苹果多酚提取物对_淀粉酶和_葡萄糖苷酶的抑制作用.pdf

果 树 学 报2011，28（4）:553557Journal of Fruit Science苹果多酚提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用刘杰超，焦中高，王思新（中国农业科学院郑州果树研究所，郑州450009）摘要:对苹果多酚提取物中的酚类物质进行HPLC分析，并分别以可溶性淀粉和4-硝基酚-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）为底物测定了苹果多酚提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。结果表明，苹果多酚提取物中含有没食子酸、原儿茶酸、儿茶素、绿原酸、表儿茶素、芦丁、根皮苷等酚类物质；苹果多酚提取物对-淀粉酶具有较强的抑制作用，在试验浓度范围内（0.0715.357 gL-1），其最大抑制率为88.01%，IC50为1.48 gL-1；苹果多酚提取物还是-葡萄糖苷酶的强抑制剂，2.35 mgL-1苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶的抑制率即可达96.62，其IC50为0.72 mgL-1。动力学分析结果显示苹果多酚提取物对-淀粉酶的抑制作用为竞争性抑制，对-葡萄糖苷酶表现为非竞争性抑制类型。关键词：苹果多酚提取物；-淀粉酶；-葡萄糖苷酶；抑制中图分类号：S6611文献标识码：A文章编号：10099980(2011)0455305Inhibitory effects of apple polyphenol extracts on-amylase and-glu-cosidaseLIU Jie-chao，JIAO Zhong-gao，WANG Si-xin（Zhengzhou Fruit Research Institute，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Zhengzhou，Henan 450009 China）Abstract:The phenolic compounds in apple polyphenol extracts were analyzed by high performance liquidchromatography（HPLC），and the inhibitory effects of apple polyphenol extracts on the activity of-amy-lase and-glucosidase were examined by using starch and PNPG as substrate respectively.Several phe-nolic compounds，including gallic acid，protocatechuic acid，catechin，chlorogenic acid，epicatechin，lutin and phlorizin，could be detected in the apple polyphenol extracts.In addition，the results indicatedthat the apple polyphenol extracts exhibited certain inhibitory effect on-amylase with an IC50value of1.48 gL-1，and the maximum inhibitition percentage was 88.01 in the range of test concentrations from0.071 to 5.357 gL-1.Besides，the apple polyphenol extracts were also a potent-glucosidase inhibitorwith an inhibitory rate of 96.62%at concentration of 2.35 mgL-1and an IC50of 0.72 mgL-1.The kineticanalysis showed that the inhibition of apple polyphenol extracts on-amylase was competitive，and theinhibition on-glucosidase was noncompetitive.Key words:Apple polyphenol extracts；-amylase；-glucosidase；Inhibition-淀粉酶和-葡萄糖苷酶是影响饮食中淀粉等主要碳水化合物消化、吸收的关键酶，抑制其活性可以延缓人体对淀粉等物质的降解和葡萄糖的吸收，从而抑制餐后血糖的快速升高。因此，-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制剂常被用于治疗II型糖尿病，可有效降低餐后血糖水平和减少糖尿病并发症的发生1-2。