荧光检测毛细管电泳法.doc

通过荧光检测毛细管电泳法
快速灵敏地检测人体血浆中的亚硝酸盐的方法

本文选自塔兰塔(Talanta)，爱思唯尔(Elsevier)出版，纯分析化学期刊。
作者：安 范 舒普代尔，来自比利时鲁汶大学。

摘要:分析亚硝酸盐,NO指示剂在体内的产生,为研究NO在体内的合成提供了一个有用的工具。通过其衍生反应和2、3二氨基萘(DAN)中一个快速、灵敏荧光-毛细管电泳法被发展来测定了人体血浆中的亚硝酸盐。亚硝酸盐在人体血浆中很容易与DAN在酸性条件下反应得到收益率很高的荧光2,3-萘酚三唑(NAT)。荧光检测是完成施达赛检测的最佳化方式，它允许一种等离子体样品的直接分析而不像大多数堆积样品的CE-UV方法。乙腈可去除蛋白质。短程注射和高压电(30千伏)可缩短分析时间。用20mm,pH值为9.23的缓冲溶液可更好的分离。NAT的分离在1.4分钟内完成，除蛋白等离子体样品以5s每50 mbar水动力地的速度被注射到60厘米×75微米的内部直径无涂层的玻璃毛细管里。激发波长被选中为一个宽带滤波器(240-400nm),发射光在418nm被测量通过采用一个截止过滤器。在2到500nm的范围内获得一个好的线性关系(R2=0.9975)。在原始血浆样本中亚硝酸盐的检测极限是0.6nm, 比我们此前的CE-UV法低了750倍。先进的荧光-毛细管电泳法相对于目前的荧光高效液相色谱法，具有更简单的系统和更低的成本优势，同时也很灵敏。这个研究表明该方法测定人体血浆中亚硝酸盐在的浓度与频繁报道的一致。
1 介绍
研究表明，亚硝酸盐在生理和病理条件下有可能成为NO合成的一个标志，因此在实验和临床研究中可能作为一个生化参数。
但是到目前为止，还没有真正关于人体血浆中亚硝酸盐的浓度的共识。具报告，一般水平的亚硝酸盐在人体血浆中“不能检测”的范围达到26微米。人体血浆中亚硝酸盐的浓度最合理的范围是从100纳米到1微米，通过大多数研究者团体的测量最常报道的结果是从100纳米到200纳米。因此，对于分析学科来说测定人体血浆中的亚硝酸浓度是一个挑战。在样品配制的过程中，高灵敏度测定和一定的防范措施可以提高测量的精密度和准确度。荧光法已广泛用于亚硝酸盐的灵敏分析。这些方法涉及亚硝酸盐衍生化反应——由2,3-二氨基萘(DAN)合成2,3-萘酚三唑(NAT)。有一些使用高效液相荧光检测的方法用在检测水、尿液和细胞培养液中的亚硝酸盐。然而，大多数荧光高效液相色谱法对样品需要一个复杂的制备过程来去除一些小元件并需要一个保护柱。这些额外的合成步骤可能会引入环境中杂质亚硝酸盐。此外，事实上在碱性pH值为8.5～11.5的条件下NAT是稳定的且具有较高的荧光强度，与常态下稳定的反相高效液相色谱柱不兼容。当流动相的pH值大于8时，普通的玻璃柱开始溶解且寿命缩短。因此，在碱性条件下分析亚硝酸盐，需要特殊的色谱柱，如高聚物型色谱柱。即便如此, 在每次使用高效液相色谱后仍需要一个严格的清洁过程。由于其简单的样品制备及清洗过程，毛细管电泳在生化分析中独具优势。虽然各种毛细管电泳-紫外法结合毛细管预浓缩已经达到令人满意的灵敏度，直今仍没有荧光毛细管电泳法用于分析亚硝酸盐。
此研究的目的是开发一个快速、简单和灵敏的荧光毛细管电泳法来测定人体血浆中亚硝酸盐。
2材料和方法
2.1 药品
所用试剂均为分析纯。亚硝酸钠和十水四硼酸二钠购于默克公司（达姆施塔特，德国）。氢氧化钠和乙腈购于费舍尔科技（拉夫堡大学，英国）。二氨基萘和荧光素均购自于西格玛奥瑞奇化工（圣路易斯，密苏里州，美国）。盐酸是购于美国VWR公司（鲁汶，比利时）。
