的软件包中可用了。

                                                                                                                                                       By Eric S. Lander, August 2,2005

当今通过DNA微阵列分析基因表达已成为基因研究的主流。获得基因表达数据已不再是困难与挑战，但是从获得的数据（基因表达）中揭示出生物的意义的原理和方法才是研究的终极目的。在一个典型实验中，mRNA的表达文件（无数基因）大部分（既是概率也是数量）都会被分为一到两个大类，对于癌症基因来说相对（其他生物意义（如疾病））的敏感。根据这些基因的不同表达值可以排成一个序列（按大小顺序），暂且成为L。现在的最大问题就是找出其中的意义所在。
一个普遍的方法是把注意力放在L的顶部和底部的少数基因上（因为能体现最大的差别），来辨别其中的迹象以揭示生物意义的线索。但这种一般方法有很多主要的限制。
（i）在校正多重假设实验后，没有任何单独基因显示出有统计学意义的临界值，这是因为相关的生物学意义误差值被微阵列技术处理中的相关噪声掩盖了。
（ii）作为上述的反面，有可能在整个列表中很多基因都看起来都具有不统一的（不相同的）生物学意义。
（iii）单基因分析有可能会错过其对某些重要通路的影响。能洞察其中的奥秘或许只有生物学领域的专家。（意译，直译为“翻译其中缘由会让人沮丧和且变成生物学的专家”。）
（iv）当两个不同的小组研究同一生物系统的时候，那堆（一列单子有意义的基因悲剧的只有小许部分是重叠的。
为了克服这些缺陷，我们近来研发出一个叫做GSEA（功能基因集富集分析），它是基于评估来自微阵列的数据的各级别基因探针。根据以往的生物学知识，例如在权威刊物上发表过的生物学通路和实验得来的共表达数据，我们把基因探针分门别类。GSEA的目的是：判断探针集S上与表L的顶端和尾部的探针集有否分类相关的表型特征。
我们用GSEA的初始版本来分析糖尿病人与正常人的肌肉活组织采样数据。从这个分析中显示，有某些基因牵涉到糖尿病人的氧化磷酸化作用的减弱，尽管只有平均每个基因20%的效果。但是这个结果已经在其他独立的微阵列研究和活体功能研究中证实了。
在成功的鼓舞下，我们继续研发出更强大的GSEA（关于分子分析数据的技术）。为了更广泛的适用环境，我们研究了各种不同分子的特征与效果，并在本质上修改和一般化了我们原来的原理。
在此，我们提供此方法的完整数学论述和证明，以及展示它在不同类型的生物学问题上的应用效果。我们也做了一个软件包，叫GSEA-P,，里面包含初始基因探针集（MSigDB数据库里面的，不知道的找google），当然这些都是免费的。（译者注：生意。。。绝对是生意）

方法
GSEA的综述  GSEA把实验所得出的基因组样本表达文件分为两类，标记为1和2。根据表达值的相关系数和特征分类，（用某种标准）让基因进行排序。
首先从一个叫S的探针集序列开始，假定它是一类编码产生新陈代谢的通路基因集，被定位于相同的细胞生成位段，或者是说有相同GO分类。（译者注：GO是什么？维基百科。）    GSEA的目的就在于判断S的成员是随机的分布于L（待测基因探针所排序列）上还是有序的分布于顶部与尾部。我们的预期目的是S探针集能在表型上揭示出后者的分布方式。
下面是具体的三个重要步骤：
步骤1：计算富集积分（Enrichment Score，ES）
我们计算出一个富集积分值（ES），其为S的基因超表达在整个L序列的头部和尾部的多少。
积分值的计算是从L序列的头部开始往尾部走，每当遇到一个基因是在S上就加分，没有则减分。加分的分值大小根据基因表型相关系数大小。富集分值是从没有遇到的时候开始计算直到最大值误差值；而且它还与K-S test统计加权值有关。
步骤2：估计ES的显著程度
我们估计统计学上有意义部分的ES值（名义上的P值），是通过一个经验基础表型方法——置换检验，保存基因表达数据的结构的复杂相关系数。明确地，我们置换不同表型标签下的数据，并且再一次计算ES值，使之形成一个新的ES分布（假分布）。从经验上说，交换之后，ES的P值相对于新的ES值（统计分布）来说若是显著的变化，则有理由说明此基因集是有一定的生物学意义的。
步骤3：多重假设检验的调整
当评估了所有基因探针数据之后，我们会用多重假设检验来评价它们的显著性。我们首先把每一个探针的ES值做根据探针多少的一个标准化，生成一个标准化富集积分值（NES）。之后我们计算出假阳性发现率（FDR），并以此划出假阳性部分对应每一个NES值。FDR是评估一个NES表达值中所发现的假阳性可能性大小；它是由NES的观测值和零分布时比较得出的。
以上几步的实行细节在附录里面有更详细的说明。（在相关出刊物和PNAS网页上也有支持文件。）
我们注意到GSEA方 法中很重要的几步跟初始版本很不一样了。在原始版本中，统计表达值总和的时候，我们用的是平均权重的方法，这样探针会被认为富集在列表中间，则使高分段集 中在列表中部。这样子的探针分布不能代表出跟表型相关的生物学意义。所以我们改变权重加权方式为与表型的相关性。这样就会发现，ES值会偏差于一两种表型上了。因此我们评估显著性以此来分离阳性与阴性功能基因集。
我们初始运用了一个不同以往的交换方法，叫做FWER，来纠正多重假设检验。FWER是一种保守的修改方法，所以会保证没有一个假阳性的基因探针值。但是这种标准实在太过保守以至于很多程序产生了没有显著的统计结果。因为我们的初衷是产生一个假设能够成立（译者注：霸王硬上弓。。。），所以我们更倾向于用FDR来控制报告假阳性的可能性（译者注：更上弓。。。）。
根据统计分析和实际评测，确定了GSEA拥有很广的适用性。它能侦测出很稀薄的富集信号并保持为原来样本结果中氧化磷酸化通路的富集情况（P=0.008,FDR=0.04）。这个技术已经包含在一个工具软件GSEA-P中了。（继续生意。。。）

