隐孔雀石绿半抗原与全抗原设计、合成及鉴定.pdf

生物工程食晶科学2 0 0 8,V 0 1 2 0,N o 0 72 6 3I II _ _ _ _ _ _ _ 隐孔雀石绿半抗原与全抗原设计、合成及鉴定沈玉栋，王宇，孙远明，雷红涛，王弘，肖治理(广东省高等学校食品质量安全重点实验室，华南农业大学食品质量安全研究所，广东广州s 1 0 6 4 2)摘要：从偶联位点、偶联活性基团的性质及半抗原的合成与偶联方法分析，设计了系列不同结构的半抗原和人工抗原及其合成方法。以N，N 二甲基苯胺、苯甲醛衍生物为原料，A m b e r l y s t1 5 树脂为催化剂，在温和条件下合成出3 种隐孔雀石绿半抗原；进一步采用活泼酯和莺氮化法分别将获得的半抗原与牛血清白蛋白(B S A)偶联，形成相应全抗原。半抗原和全抗原分别经减压硅胶柱色谱及透析纯化后，采用质谱、核磁共振及紫外扫描光谱等分析手段进行了鉴定，结果表明半抗原及免疫全抗原均合成成功，满足了进一步免疫、筛选高质量抗体和建立检测方法的需要。同时，采用分子模拟手段对抗原表面半抗原决定簇的前线分子轨道分布情况进行了仿真模拟分析，讨论了前线轨道的分布可能对抗体特性造成的影响，为进一步的半抗原构效关系研究提供理论支持。关键词：孔雀石绿；半抗原；全抗原；合成；鉴定D e s i g n，S y n t h e s i sa n dI d e n t i f i c a t i o no fL e u c o m a l a c k i t eG r e e nH a p t e n sa n dC o m p l e t eA n t i g e n sS H E NY u d o n g，W A N GY u，S U NY u a n r u i n g，L E IH o n g t a o，W A N GH o n g，X I A OZ h i l i(r o o dQ u a l i t ya n dS a f e t yK e yL a b o r a t o r yo fU n i v e r s i t yo fG u a n g d o n gP r o v i n c eI n s t i t u t eo fF o o dQ u a l i 哆a n dS a f e t y,S o u t hC h i n aA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y，G u a n g z h o u5 1 0 6 4 2，C h i n a)A b s t r a c t：S e v e r a lc o m p l e t ea n t i g e n sw e r ep r e p a r e dt op r o d u c et h ea n t i b o d i e sf o rl e u c o m a l a c h i t eg r e e n T h r e eh a p t e n s(4-M G C，3-M G Na n d4-M G N)w i t hd i f f e r e n ta c t i v eg r o u p sa n dl i n k e rs u b s t i t u t i o np a t t e r n sw e r es y n t h e s i z e df a c i l e l yw i t hN，N-d i m e t h y l a n i l i n ea n db e n z a l d e h y d ed e r i v a t i v e sa sr a wm a t e r i a l s T h e4-M G C，3-M G Na n d4-M G Nw e r ec o n j u g a t e dt ob o v i n es 唧ma l b u m i n(B S A)w i t ha c t i v ee s t e ra n dd i a z o t i z a t i o nm e t h o dr e s p e c t i v e l yt of o r mt h r e ec o m p l e t ea n t i g e n s T h er a t i o so f 4 _M G C，3-M G N，a n d4-M G Nt oB S Aa r ep r o v e da s4 0：1，1 5；1a n d1 3：lr e s p e c t i v e l yb yU Vs p e c t r aa n a l y s i sa n dI x i n i U o b c n z