PMSG及GnRH类似物对鸡卵泡闭锁的调节作用.pdf

畜牧兽医学报,1999,30(1),1-5A cta Veterinaria et Zootechnica SinicaPMSG 及 GnRH 类似物对鸡卵泡闭锁的调节作用a李莹辉(航天医学工程研究所,北京 100094)汪琳仙杨传任(中国农业大学生物学院)摘要本文利用激素诱导的鸡卵泡闭锁模型,探讨了激素在卵泡闭锁中的作用。研究结果表明:PMSG和GnRH类似物LRH-A3均能诱导鸡卵泡闭锁,诱导的卵泡闭锁率分别为 48%和 42%;闭锁卵泡的形态学、组织学特征明显,类固醇激素合成能力发生逆转,孕酮和雌二醇比值(P/E2)显著升高;闭锁卵泡细胞的小分子量DNA呈现典型的Apoptosis特征。体外培养条件下,FSH和次黄嘌呤能抑制卵泡自发性 Apoptosis,PRL 不能诱导体外培养的鸡卵泡发生 Apoptosis,提示抱窝和注射外源PRL引起的卵泡闭锁可能不是PRL直接作用于卵巢的结果。关键词催乳素,PMSG,GnRH类似物,鸡,卵泡闭锁卵泡闭锁是卵泡发育中必然出现的普遍现象。禽类生产中,闭锁卵泡的数量直接影响产蛋率的高低,闭锁卵泡少的个体进入等级卵泡的卵泡数增多,产蛋序列延长,产蛋率增加。具有抱窝习性的品系产蛋率相对较低 1。因此了解禽类卵泡发育特点、探讨卵泡闭锁机制,降低卵泡闭锁率在禽类生产实践中具有重要意义和经济价值。催乳素(PRL)升高诱导的抱窝鸡中,有大量卵泡闭锁 2提示 PRL 可能在诱导鸡的卵泡闭锁中具有一定作用。本文利用建立的鸡卵泡闭锁模型,从整体和离体两方面探讨了一些激素对卵泡闭锁的调节作用。1材料与方法1.1动物健康,正在产蛋的白莱航鸡,由中国农业科学院畜牧研究所种鸡场提供。1.2药品199 培养液 Gibco 公司产品;表皮生长因子(EGF)、次黄嘌呤(HypoxanthineHX)、胰岛素(Ins)、转铁蛋白(Tf)、谷胺酰胺(Glu)均为 Sigma 公司产品;羊促卵泡素(oFSH)美国国立卫生研究院的国家激素和垂体机构(NAPP)赠送。羊催乳素(oPRL)北京农业大学生理教研室制备。孕马血清促性腺激素(PMSG)天津医药生物制品厂生产。GnRH 类似物 LRH-A3宁波市激素厂生产。RIA 药盒由中科院动物所提供。1.3方法1.3.1整体条件下激素诱导的卵泡闭锁:选择健康、产蛋规律基本一致的白莱航鸡共 15 只,分 3 组,每组 5 只,在其一个产蛋周期开始的第二天进行处理,见表 1。1.3.2闭锁卵泡的形态及组织学观察:根据卵泡的形态特征,统计直径为 28mm 卵泡的闭锁率。制备卵泡的组织学切片,经HE 染色用于组织学观察。a*本课题为国家高等学校博士学科点专项科研基金资助项目。*收稿日期1997-06-25。表 1不同激素对鸡卵巢的处理方法Table 1Treatment methods of different hormones处理Treatment剂量(/100ul/次)Dose注射部位Place of injection注射次数T imes of injection处理时间(h)Treatment timeNaCl0.9mg颈部皮下(Subcutis of neck)196,72PMSG100IU颈部皮下(Subcutis of neck)196LRH-A3100Lg颈部皮下(Subcutis of neck)272(分别在 0,12h 注射)(Injection in the0,12h)1.3.3卵泡中类固醇激素含量测定:用 RIA 法测定体积基本相同的正常卵泡和闭锁卵泡匀浆液中孕酮(P)和雌二醇(E2)含量。1.3.4卵泡中 Apoptotic DNA 片段分析:参考 Hughen 的方法 3,分别提取正常卵泡和闭锁卵泡细胞中小分子量 DNA,经 1.8%的琼脂糖凝胶电泳,分析比较得到的 DNA 电泳带。1.3.5离体培养条件下 PRL 对鸡卵泡发生 Apoptosis 的影响:取 34mm 大小的新鲜卵泡,经洗涤后放入 24 孔培养板中(1 个卵泡/每孔),加入含有 Ins(10L g/ml)、T f(5L g/ml)和 Glu(2mmol/L)的 199 培养液 2ml,在含 5%CO2、95%空气,37水蒸气饱和的培养箱中培养,同时用不同剂量的 FSH、PRL 等处理卵泡 24h 后,提取卵泡细胞小分子量 DNA,观察比较卵泡细胞的 Apoptotic DNA 片段。2结果2.1不同激素对卵泡闭锁的影响注射 PMSG 和 LRH-A3均能诱导鸡的卵泡闭锁,见表 2。