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自动生化分析仪自动识别免疫比浊分析中的钩状效应
【提　要】　目的　探讨全自动生化分析仪上识别钩状效应的方法.方 法　以IgG为检测对象，在HITACHI-7170A型全自动生化分析仪上，抗原抗体反应10 分钟，利用定时监测-时间反应进程曲线，分析其变化特征，选择钩状效应的识别参数 .结果　以反应时间(读点)20点的反应完成率(ABS20/ABS34)>0.9 0为限额参数，可自动识别钩状效应.结论?免疫比浊测定分析中 的钩状效 应，可通过正确的参数设置自动识别.时间反应进程曲线是识别钩状效应的基础， 反应率是识别钩状效应的有效方法.
【关键词】　免疫　比浊法　钩状效应　抗原　抗体
［中图分类号］　R 392-33　　　　［文献标识码］　A　　　［文章编号］　1008-634X(2000)04-0252-03
Automatic Check Method of Hook Effect in the Immunoassay with Automatic Clinical Chemistry Analysis
LIU Zhong-min　GAO Yue-ting　CHEN Tao
（Department of Laboratory,First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical College ,Guangzhou　510120 China）
【Abstract】　Objective　To obtain automatic checck method of hook effec t in the turbibimetric immunoassay with automatic clinical chemistry analysis.Methods　With model 7170A automatic clinical chemistry analyzer，the method and value of automatic check o f hook effect was obtained by assaying absorbance of immune complexes produced by which IgG of different concentratoin reacted with antibody for 10 minutes and t raced the relationship between the quantity of antigen and absorbance,and by an alyz ing charactreistics of reaction monitor curve of immunofraction and tracing the relationship between the quantity of antigen and hook efect,and by calculating c heck value of the hook effect.Results　The hook effect could be detected by aut omatic clinical analyzer if value,reaction rate of the 20th measurement point(AB S20/ABS34),was lower than 0.9.Conclusions　The c heck of ho ok effect in immunoreaction were performed by setting correctly limited value.R eaction monitor curve of immunoreaction was the basis of check of hook ef fect.T he comparison of reaction was a kind of effective method of the check of hoo k effect.
【Key Words】　Immunoassay;　Turbibimetric;　Hook effect;　Ant igen;　Amtibody
　　免疫测定是利用抗原抗体反应检测标本中微量物质的方法.基于抗原抗体反应的敏 感性和 特异性，免疫测定的范围遍及医学检验的各个领域.任何物质只要能获得相应的特 异性 抗体，即可用免疫测定进行检测.抗原抗体反应是按一定的分子比例结合，当二者 比例适中 时，形成的免疫反应最强烈；当抗原或抗体过量时，免疫反应都将减弱［1］. 因此 ，在自动生化分析仪上，正确判断抗原抗体反应体系中抗原与抗体的比例状态，识别钩状效 应(hook effect)是否存在，直接关系到物质测定的准确性.本文以IgG为例，在全 自动生 化分析仪上，探讨利用定时监测-时间反应进程曲线的变化特征，正确设置自动识别钩状效 应参数的方法.
1　材料与方法
1.1　参考物　免疫比浊法测定用C.f.a.s特种蛋白定标液，批号：19461304～1355279 ，德国Boehringer Mannheim公司产品，IgG参考定标值20.6g/L.
1.2　试剂　全液体IgG免疫比浊法测定试剂盒，上海玉兰生物技术研究所生产. 
1.3　仪器　HITACHI 7170A型自动生化分析仪，日本Hitachi公司生产.
1.4　方法　免疫透射比浊法，自编测定程序.
1.5　主要参数　Cali.type:logit-log4P;Cali.Poin t:6;STD1 CONC.:0.00;STD2-6 CONCassigned value;Temperture：37℃;Reac tion time:10min;Assaymode:2Point End;Assay Point:1～34;Wave(Sub/Main):700/340;Sa mple Vol(μl):5-10-195;Reagent Vol:250;Unit:g/L;Expected Value:8.0～16.0;Inst[ BFQ].Factor:1.0;Technical Limit:0.1～3.0;SD Limit:0.1;Duplicate Limit:10 0;ABS.Limit:12000
2　结果与讨论
2.1　剂量反应曲线与钩状效应分析　采用稀释和增加样本(抗原)用量的方法，获得一系列 IgG浓度值为0、2.06、4.12、6.18 、8.24、10.3、20.6、30.9、41.2、51.5、103.0、154.5、206.0、257.5、309 .0、360.5、412.0、463.5、515.0、566.5、618.0、669.5g/L的溶液，用免疫透射 比浊法测定抗原抗体反应免疫复合物的生成量.以IgG浓度为横坐标，吸光度值ABS 为纵坐标绘制IgG剂量反应曲线图，结果(见图1).

图1　IgG剂量反应曲线图
Fig.1　IgG dose-effect relation curve
　　从图1可以看出，免疫透射比浊测定IgG的剂量反应曲线是一条双相反应曲线，即在恒定剂量 的抗体溶液中加入不同剂量的抗原时，免疫复合物的生成量起初随抗原剂量的增加而增加 ；当达到峰值后，生成量随着抗原剂量的进一步增加反而减少.抗原抗体反应这一 独 特的现象可以用著名的“Heidel berger曲线”来描述［2］.曲线左侧为 抗体过剩 的测定区又称为前带，中间为抗体抗原浓度大致相等的等当量区又称为等价带，右侧为抗原 过剩区又称为后带.当抗原抗体比例由抗体过剩到抗原过剩时，免疫复合物的生成 量由上 升到下降，剂量反应曲线呈钩状的现象，即为钩状效应.高剂量钩状效应使强阳性 标本误测 为弱阳性，以至假阴性结果.因此，高剂量钩状效应是免疫比浊测定中必须重视的 问题.
2.2　时间反应进程曲线与反应率分析　以IgG剂量反应曲线的拐点(顶点)为界，测定拐点 左侧抗体过剩区和拐点右侧抗原过剩区抗 原抗体反应10分钟，34个读点的吸光度值，绘制成时间反应进程曲线，观察不同的IgG浓度 值标本的吸光度值随时间变化的特征，结果(见图2和图3).