e n e s u l f o n i ca c i d(T N B S)m e t h o d F r o n t i e rm o l e c u l a ro r b i t a l(F M O、d i s t r i b u t i o no fc o n j u g a t en 删c sw a sa n a l y z e ds u c c e s s f u l l yb ym o l e c u l a rm o d e l i n g T h er e s e a r c hl a y saf o u n d a t i o nf o rf u r t h e rd i s c o v e r i n gt h es t r u c t u r e-a c t i v i t yr e l a t i o n s(S A R)o fs m a l lm o l e c u l eh a p t e n sa n dd e v e l o p i n ga n t i b o d ya n di m m u n o a s s a ym e t h o d K e yw o r d s：m a l a c h i t eg r e e n；h a p t e n；c o m p l e t ea n t i g e n；s y n t h e s i s；i d e n t i f i c a t i o n中图分类号：$8 5 9；0 6 2 5 6文献标识码：A文章编号：1 0 0 2-6 6 3 0(2 0 0 8)0 7-0 2 6 3 4 4孔雀石绿(m a l a c h i t eg r e e n，M G)属三苯甲烷类染料，曾广泛用于预防和治疗各类水产动物的水霉病、鳃霉病和小瓜虫病等。近年来研究表明，孔雀石绿在生物体内主要以代谢物隐孔雀石绿(1 e u c o m a l a c h i t eg r e e n，L M G)形式存在，对人体有致畸、致癌和致突变的危险性【2 4 1。目前，欧盟及美国等均已禁止孔雀石绿用作渔药。我国也于2 0 0 2 年5 月将孔雀石绿列入食品动物禁用的兽药及其化合物清单(农业部公告1 9 3 号)。然而，受价格低廉及水霉病防治效果较好等利益驱使，孔雀石绿lN图1孔雀石绿结构F i g 1S t r u c t u r eo fM G收稿日期：2 0 0 7 0 8 1 2基金项目：广东省自然科学基金项目(0 6 3 0 0 4 2 1)；粤港关键领域重点突破项目(2 0 0 6 A 2 5 0 0 5 0 0 2)；华南农业大学校长基金项I；t(51 0 0-k 0 6 1 3 3)作者简介：沈玉栋(1 9 7 7)，男，讲师，博士，主要研究方向为食品安全。E m a i l：s h e n y u d o n g s c a u e d u c n 万方数据2 6 42 0 0 8,V 0 1 2 9,N o 0 7目晶科宇生物工程一I 一fN豳2隐孔雀石绿结构F i g 2S t r u c t u r eo fL M GlN非法滥用现象依然严重，由此造成对人体的潜在危害不容忽视。孔雀石绿及隐孔雀石绿残留检测主要是气相色谱法和高效液相色谱法，设备昂贵，操作繁琐，不适用于现场快速检测【引。免疫分析方法近年来在环境、食品安全监测领域逐渐广泛应用的一种快速、高通量、低成本的检测技术，已逐渐成为国际上有毒有害残留物快速筛选检测的主要方法之一。目前，市售免疫检测E L I S A试剂盒均直接以孔雀石绿为检测对象，而生物体内残留主要以隐孔雀石绿代谢物形式存在，检测过程需要经过复杂繁琐的氧化步骤，操作难度大，稳定性差。因此，发展隐孔雀石绿免疫检测方法，具有重要的意义。本研究旨在合成系列隐孔雀石绿半抗原及全抗原，并进行分子模拟分析，为进一步筛选高质量抗体，阐明半抗原构效关系以及建立隐孔雀石绿免疫检测方法奠定了基础。1材料与方法1 1试剂与仪器4 羧基苯甲醛A l f aA e s a r 公司；N，N 二环己基碳二亚胺(D C C)、N 羟基琥珀酰亚胺(N t i S)、A m b e r l y s t1 5树脂A C R O S 公司；牛血清白蛋白(B S A，6 5 k D)、2，4,6 三硝基苯磺酸(T N B S)S i g m a 公司；其他试剂均为市售分析纯。J B 3 型定时恒温磁力搅拌器上海雷磁仪器厂；U 一3 0 1 0 紫外可见分光光度计日本日立公司；D R X 4 0 0 核磁共振仪德国B m k e r 公司；L C Q E D C A 液质联用仪美国F i n n i g a n 公司。