其实，还有附录部分的具体数学计算过程，需要的直接pm我吧。。。

附录：GSEA方法的数学描述
计算条件
1.设表达数据D中有N组基因并有k个样本。
2.把N组基因按照相关系数（或别的判断标准）和表型或表达列出序列L。我们只用一个基因一个探针作为保护统计富集积分过高的估计问题出现。
3.用一个指数p来控制每一次的加权值。
4.一个独立的基因组Nh取自S基因集。在分析层面（微阵列）上，我们只研究那些有至少15个基因控制的部分，以此加强信号。

富集积分ES（S）
1.根据相关系数函数，计算出的N个值，把所得值按大小排出一个序列。
2.计算出现在S的（“hits”）和不在S上的（“miss”）。

ES最大的误差值为当等于零时。当随机的取基因集S，ES（S）将会相对的非常小，但是如果其聚集在L的尾部或者顶端，或者S是一个普通的分布，将会有一个很大的ES（S）值。当p=0（指数）的时候，ES（S）将会减变为标准Kolmogorov-Smirnov统计分布（这是一个判别两个不知分布的总体是否有同一分布的非参数检验）。当p=1时，式子的意义就是在整个S基因集上的来计算相关系数（我们在例子上就是用这个值的）。

多重假设实验
1.确定每一个基因集的ES（S）。假定有1000个ES（S）。
2.为每一个基因集S，在L序列上做1000次的随机置换（互换表型位置的），由此得出
ES（S，π）。则总共做1000*1000次置换。
3.调整含有不同变量的基因集大小到一致，将会把ES（S，π）和ES（S）标准化。就是先分别求出1000*1000个的ES（S，π）中同符号的总均值M1和M2（若富集在L的底部则为负）。之后分别求出各自NES（S）和NES（S，π）。
公式如下，NES（S)=ES（S）/M1或M2   NES（S，π）=ES（S，π）/M1或M2
4.计算FDR。控制假阳性比率使所以基因集分别达到NES（S）和NES（S，π）所固定的显著性水平。
创造一个有全部S和π的NES（S，π）频数直方图，在给定的NES(S)=NES * ≥ 0条件下（此条件即为显著性范围），计算新函数分布的FDR的q值。

计算如下：
1）设有R
             则：

本式子意义：大于设定的显著性范围的NES（S，π）占总NES（S，π）的比例，也就是假设中置换后平均出现阳性的比率。

2）设有T
则：

本式子意义：大于设定的显著性范围的NES（S）占总NES（S）的比例，也就是所有假阳性和真阳性同时出现的比率。
3）FDR的q值就是

至此，论文部分的计算就结束了，为了方便大家，今给出FDR的计算方法。（原文在wikipedia上）

上表为多重假设实验给出的值。
·  m0 原真假设
·  m ? m0 假原真假设
·  U 真阴性值
·  V 假阳性值
·  T 真阴性值
·  S 真阳性值
FDR的计算方法就是如下：

                                                                                                             BY   Z.weiwei