图2　抗体过剩时的时间反应进程曲线
Fig.2　Antibodyexcess zone reaction monitor curve

图3　抗原过剩时的时间反应进程曲线
Fig.3　Antigenexcess zone reaction Monitor curve
　　由于7170A型全自动生化分析仪的程序设置可分别在0、5、16、33读点加试剂，故以这些点 表述时间反应进程曲线的特征.由图2可知，由于抗体过剩，5、16、33读点的吸光 度值随抗原浓度增加而增加；其中， 5点之内的吸光度值增加迅速，16点时反应完成率(ABS16/ABS34)较高，其后的 反应线较平直.而在图3中，由于抗原过量，使抗原抗体反应比例失调，免疫反应 减弱，5、 16、33点值随抗原浓度增加而降低；其中，5点之内的吸光度值增加减缓，16点的反应完成 率也逐渐下降.与图2比较，反应曲线有明显变化，曲线前段逐渐变得平坦，曲线 后段向上 延伸明显.由此可见，抗原过量时反应完成率下降，是测定过程中出现假性低值、 影响临床 对病情诊断的原因.正确认识和理解钩状效应前后时间反应进程曲线的变化特点， 是正确识别钩状效应是否存在的基础和方法.
2.3　检查钩状效应的方法选择　比较图2、图3时间反应进程曲线可以看出，抗体过剩区内，不同IgG浓度值的抗原抗体快速 反应期的反应速率(ΔA=ABSx+1-ABSx,X≤5)和各个读点的反应完成率(ABSx/ABS 34)均较抗原过剩区高.因此，可用计算快速反应期反应速率或反应完成率的 方 法判断钩状效应.但由于计算反应完成率法较计算反应速度法更简单、有效，故建 议采用计算反应完成率法.
2.4　检查钩状效应时间读点的选择　分别选取剂量反应曲线拐点左侧区内IgG浓度值为2.06、4.12、6.18、8.24、10.3、20 .6、30.9、41.2、51.5、103.0g/L的溶液，反应时间10min.由低到高分别求 出不同IgG浓度值的34个读点的反应完成率(ABSx/ABS34).
　　通过分析图2和计算的各读点反应完成率发现，不同IgG浓度值的反应完成率均随反应时间的 增加而增加；但在相同反应时间时，反应完成率有明显差异，且20读点以后的反应完成率均 >0.90.这说明，虽然所有的反应时间点都可以作为钩状效应检查的时间点，但如 果以反应完成率达到0.90为检查点，检查的时间点应以20读点为好.

2.5　检查钩状效应的限额参数计算　分别选取剂量反应曲线拐点左侧和右侧不同IgG浓度值的溶液，反应时间10min.由 低到高分 别求出不同IgG浓度值第20读点的反应完成率.其反应完成率分别为：拐点左侧：0 .90、0 .92、0.92、0.91、0.93、0.94、0.94、0.95、0.94、0.92；拐点右侧：0.89、0 .86、0.81、0.78、0.75、0.73、0.70、0.68、0.65、0.67、0.69.由 此可见， 剂量反应曲线拐点左侧不同IgG的浓度值的反应完成率均≥0.90；而拐点右侧不同IgG浓度 值的反应完成率均<0.89.因此，0.90可作为自动别钩状效应的限额参数.
2.6　有效工作剂量范围的确定　由于抗原抗体剂量反应曲线不是直线，用确定直线线性范围的方法，不适用于确定抗原抗体 免疫反应的有效工作剂量范围，较理想的方法是用变异系数对分析物浓度绘制密 度图(又称P-P图)，用最低可接受的精密度确定工作范围［3，4］.剂量 反应曲线 拐点左侧区内各浓度点的精密度图(见图4).由图4可看出，IgG的有效工作剂量范 围在4.12～41.2之间.低于或高于此范围浓度的样品，必须加倍或稀释后再测定 .
　　综上所述，抗原过量引起的钩状效应是免疫透射比浊测定中首先要解决好的问题. 用手工或 仪器对样本进行前稀释或使用双份标本或用蛋白质试纸预测等方法，也可解决抗原过量问题 .但是，这些方法有时会导致抗原含量过低，造成抗体绝对过量，影响测定结果的 准 确性，或增加工作量和试剂成本而使其应用受到限制.因此，对有条件的实验室， 在全 自动生化分析仪上，应准确设置这些参数，自动识别钩状效应，以确保测定结果的准确性.

图4　IgG测定精密度图
Fig.4　Precision curve of IgG measurement
刘忠民（广州医学院第一附属医院检验科　广州　510120）
高月亭（广州医学院第一附属医院检验科　广州　510120）
陈涛（广州医学院第一附属医院检验科　广州　510120）
参考文献
1，陶义训，储迅淘.免疫透射技术的进展及其在生化分析仪上的应用［J ］.临床检验信息，2000，7(1)：6
2，杨振修.免疫浊度测定法［J］.上海医学检验杂志，1997， 14(4)：239
3，Robert S,Serum TM.Immunoassay Development［M］.In:J ames PG,Lw rence VB.Laboratory analysis and clin appliations.Ist edition. New York:Newton,1994,257
4，尹伯元，王仁芝，李振甲 等.标记免疫学［M］.第1版.北 京：原子能出版社，1998，120