1 2隐孔雀石绿半抗原合成(图3)半抗原4 M G C 的合成：取N，N 一二甲基苯胺2 5 0 9(o 0 2 m 0 1)，4 羧基苯甲醛1 5 0 9(0 0 1 m 0 1)，苯3 0 m l 以及催化量A m b e r l y s t1 5r e s i n 于5 0 m l 两口烧瓶中，氮气保护，回流搅拌过夜，减压蒸去溶剂，粗产物硅胶柱层析纯化得到目标半抗原4(双(4 一二甲胺基)苯基)甲基)苯甲酸(4 M G C)白色固体。半抗原3-M G N 和4 一M G N 合成：取N，N 二甲基苯胺2 5 0 9(0 0 2 m 0 1)，3 一硝基苯甲醛(或4 _ 硝基苯甲醛)1 5 3 92：R I=H，R 2=C O O H3：R I=H，R 2=N 0 24：R l=N 0 2，R z=H6：R l=H，R 2=N 0 27；R I=H，R 2=H8(3 M G N)：R I=N 0 2，R 2=H9(3 一M G N)：R I=H，R=N 0 2圈3半抗原4-I K t C、3-1 1 6 N 和4-I I G N 的合成R g 3S y n t h e s i so fh a p t e n s4-M G C，3-M G Na n d4-M G N(o 0 1 t 0 0 1)，苯3 0 m l 以及催化量A m b e r l y s t1 5 树脂于5 0 m l两口烧瓶中，氮气保护，回流搅拌过夜，减压蒸去溶剂，得粗产物6(或7)。然后，在含有粗产物的反应烧瓶中加入9 5 的乙醇1 0 m l，搅拌溶解后分别加入铁粉4 0 0 9(0 0 7 t 0 0 1)，蒸馏水2 0 m l，浓盐酸1 m I。8 0 回流搅拌2 h 停止反应，过滤除去铁粉等沉淀，减压蒸去溶剂。反应粗产物经硅胶柱层析纯化得到浅黄色固体目标半抗原3(双伟二甲胺基)苯基)甲基)苯胺(3 M G N)或4 一(双(4 二甲胺基)苯基)甲基)苯胺(4-M G N)】。1 3隐孔雀石绿全抗原合成1 3 1全抗原A 的制备免疫原4-M G C B S A抗原A)制备：称取O 0 3 7 5 9 半抗原4-M G C 和N 羟基琥珀酰亚胺(N q-I S)0 0 1 4 9 溶于1 0 m lN。N 一二甲基甲酰胺(D M F)中。将0 0 2 5 9N，N 二环己基碳二亚胺(D C C)溶于1 0 m lD M F 中，磁力搅拌下逐滴加入，室温搅拌3 5 h 得A 液。然后在搅拌状态下将A液逐滴加入到B S A 溶液中，4 C 冰箱搅拌反应过夜。4 下用9 的生理盐水透析3 d，每4 h 换一次透析液。紫外扫描透析液无小分子吸收峰时将产物在无菌条件下通0 2 I I m 的滤膜，得免疫抗原A，分装后，一2 0 保存。1 3 2全抗原B 和C 的制备免疫原3-M G N B S A(抗原B)和4-M G N B S A(抗原C)的制备：称取0 0 3 4 5 9 半抗原3-M G N(或4 M G N)于1 0 m l称量皿中，加入l m l1 0 m o l L 的盐酸溶液，随后称取0 0 1 3 8 9N a N O：加入称量皿中，冰浴搅拌3 0 m i n。得到淡黄色液体A。搅拌状态下将A 液逐滴加入到B S A 溶液中，4 反应过夜。4 下用9 o 的生理盐水透析3 d，每4 h 换一次透析液。紫外扫描透析液无小分子吸收峰时可将产物在无菌条件下通0 2l lm 的滤膜，得免疫抗原B(或C)，分装于安培瓶中，一2 0 保存。1 4全抗原鉴定及偶联比测定参照文献【6】【8】方法进行。丫O。万方数据2结果与分析2 1半抗原的结构鉴定对半抗原4 M G C、3 M G N 和4 M G N 进行了质谱(M S)与核磁共振(N M R)分析，结果表明3 个半抗原合成成功。其波谱数据及结构归属如下。半抗原4 M(配：E S I M Sm z：3 7 5(M+H)+；E S I M S 2m z：3 6 0(M C H 3+H)+。1 H N M R(4 0 0 M H z d 6-A c e t o n e，T M S)：6 2 9 0(s，1 2 H，C H，)，5 4 4(s，l H，C H)，6 6 9(d，J=8 7 H Z，4 H，A r H)，6 9 6(d，J=8 7 H z，4 H，h r H)，7 2 6(d，J=8 2 H z，2 H，A r H)，7 9 5(d，J=8 2 H z，2 H，A r H)。半抗原3-M G N：E S I M Sm z：3 4 6(M+H)+。