由于化学合成药物毒副作用较大，易对糖尿病病人造成其他伤害，因此人们更多地从天然产物中寻找高效的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制剂3，而从日常食用的水果、蔬菜、茶叶、谷物等植物性食物以及中草药中寻找天然的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制剂更成为研究的热点4-12。多酚物质是苹果中重要的生物活性成分之一，但由于其与苹果汁的褐变及后混浊密切相关而严重收稿日期：20100517接受日期:20110309基金项目：河南省重大科技攻关计划资助项目（0522010700）作者简介：刘杰超，女，助理研究员，硕士，研究方向为果品营养与保鲜加工。Tel:[phone]，E-mail:果树学报28卷影响苹果浓缩汁的感官品质和理化稳定性13。因此，在苹果浓缩汁生产过程中常需除去其中的多酚物质以防止发生褐变及后混浊。为了充分利用苹果多酚资源，我们对苹果汁中多酚物质的分离提取进行了研究，初步提出了一条与苹果浓缩汁加工工艺相结合的多酚提取工艺技术路线14，并且在此基础上进一步对按照该工艺制备的苹果多酚提取物的酚类组成进行HPLC分析，并对其-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制活性进行研究，以期为苹果多酚提取物的应用开发提供参考和依据。1材料和方法1.1材料与试剂苹果多酚提取物（APPs），根据文献14的工艺制备。试剂：酵母-葡萄糖苷酶、猪胰-淀粉酶、4-硝基酚-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）以及没食子酸（gallic acid）、原儿茶酸（protocatechuic acid）、绿原酸（chlorogenic acid）、咖啡酸（caffeic acid）、阿魏酸（ferulic acid）、儿茶素（+）-catechin、表儿茶素（-）-epicatechin、肉桂酸（cinnamic acid）、鞣花酸（ellagicacid）、槲皮素（quercetin）、芦丁（lutin）、根皮苷（phlo-rizin）等12种酚类标准品均购自Sigma公司，甲醇、磷酸为色谱纯试剂，分别购自山东禹王集团和美国迪马公司，其他均为国产分析纯试剂。1.2仪器与设备Waters高效液相色谱仪（配1525二元泵、2487双 通 道 紫 外 检 测 器、Breeze色 谱 管 理 软 件 等）、SPECORD 50型紫外/可见分光光度计（德国Ana-lytik Jena AG）、BS214D电子天平（德国赛多利斯）、PHS-3C型数字酸度计（上海精密科学仪器有限公司）、KQ3200DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、RE52A旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）、恒温水浴锅等。1.3酚类物质HPLC分析条件色谱柱：Waters Symmetry C18柱（4.6150 mm，5m），紫外检测波长280 nm和320 nm，柱温30，进样量10 L，流速0.6 mLmin-1，流动相A为甲醇，流动相B为超纯水（用磷酸调pH为2.6）。梯度洗脱程序：0 min 15 A，15 min 25A，25min 25A，60 min 55A，70 min 15A，梯度均为线性变化。1.4-淀粉酶活性抑制试验-淀粉酶的活性测定根据Udupa等15的方法略作改动。100 L不同浓度样品溶液与100 L淀粉酶溶液（5 mgL-1）在室温下预混合10 min后，加入200 L 0.5%可溶性淀粉溶液起始反应，反应所用缓冲液为1 mL 25 mmolL-1pH=6.8的磷酸盐缓冲液。反应混合液于37 反应5 min后，加入1 mL DNS试剂中止反应，反应液置沸水浴中5 min后于冰水浴中迅速冷却，加3 mL蒸馏水稀释后测定540 nm吸收值，同时做样品对照。IC50为酶活性被抑制50%时的抑制剂浓度。每试验重复3次。1.5-葡萄糖苷酶活性抑制试验以PNPG为底物16测定苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶的抑制作用。不同浓度样品溶液与-葡萄糖苷酶（0.1 U）预混合后，加入1 gL-1谷胱甘肽100 L，混匀后加入10 mmolL-1PNPG起始反应，反应所用缓冲液为pH=6.8的磷酸盐缓冲溶液。反应混合液于37 反应10 min后，加入2 mL 0.1 molL-1Na2CO3溶液终止反应，用分光光度计测定400 nm处的吸收值，同时作样品对照。IC50为酶活性被抑制50%时的抑制剂浓度。每个试验重复3次。1.6动力学分析方法在其他反应条件一定，改变底物浓度，添加或不添加苹果多酚提取物的条件下，测定酶促反应速度，以1/v对1/S作图，得到Lineweaver-Burk曲线，确定抑制类型。