表 2体内条件下激素诱导的卵泡闭锁(个/只)Table2Follicular atresia induced by hormones in vivo(number/hen)对照组ControlPM SG处理组PMSG treatedLRH-A3处理组LRH-A3treated平均卵泡总数 TMean number of total follicles31.01.5839.42.2826.22.77平均正常卵泡NM ean number of normal follicles28.01.9220.61.6915.01.00平均闭锁卵泡 AMean number of atretic follicles3.01.4718.82.3911.20.68平均A/TSE(%)Mean of A/TSE10.01.848.02.0*42.21.3*与对照组相比,P 0.01。*Compared with control group,P 0.01正常对照组卵巢中 28mm 卵泡有自然闭锁现象,但闭锁率较低仅为 10%;排卵前卵泡(F1F5)按大小呈等级排列,有 812mm 正常卵泡 35 个,处理时间内日产蛋一枚PMSG12畜牧兽医学报30 卷处理组中 28mm 卵泡的闭锁率明显增加,为 48%;812mm 卵泡数略有增加(多为 46个),或闭锁或正常。LRH-A3处理组中,闭锁也集中发生于 28mm 卵泡,卵泡闭锁率为42%;812mm 卵泡数减少。实验组在药物处理 48h 后产蛋停止。2.2闭锁卵泡的形态及组织学特征闭锁卵泡的形态特征与闭锁程度有关。a.闭锁初期,卵泡一侧出现不规则皱褶,卵白线处有细小的结缔组织缢痕;b.中期,结缔组织缢痕将卵泡从中分为不完全对称的两部分,闭锁严重侧的卵泡膜皱褶增多、加深,卵泡表面有出血点;c.后期,缢痕处颜色变深,近似充血样,出血点扩大,卵泡凹陷加深(图 1)。卵泡组织 HE 染色切片显示:闭锁卵泡颗粒层着色较深,细胞内核固缩现象明显;颗粒层呈现绒毛样皱褶突起,凸向卵细胞内(图 2),皱褶突起的多少和核固缩现象与闭锁程度正相关。卵泡膜细胞层显著增厚。同一卵泡中,缢痕两侧闭锁程度不同的两部分其卵泡膜细胞层厚度不完全相同,闭锁严重侧的膜细胞层较厚。闭锁卵泡缢痕处主要为结缔组织样结构。在闭锁严重的卵泡中,结缔组织缢痕已将卵泡从中完全分隔开,成为两个圆环,借结缔组织相连(图3)。2.3卵泡中类固醇激素含量与正常卵泡相比,闭锁卵泡中 E2含量明显减少,P 含量显著增加(表 3)。表明闭锁卵泡中类固醇激素合成呈现 E2减少,P 增加的急剧变化。2.4闭锁卵泡中 Apoptotic DNA 片段分析提取闭锁卵泡和正常卵泡的小分子量 DNA,经琼脂糖凝胶电泳发现:闭锁卵泡中有 Apoptotic DNA 片段(图 4),Apoptotic DNA 片段大小与闭锁程度相关。闭锁初期卵泡中Apoptotic DNA 片段呈梯状排列于 185740bp 之间;而闭锁中后期卵泡的DNA 片段则以185370bp 居多。说明随闭锁程度加剧,小分子量 DNA 片段增多。表 3正常卵泡和闭锁卵泡中孕酮和雌二醇含量Table3Progesterone and estradiol concentration in nomal follicles and atretic follicles.pg/mg proteinPMSG 处理组PMSG treatedLRH-处理组LRH-A3treated卵泡种类(n=4)Type of follicles正常(N)Normal闭锁(A)Atresia正常(N)Normal闭锁(A)Atresia平均孕酮含量(P)M ean concentrationof progesterone262.865.2341.287.378.820.3221.529.3平均雌二醇含量(E2)M ean concentrationof estradiol234.820.0131.834.6142.829.490.828.9P/E21.070.152.690.45*0.570.163.581.1*与正常卵泡相比 P 0.01Compared with normal follicles P 0.012.5离体培养条件下 PRL对鸡卵泡发生 Apoptosis 的影响提取在 199 基础培养液中培养24h 后卵泡细胞的小分子量 DNA 进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示:培养 24h 后的卵泡细胞中出现Apoptotic DNA 片段,说明卵泡发生了自发性 Apoptosis;培养液中加入 100ng/ml FSH131 期李莹辉等:PMSG及GnRH类似物对鸡卵泡闭锁的调节作用图 1正常卵泡和闭锁卵泡a.正常卵泡b.闭锁卵泡Fig.1Normal follicle and atretic folliclea.Normal follicle,b.Atretic follicle图 2卵泡组织切片(HE 染色)a.