1 H-N M R(4 0 0 M H z，d 6 A c e t o n e，T M S)：5 2 8 8(s，1 2 H，C H 0，4 4 9(s，b r，2 H，N H 2)，5 1 9(s，1 H，C H)，6 3 5(d，J=7 6 H z，1 H，A r H)，6 4 3(s，1 H，A r H)，6 4 7(d，J=7 9 0 H z，1 H，A r H)，6 6 6(d，J=8 7 H z，4 H，A r H)，6 9 1 6 9 6(m，5 H，A r H)。半抗原4 M G N：A P C I M Sm z：3 4 6(M+H)+；A P C I-M S 2m z：3 31(M C H 3+H)+。lH-N M R(4 0 0 M H z，d 6 一A c e t o n e，T M S)：5 2 8 8(s，1 2 H，C H 3)，4 4 5(s，b r，2 H，r c a 2)，5 1 9(s，1 H，C H)，6 5 7(d，1=8 4 H z，2 H，A r H)，6 6 6d，J=8 8 H z，4 H，A m)，6 8(d，J=8 3 H z，2 H，A r a)，6 9 0(d,J=8 6 H z，4 H，A r H)。勉全抗原鉴定载体蛋白B S A 在2 8 0 n m 波长处有强吸收，孔雀石绿半抗原在该波长吸收较弱，最大吸收位置与载体蛋白不重叠。隐孔雀石绿半抗原、完全抗原、载体蛋白的紫外光谱扫描结果(图4-一6)显示，完全抗原在2 8 0 n m 波长附近均表现出肩峰，整体波形与相应载体蛋白有较大差异，明显呈现出相应半抗原吸收峰叠加的特征，从而说明3 种完全抗原A c 均合成成功【8】。同时，参照文献 6 J 方法从紫外光谱扫描结果进一步分析了完全抗原A c 的偶联比分别为4 0：1、1 5：1 和1 3：1。另外，采用三硝基苯磺酸(T N B S)法【，】测定了完全抗原A 的半抗原偶2 2 02 4 0 2 6 02 8 03 0 0 3 2 0 3 4 0波长(n m)图4抗原A 紫外图谱F 幻4U Vs p e c t r o g r a mo fa n t i g e nA2 2 02 4 0 2 6 02 8 03 0 0 3 2 0 3 4 0波长(n m)圈5抗原c 紫外图谱F 畸5U Vs p e c t r o g r a mo fa n t i g e nC2 0 02 5 03 0 03 5 04 0 0波长(n m)图6抗原E 紫外图谱F i g 6U Vs p e c t r o g r a mo fa n t i g e nE联比为3 9：1，与紫外光谱法结果一致，佐证了紫外光谱法的准确性。2 3理论计算根据分子轨道理论，前线分子轨道(f r o n t i e rm o l e c u l a ro r b i t a l，F M o)及其附近的分子轨道对生物活性影响最大奄违祭V图7 半抗原一载体蛋白偶联模拟物F 9 0 分布图F i g 7F M Od i s t r i b u t i o no f n j u g 猷em i m i c s432lOO5O5O5O5O曩3322l1OO4321O 万方数据2 6 62 0 0 8,V 0 1 2 9,N o 0 7良品科字生物T 程 1 3 J】。为了考察抗原表面半抗原决定簇微观电子结构对抗体特性影响的规律，研究阐明半抗原的构效关系(s t r u c t u r e-a c t i v i t yr e l a t i o n s h i p，S A R)，本研究采用C h e mO f f i c e 软件包对抗原表面半抗原决定簇模拟物F M O 分布进行了H Uc k e l 轨道模拟计算。羧基衍生的4-M G C 半抗原一般偶联于载体蛋白表面的赖氨酸氨基残基上，因此，抽取赖氨酸片断与半抗原组成半抗原决定簇模拟物4-M G C L y s i n e 进行仿真模拟计算；氨基重氮化法一般偶联在酪氨酸的酚羟基邻位，因此抽取酪氨酸片断与半抗原组成半抗原决定簇模拟物4 一M G N T y r o s i n e 和3-M G N T r y r o s i n e 进行仿真模拟计算。计算结果显示(图7)，半抗原4 M G C 偶联载体后，F M O 轨道分布与药物L M G 相比变化不大，而半抗原4 一M G N 和3-M G N 偶联载体后，其F M O 分布从二甲氨基取代的苯环区完全转移到了偶联位点区，电子结构发生了较大变化。3讨论3 1半抗原设计免疫分析方法研究中，制备高质量抗体是关键，而抗体质量的优劣很大程度上取决于半抗原的结构(宏观立体结构与微观电子结构)足否合理。因此，设计合理的半抗原结构及选择合适的偶联蛋白方式非常重要。文献研究经验表明：制备高特异性抗体所需半抗原及人工抗原应能最大限度的保持药物分子的特征结构。