2结果与分析2.1苹果多酚提取物的HPLC分析在实验条件下，多酚标样及苹果多酚提取物样品的色谱图见图1。苹果多酚提取物质量均为干质量。根据标准曲线，苹果多酚提取物中含有没食子酸（1.95 mgg-1）、原儿茶酸（10.38 mgg-1）、儿茶素（13.47 mgg-1）、绿原酸（129.38 mgg-1）、表儿茶素（63.35 mgg-1）、芦丁（69.79 mgg-1）、根皮苷（25.6mgg-1）等。2.2苹果多酚提取物对-淀粉酶的抑制效果由图2可以看出，在实验质量浓度0.0715.357gL-1，苹果多酚提取物对-淀粉酶均具有一定的抑制作用，并且其抑制效果与质量浓度具有量效关系。在实验条件下，其IC50为1.48 gL-1，苹果多酚提取物质量浓度为5.357 gL-1时，抑制率可达88.01%。因此，苹果多酚提取物为较好的-淀粉酶抑制剂。2.3苹果多酚提取物对-淀粉酶抑制作用的动力学分析为确定苹果多酚提取物对-淀粉酶的抑制类5544期?APPsno APPs图2苹果多酚提取物对-淀粉酶的抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of apple polyphenol extractson amylase图3苹果多酚提取物对-淀粉酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.3 Lineweaver-Burk plot for inhibition of applepolyphenol extracts on-amylase刘杰超等:苹果多酚提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用型，固定-淀粉酶浓度，在不添加和添加苹果多酚提取物（0.312 5 gL-1）条件下，测定了不同淀粉质量浓度（1.256.25 gL-1）下反应体系的反应速率，绘制的Lineweaver-Burk曲线如图3所示。由图3可以看出，和无抑制剂时相比，当苹果多酚提取物存在时，-淀粉酶催化的淀粉酶促反应的Km变大，但Vmax基本不变，因此推测苹果多酚提取物对-淀粉酶为竞争性抑制作用类型。2.4苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶的抑制效果在底物浓度为0.177 5 mgL-1条件下，测定了不同浓度苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶的抑制作用。由图4可以看出，在试验浓度0.1189.47 mgL-1，苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶有明显的抑制作用，其抑制效果在低浓度范围内具有良好的量效关系，2.35 mgL-1苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶的抑制率即可达到96.62，苹果多酚提取物浓度的继续图1多酚标样（A）及苹果多酚提取物样品（B）色谱分析1.没食子酸；2.原儿茶酸；3.儿茶素；4.绿原酸；5.咖啡酸；6.表儿茶素；7.阿魏酸；8.芦丁；9.鞣花酸；10.根皮苷；11.肉桂酸；12.槲皮素Fig.1 Chromatogram of polyphenol standards（A）and apple polyphenol extracts（B）1.Gallic acid；2.Protocatechuic acid；3.Catechin；4.Chlorogenic acid；5.Caffeic acid；6.Epicatechin；7.Ferulic acid；8.Lutin；9.Ellagic acid；10.Phlorizin；11.Cinnamic acid；12.Quercetin 123456789101 112A U0.000.050.100.150.20m inutes10.020.030.040.050.060.0 12346810AU0.00.10.20.3minutes10.020.030.040.050.060.0AB时间Time/min时间Time/min吸光度单位AU吸光度单位AU?抑制率Inhibitory rate/%APPs质量浓度Concentration of APPs/（gL-1）1/v1/S10.020.030.040.050.060.010.020.030.040.050.060.00.30.20.10.00.200.150.100.050.00APPSno APPs555果树学报28卷?图5-葡萄糖苷酶的Lineweaver-Burk曲线Fig.5 Lineweaver-Burk plot of-glucosidase?抑制率Inhibitory rate/%APPs质量浓度Concentration of APPs/（mgL-1）图4苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶的抑制效果Fig.4 Inhibitory effect of apple polyphenol extractson-glucosidase?