正常卵泡(3.310)b.闭锁卵泡(2.510)t:卵泡膜细胞g:卵泡颗粒细胞Fig.2Section of follicular tissue(HE)a.Normal follicle(3.310)b.Atretic follicle(2.510)t:Follicular theca cellg:Follicular granula cell14畜牧兽医学报30 卷图 3卵泡组织切片(HE 染色 2.52)t:卵泡膜细胞,g:卵泡颗粒细胞,s:卵泡缢痕Fig.3Section of follicular tissue(HE 2.52)t:Follicular theca cellg:Follicular granula cells:Stigma of follicule图 4闭锁卵泡细胞中 DNA 片段的电泳分析N:正常卵泡M A:轻微闭锁GA:严重闭锁Fig.4 Electrophoretic analysis of DNAfragments in atretic folliclesN:Normal follicleMA:Mildly atretic fol-licleGA:Grossly atretic follicle图 5FSH、HX 和 PRL 对体外培养的鸡卵泡发生apoptosis的影响Fig.5Effect of FSH、FSH+HX and PRLin vitro on follicular internucleosomal DNAfragmentation151 期李莹辉等:PMSG及GnRH类似物对鸡卵泡闭锁的调节作用可使卵泡细胞中的Apoptotic DNA 片段减少,抑制自发性Apoptosis 发生。HX(1.4mmol/L)可加强 FSH 对卵泡 Apoptosis 的抑制作用。以 FSH 和 HX 处理组为对照,在抑制自发性Apoptosis 的基础上,加入不同剂量的 PRL(10103ng/ml)不能诱导出卵泡的 ApoptoticDNA 片段;延长培养时间至 36h、48h,卵泡逐渐失去弹性,在 DNA 凝胶电泳中呈现出 DNA降解带(图 5)。3讨论卵泡闭锁是卵泡发育中存在的普遍现象。由于卵泡发育过程受到内分泌、自分泌和旁分泌等多种因素的复杂调控,因此卵泡闭锁的确切机制尚不清楚。禽类卵泡在发育成熟过程中,形成独特的从小到大的严格等级排列,能够提供连续、处于不同成熟阶段的卵泡;卵泡颗粒细胞层和膜细胞层易于完全分离,有利于卵泡发育过程中不同卵泡细胞功能、卵泡细胞间相互作用及其基因表达变化的研究。同时禽类闭锁卵泡的形态特征明显,易于识别 4,根据形态特征就可判别其闭锁程度,因此可以为研究卵泡闭锁发生机制及深入了解卵泡发育过程中基因表达的变化,及其影响因素提供良好的实验模型。本实验中用注射 PMSG 或 GnRH 类似物的方法诱导鸡卵泡闭锁,方法简便易行、药物便宜易得,又能获得大量处于不同发育阶段和闭锁程度的卵泡,具有一定的实际意义。值得注意的是实验中发现,同一闭锁卵泡中的闭锁程度并不完全相同。由于有些闭锁卵泡缢痕(Stigma)处结缔组织增生皱缩,将整个卵泡分为不完全对称的二部分,其中一部分闭锁严重,卵泡细胞核固缩现象明显,膜细胞层显著增厚;而另一部分卵泡细胞的组织学特征则与正常卵泡基本相同,卵泡颗粒细胞的固缩核较少,膜细胞层也未见显著增生。导致这种现象产生的原因尚不清楚,是否与卵泡发育中局部区域的卵泡细胞对促性腺激素的敏感性变化有关,或由卵泡内局部因子调节造成?或许这将是一个有意义的研究内容。鸡闭锁卵泡中的这一特点也反映了禽类闭锁卵泡在研究卵泡闭锁机制所占有的独特优势。实验中 PMSG 和 GnRH 类似物虽都能诱导鸡的卵泡闭锁,但 PMSG 处理组中,小卵泡总数和闭锁卵泡数均高于对照组。提示 PMSG 诱导鸡卵泡闭锁的机制可能与大鼠中相似 5,注射 PMSG 后的第 13d,PMSG 能促进卵泡生长、发育,随后由于促性腺激素不能始终维持在较高水平,满足不了卵泡继续生长和发育的需要,导致卵泡闭锁现象的出现。注射 GnRH 类似物则使 28mm 卵泡数减少。表明 LRH-A3诱导卵泡闭锁的机制与PMSG 有所不同,LRH-A3在诱导卵泡闭锁的同时还抑制卵泡发育。在禽类,虽然注射外源 PRL 能诱发卵泡闭锁 6,而且抱窝引起的性腺萎缩与血液中 PRL升高,LH、睾酮及 E2减少相伴出现 7,8;但 Porter 也发现强制换羽诱导的卵泡闭锁发生时,血液中 LH 和 PRL 是同时降低的 9,10,因此 PRL 在抱窝和注射外源 PRL 诱导的卵泡闭锁中的作用值得探讨。由于整体研究中多因子相互作用的复杂性,这一问题始终没有得到明确结论。