从隐孔雀石绿的结构分析，电子云密度较高的二甲氨基取代的两个苯环系统可能是产生特异性抗体的决定性特征结构区。因此，半抗原设计中采取了远离该药物特征结构区衍生化偶联手臂的策略。同时，为了研究半抗原的构效关系，考察不同衍生化方法及偶联位点对抗体特性的影响，分别在非取代苯环的邻对位引入吸电子性质的羧基和偶联蛋白后扩大共轭体系的氨基活性基团。进一步的模拟计算结果表明：羧基衍生的半抗原偶联蛋白后保持了药物分子的微观特征电了结构(F M O 分布与药物分子一致)，可能跟有利于高特异性抗体的产生；氨基衍生的半抗原偶联蛋白后，较大程度改变了药物分了特征电子结构(F M O 分布发生较大变化)，可能对产生高特异性抗体产生较大负面影响，深入的理论计算及半抗原构效关系分析有待进一步研究。3 2半抗原合成及鉴定隐孔雀石绿合成通常采用盐酸催化方法进行【9 l，该方法在反应过程中发生较多氧化交联副反应，反应产物后处理比较繁琐。本研究尝试采用A m b e r l y s t1 5 树脂催化反应新策略【t O l 合成隐孔雀石绿半抗原，该方法条件温和，操作简单，大人减弱了氧化交联副反应的发生，反应产物经简单的蒸馏、重结晶或减压硅胶柱层析，即可方便的得到高纯产物。所有半抗原产物结构及纯度均经过充分的波谱分析鉴定确证。3 3全抗原制备及鉴定分别采用活性酯和重氮化法制备了载体蛋白表面不同半抗原取向的全抗原A 以及B 和C。全抗原的鉴定和偶联比的测定主要采用了紫外扫描光谱法T N B S 法1 6 J J。紫外扫描光谱法用于两种组分的吸收光谱不重叠时，进行光谱扫描，推算结合比，町以初步判定全抗原是否合成成功。T N B S 法用来测定载体蛋白含有的游离氨基残基，因偶联后载体蛋白氨基减少，从而推算出两者的结合比，该方法只适用于偶联方法消耗载体蛋白氨基残基的抗原，如完全抗原A 偶联比的测定。莺氮法偶联载体蛋白主要偶联位点在酪氨酸苯环的酚羟基邻位，不消耗氨基残基，因此重氮化法所得抗原B 和C 的偶联比不能用T N B S 法测定。T N B S 法和紫外光谱法测定抗原A 偶联比结果的一致性佐证了紫外光谱法测定隐孔雀石绿全抗原偶联比的准确性。4结论4 1设计了3 种不同结构的L M G 半抗原，提出了一条LMG 半抗原高效合成的新策略，并采用质谱、核磁共振等波谱分析手段对合成得到的3 种半抗原进行成功鉴定。4 2通过活泼酯法与重氮化法成功地制备了全抗原A、B 和C，并对其进行了紫外扫描光谱鉴定。同时，结合T N B S 法进一步对抗原偶联比进行了准确分析，为进一步的抗体制备奠定基础。4 3通过分子模拟手段成功计算并分析了全抗原表面半抗原决定簇的前线轨道分布特点，为进一步从微观角度进行半抗原构效关系研究提供理论支持。参考文献：n】A L D E R M A N DJ M a l a c h i t eg r e e n：r c v i c w I J J o u r n a lo f F i s hD i 嘲1 9 8 5(8)：2 8 9 2 9 8 2 1S R I V A S T A V AS。S I N H ARR O YD T o x i c o l g i c a le f f e c t so f m a l a c h i t eg r e e n I J A q u a t i cT o x i c o l o g y，2 0 0 4。6 6：3 1 9 3 2 9【3】R A OK VK I n h i b i t i o no fD N As y n t h e s i si 1 1r,r i m a t r yr a th e p a t o c y t ec u l t u r e sb ym a l a c h i t eg l-P*n：an e wl i v e rt u l 1 0 rp r o m o t m i Y l T o x i c o l o g yL e t t e r s 1 9 9 5。8 l：1 0 7 1 1 3 1 4 C U L PSJ。B E L A N DFA。H E F L I C HRH。e ta 1 M u t a g e n i c i t ya n dc a r c i n o g e n i c i t yi nr e l a t i o nt oD N Aa d d u e tf o r m a t i o ni nr a t sf e dl e u c o m a l a c h i t eg r e e n J M u t a t i o nR e s e a r c h。