增加几乎可全部抑制-葡萄糖苷酶的活性。在试验条件下，其IC50为0.72 mgL-1。因此，苹果多酚提取物为较强的-葡萄糖苷酶抑制剂。2.5苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶抑制作用的动力学分析固定-葡萄糖苷酶的浓度，在添加或不添加苹果多酚提取物（2.35 mgL-1）条件下，改变底物PNPG的浓度（0.035 50.248 5 gL-1），测定了不同PNPG浓度下反应体系的反应速率，得到-葡萄糖苷酶在有无苹果多酚提取物存在时的Lineweaver-Burk曲线。由图5、图6可以看出，和无抑制剂时相比，当苹果多酚提取物存在时，-葡萄糖苷酶催化的PNPG酶促反应的Vmax大大降低，而Km基本保持不变，因此推测苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶属非竞争性抑制作用类型。3讨论多酚物质是水果中的重要活性成分，由于具有良好的抗氧化和自由基清除活性而受到广泛关注17-18。进一步研究表明，一些植物的多酚组分可改变哺乳动物对葡萄糖的利用，具有胰岛素效应。Kwon等10研究了不同种类茶叶和葡萄酒对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用及其与酚类含量的关系，证实其-葡萄糖苷酶抑制活性与所含有的可溶性酚类物质有关。蓝莓、树莓、草莓、黑醋栗等的提取物具有较强的-淀粉酶和-葡萄糖苷酶抑制活性，其活性成分分别为单宁类和花色苷类5。茄子的多酚提取物可强烈抑制-葡萄糖苷酶的活性19，海松树皮提取物中的低聚原花青素可有效抑制-葡萄糖苷酶的活性20，洋葱提取物中抑制-葡萄糖苷酶的活性成分是槲皮素等酚类物质7，荚蒾果实中的活性成分主要是矢车菊素-3-接骨木二糖苷和5-咖啡酰奎宁酸21，儿茶素、表儿茶素、原儿茶酸、咖啡酸、香豆酸、绿原酸、白藜芦醇等酚类物质都具有一定的-葡萄糖苷酶抑制活性10，22。因此推测苹果多酚提取物中较高含量的绿原酸、儿茶素、槲皮素等在酶活性抑制中起重要作用，提取物中酚类物质恰当的羟基构象可能有利于其与酶的结合，如儿茶素结构中的3-OH和B环上的羟基取代增加了它的抑制活性。本研究通过体外试验研究表明，苹果多酚提取物可强力抑制-葡萄糖苷酶的活性，并对-淀粉酶具有一定的抑制作用，说明该提取物中的不同组分可能对淀粉酶促水解直至生成葡萄糖的整个过程的不同阶段产生影响，从而可有效延缓单糖的释放和吸收，抑制餐后高血糖。此外，苹果多酚提取物中的根皮苷可专一性地抑制小肠粘膜细胞和肾小管上皮细胞中的钠离子-葡萄糖联合转运体（Sodium-glucose co-transporter，SGLT1和SGLT2）对葡萄糖的运输，阻止人体对葡萄糖的吸收，从而降低糖尿病人的血糖水平和波动程度23-24。苹果多酚提取物同时还是一种优良的抗氧化剂和自由基清除剂25，因此还可能起到减少糖尿病患者因体内自由基代谢失衡而造成的胰腺细胞凋亡26和糖尿病、肾病、血管病变、神经病变等并发症的发生27-28的作用。因此，与目前广泛应用于临床治疗糖尿病的阿卡波糖不同，苹果多酚提取物可能在多方位、多靶点综合产生药效1/S1/v1/S图6苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶抑制作用的Lineweaver-Burk曲线Fig.6 Lineweaver-Burk plot for inhibition of applepolyphenol extracts on-glucosidase5 0004 0003 0002 0001 000-10-1 0000102030080604020-2010203000-101/v5564期刘杰超等:苹果多酚提取物对-淀粉酶和-葡萄糖苷酶的抑制作用而对糖尿病及其并发症进行积极有效的预防和治疗，从而对糖尿病人起到很好的保健作用。抑制剂对酶具有较强的选择性，因此对于不同种类酶促反应以及不同来源酶的作用效果与机制可能不同，而且受作用环境的影响也较大。苹果多酚提取物对-葡萄糖苷酶表现出极强的抑制作用，而对-淀粉酶却仅有中等的抑制效果，而且对2种酶表现出不同的抑制动力学模型，充分证明了苹果多酚提取物作为抑制剂对酶的选择性。参考文献References：1 PULS W，KEUP U.Influence of-amylase inhibitor（BAY d7791）on blood glucose，serum insulin and NEFA in starch loading tests inrats，dogs and manJ.Diabetologia，1973，9:97-101.2PULS W，KEUP U，KRAUSE H P，THOMAS G，HOFFMEISTERF.Glucosidase inhibitor.A new approach to the treatment of dia-betes，obesity，and 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