本实验,利用体外培养的鸡卵泡为对象,研究了 PRL 对体外培养的卵泡发生 Apoptosis 的直接作用,结果显示:FSH 能抑制体外培养的鸡卵泡自发性 Apoptosis,次黄嘌呤能加强 FSH 的抑制作用;PRL 不能在FSH 抑制卵泡自发性 Apoptosis 的基础上诱导产生 Apoptosis,表明在体外培养条件下 PRL 对鸡卵泡闭锁没有直接影响。由于 PRL 能下调卵泡细胞膜上的 LH 受体 11,抑制卵泡膜细胞的芳香化酶活性,使 E2合成减少 12,而卵泡细胞中 LH 受体的表达有16畜牧兽医学报30 卷赖于 E2的存在,同时 E2减少也影响垂体 LH 释放的正反馈调节,使 LH 释放减少 9;结合PRL 对鸡卵泡膜细胞功能的调节作用 13我们推测,PRL 升高时发生的鸡卵泡闭锁可能是通过 PRL 对卵泡细胞类固醇激素合成功能及细胞膜上 LH 受体的调节实现的。参考文献1Johnson PA,Wang Shuyin.Characterization of a source levels of plasmia immunoreactive inhibin duringthe ovulatory cycle of the domestic hen.Biol Reprod,1993,48:2622672Youngren OM,EI Halawani ME,Silsby JL,et al.Intracranial prolactin perfusion induces incubation be-havior in turkey hens.Biol Reprod,1991,44:4254313Hughen PM,Gorospe WC.Biochemical identification of apoptosis(programmed cell death)in granulosacells:evidence for a potential mechanism underlying follicular atresia.Endocrinology,1991,129:241524224Gilbert AB,Perry MM,Waddington D,et al.Role of atresia in establishing the follicular hierarchy in theovary of the domestic hen(Gallus domesticus).J Reprod Fert,1983,69:2212275Bill CH,Greenwald GS.Acute gonadotropin deprivation.A model for the study of follicular atresia.Biol Reprod,1981,24:9139216T abizadeh C,Brooks C.Modulation of ovarian cytochrome p45017A-hydroxylase and cytochrome aromatasemessenger ribonucleic acid by prolactin in the domestic turkey.Biol Reprod,1995,52:6006087EI Halawani M E,Silsby JL,Forster LK,et al.Ovarian involvement in the suppression of luteinizing hor-mone in the incubating turkey(Meleagris gallopavo).Neuroendocrinology,1993,58:35418Porter TE,Silsby JL,Behnke EJ,et al.Ovarian steroid production in vitro during gonadal regression in theturkey:.Changes associated with incubation behavior.Biol Reprod,1991,45:5815869Wang EA,Silsby JL,Ishii S,et al.Pituitary luteinizing hormone and prolactin messenger ribonucleic acidleves are inversely related in laying and incubating turkey hens.Biol Reprod,1992,47:59860210Porter T P,Silsby JL,Hargis BM,et al.Ovarian steroid production