2 0 0 2，5 0 6，5 0 7：5 5-6 3 昀J 涛，徐锦忠，吴斌，等测定鳗鱼中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量【J 1 现代科学仪器。2 0 0 6(1)：2 7 2 9 网杨少国，胡少昶，魏华平酶免疫检测技术【M】南京：南京大学出版社。1 9 9 8 明S A S H I D l I A RRB，C A P O O RAl(，R A M A N AD Q u a n t i t a t i o no f-a m i n og r o u pu s i n ga m i n oa c i d sa sr e f e r e n c es t a n d a r d sb yt r i n i t r o b e n z e n es u l f o n i ca c i d As i m p l e m e t r i c 眦t h o df o rt h ee s t i m a t i o no fh a p t e nt oc a r r i e rp r o t e i nr a i o J J o u r n a lI m m u n o l o g i c a lM e 山o d s，1 9 9 1 6 7：1 2 1 1 2 7 嘲陈新建免疫学技术在植物科学中的应用口哪北京：中国农业大学出版补。1 9 9 8【9 1B O N G S U PPC，1 1 A N IEY，10 N N 疋RB，e ta 1 S y n t h e s i sa n dc 血a c 碡r-i z a t i o no f N-&m e t h y l a t e dm e t a l，0 l i t e so f m a l a c h i t eg r e e na n dk u o 嘎玎a b 幽g r e e nm C h e m i c a lR e s e a r c hT o x i c o l o g y，2 0 0 3，1 6：2 8 5-2 9 4 t i n S H E NYD，W UHQ，A NLke ta 1 U n e x p e c t e ds y n t h e s i so f2，2 一【l(4 一m c c h o x y p h e n o x y)p r o p a n e 2，2-d i y l】b i s(5-m e t h o x y 一3 一m e t h y l b e n z o f u r a n)J C h i n e s eC h e m i c a lL e t t e r s，2 0 0 5。1 6：1 5 8 1 1 5 8 3【l l】姜凯龄杨定乔，郭维，等邻氨基苯甲醛的合成方法(J 1 合成化学，2 0 D 5 1 3：5 2 0 5 2 1【1 2】B A V I NPMG A d a m a n t a n e T r i c y c l o 3 3 1 1 3。7】d e c a n e 哪O r g a n i cs y n t h e s e s，1 9 7 3，1(5)：3 0 1 3】F U K U IK M o l e c u l a ro r b i t a l si nc h e m i s t r y，p h y s i c sa n db i o l o g y M N e wY o r k：A c a d e m i cP r e s s 1 9 6 4【1 4 1C H E NCY，L ILM T h e o r e t i c a la n dc o m p u t a t i o n a ld c v c l o p m c n t S J I n t e r n a t i o n a lJ o u r n a lo fQ u a n u l mC h c n 衄r y，1 9 8 3。2 3：1 5 9 7 1 5 9 9 万方数据隐孔雀石绿半抗原与全抗原设计、合成及鉴定隐孔雀石绿半抗原与全抗原设计、合成及鉴定作者：沈玉栋，王宇，孙远明，雷红涛，王弘，肖治理，SHEN Yu-dong，WANG Yu，SUNYuan-ming，LEI Hong-tao，WANG Hong，XIAO Zhi-li作者单位：广东省高等学校食品质量安全重点实验室,华南农业大学食品质量安全研究所,广东,广州,510642刊名：食品科学英文刊名：FOOD SCIENCE年卷(期)：2008,29(7)被引用次数：1次 参考文献(14条)参考文献(14条)1.