in vitro during gonadal regression inthe turkey.Charges induced by forced molting.Biol Reprod,1991,45:58759111Lane TA,Chen T T.Heterdagous down-modulation of luteinizing hormone receptors by prolactin:a flowscytometry study.Endocrinology,1991,128:1833184012Krasnow JS,Hickey GJ,Richards JS.Regulation of aromatase mRNA and estradiol biosynthesis in ratovarian granulosa and luteal cells by prolactin.Mol Endocrinol,1990,4132113李莹辉,汪琳仙,杨传任.催乳素对促性腺激素诱导的鸡卵泡膜细胞类固醇激素合成的抑制作用.中国兽医学报,1996,16:597601171 期李莹辉等:PMSG及GnRH类似物对鸡卵泡闭锁的调节作用EFFECT OF PMSG AND GnRH ANALOGUE ON THEFOLLICLE ATRESIA IN DOMESTIC HENLi Yinghui,Wang Linxian,Yang Chuanren(Institute of Sp ace Medico-Engineering,Beij ing 100094)(College of Biology,China Agricultural University)AbstractA model of hormone-induced follicular atresia in vivo from domestic hens was estab-lished for investigating the effect of hormones on follicle atresia.The result indicated thatboth PMSG and GnRH analogue(LRH-A3)could induce follicle atresia,the atresia rate in-duced by PMSG and LRH-A3was 48%2.0%and 42%1.3%,respectively.T here wereobvious morphological and histologicl criteria in the atretic follicles.A shift from estradiol(E2)to progesterone(P)synthesis was observed.Atretsia is also correlated with a decline inE2synthesis and concomitantly increased in P production.Apoptotic DNA fragmentation wasfound in atretic but not in healthy follicles.Using the small follicles(24mm)cultured in theserum-free medium,the regulation effect of FSH and PRL on follicular apoptosis in vitro wasexamined.It was found that FSH(100ng/ml)and hypoxanthine(1.4mmol/L)prevented thespontaneouse onset of apoptotic DNA fragmentation of the cultured small follicles.Follicularapoptosis could not been induced by PRL in vitro.This may suggest that the follicles atresiain vitro during incubation behavior or induced by adminstrating exogenous PRL may not bethe direct effect of PRL on ovary in domestic hens.Key wordsProlactin,PMSG,GnRH analogue,Hen,Follicular atresia18畜牧兽医学报30 卷