陈新建 免疫学技术在植物科学中的应用 19982.SASHIDHAR R B;CAPOOR A K;RAMANA D Quantitation of-amino group using amino acids as referencestandards by trinitrobenzene sulfonic acid.A simple spectrophotomeric method for the estimation ofhapten to carrier protein ratio 19943.杨少国;胡少昶;魏华平 酶免疫检测技术 19984.BONGSUP P C;TIANLE Y;LONNIE R B Synthesis and character-ization of N-demethylated rnetabolites ofmalachite green and leucomalachite green外文期刊 2003(3)5.丁涛;徐锦忠;吴斌 测定鳗鱼中孔雀石绿、隐性孔雀石绿残留量期刊论文-现代科学仪器 2006(01)6.CULP S J;BELAND F A;HEFLICH R H Mutagenicity and carcinogenicity in relation to DNA adductformation in rats fed leucomalachite green外文期刊 2002(0)7.RAO K V K Inhibition of DNA synthesis in primary rat hepatocyte cultures by malachite green:a newliver tumor promoter 19958.SRIVASTAVA S;SINHA R;ROY D Toxicolgical effects of malachite green外文期刊 2004(3)9.CHEN C Y;LI L M Theoretical and computational developments 198310.FUKUI K Molecular orbitals in chemistry,physics and biology 196411.BAVIN P M G AdamantaneTricyclo3.3.1.13,7 decane 1973(05)12.姜凯龄;杨定乔;郭维 邻氨基苯甲醛的合成方法期刊论文-合成化学 2005(5)13.SHEN Y D;WU H Q;AN L K Unexpected synthesis of 2,2-1-(4-methoxyphenoxy)propane-2,2-diyl bis(5-methoxy-3-methylbenzofuran)期刊论文-Chinese Chemical Letters 2005(12)14.ALDERMAN D J Malachite green:review 1985(08)本文读者也读过(8条)本文读者也读过(8条)1.王权.李健.郭德华.龚鹏飞.WANG Quan.LI Jian.GUO De-hua.GONG Peng-fei 无色孔雀石绿免疫原的合成与鉴定期刊论文-中国兽医科学2007,37(6)2.龚朋飞.周美华.郑志青.GONG Peng-fei.ZHOU Mei-hua.ZHENG Zhi-qing 用于检测孔雀石绿的全抗原的合成与鉴定期刊论文-兽药与饲料添加剂2008,13(6)3.赵春城.刘一军.徐帮兴.杨婷婷.吴杰.沈雯琰.张凌裳.孙秀兰.赵晓联 抗无色孔雀石绿抗体的制备及鉴定会议论文-20084.龚朋飞.王权.陈永军.GONG Peng-fei.WANG Quan.CHEN Yong-jun 孔雀石绿单克隆抗体的制备及其鉴定期刊论文-中国兽医科学2007,37(4)5.王权.龚朋飞.陈永军 孔雀石绿单克隆抗体的制备及其鉴定会议论文-20106.王敏.王权.蔡小丽.王希春.吴金节.WANG Min.WANG Quan.CAI Xiao-li.WANG Xi-chun.WU Jin-jie 无色孔雀石绿单克隆抗体的制备与鉴定期刊论文-畜牧与饲料科学2009,30(3)7.周有祥.夏虹.彭茂民.路磊.李书谦.胡定金.ZHOU You-xiang.XIA Hong.PENG Mao-min.LU Lei.LI Shu-qian.HUDing-jin 羧化孔雀石绿完全抗原的构建与鉴定期刊论文-湖北农业科学2010,49(10)8.王权.龚朋飞 无色孔雀石绿间接竞争ELISA(ciELISA)检测方法的建立会议论文-2008 引证文献(1条)引证文献(1条)1.李丽华.徐振林.孙远明.杨金易.王弘.雷红涛.沈玉栋 3氨基2唔唑烷酮半抗原、人工抗原的合成及鉴定期刊论文-食品工业科技 2012(2)本文链接：http:/