所有的溶液均使用经过Milli-Q梯度系统（密理博，莫尔斯海姆，法国）纯净的蒸馏水配制。用0.2微米的再生纤维素过滤器（华特门公司，达瑟尔，德国）过滤缓冲溶液。
2.2 样品制备
从7名健康的男性志愿者（无饮食限制）中收集静脉血液样本，吸入离心管中分离锂-肝素和血浆，样品采集后用离心机分离血浆样品三分钟左右（3478g，10min，4℃）。血浆被分离后立即在-80℃下冷冻直至下次分析时。在室温下解冻后，加入100μL乙腈使100μL血浆样品脱去蛋白质，用微型高速离心机将14100g的混合物离心5分钟（艾本德，汉堡，德国）。然后，加入5μL0.62M HCl将100μL上层清液的pH值调节到6并伴有衍生反应。全部100μL样品由50μL反应混合液和50μL 0.1μM荧光素溶液组成且把它作为内标物，并直接用于注射。这项研究已经通过当地的伦理委员会（鲁汶大学）的批准，项目得到批准。
2.3 含二氨基萘(DAN)的亚硝酸盐合成萘酚三唑(NAT)
含DAN的亚硝酸盐的反应依据Misko等人的方法。在酸性条件下DAN与亚硝酸盐反应迅速，生成强荧光性的产物萘酚三唑（NAT），其在碱性溶液中是稳定的。DAN的原液，将DNA溶于0.62 M 浓度为2mg/ml的HCl溶液并存放在-20℃的阴暗处。DAN工作溶液（0.05mg/ml）由0.62 M的HCl原液稀释40倍制备而成，存放在4℃下的阴暗处。100μL亚硝酸盐标准液或者血浆样品用10μL的25℃下的DAN工作液放置于恒温混匀仪（艾本德，汉堡，德国）中培养15min，之后加入1.4 M NaOH 溶液10μL。
2.4 仪器与毛细管电泳使用条件
所有的实验均在一台HP3D毛细管电泳系统（安捷伦科技公司，布隆，德国）中进行，在-30千伏的电压下使用未涂层熔融石英毛细管（60 cm*75 μm 内径; 从荧光检测窗口有效长度43.5cm，16.5cm）来进行分离。毛细管恒温在25℃，连接一个250B荧光检测器（光通量仪器，巴塞尔，瑞士）且作为外部探测器。光源为氙气汞灯。激发是使用垂直照射毛细管电泳系统中的玻璃毛细管的而产生。发射光沿着毛细管是由于全反射，一个专利光源的聚焦，即连接到一个使用导光管的光电倍增器。使用宽带滤波器(200-400nm)在418 nm的发射波长处激发，检测荧光强度。在5mbar下，用水动力短程注射。注射血浆样品之前，用0.1 M的NaOH和运行缓冲液分别冲洗毛细管(2min)。
使用万通691 pH计（万通，海利桑，瑞士）来测定硼酸盐缓冲液的pH值。
3 结果与讨论
3.1 荧光法和毛细管电泳法的发展
鉴于先前的报道，荧光强度在碱性条件下增强，而在酸性条件下减弱，硼酸盐缓冲液在pH9～10的范围测试，保持荧光增益值为1100。在增益值1100时pH值增加对荧光强度变化没有显著增强的影响。pH值增加也会导致电流的增加。用于检测的硼酸盐缓冲液浓度分别为10、20和30mM。结果，没有作pH较准的20mM硼酸盐缓冲液是对电流和离子强度的折中选择。荧光检测器所检测的增益值从800到1100，最大获取强度设定在1100增益。用418nm到450nm的发射波长来检测荧光强度，最大信号在418nm使用宽带(200 - 400nm)滤波器来激发。使用250nM标准亚硝酸盐溶液和250nM加入标准亚硝酸盐的血液样品来做衍生化时间的测试，分别做1、5、10、15、20和30分钟。反应时间保持在15分钟是因为，在这两种溶液下15分钟反应时间没有明显的产品强度增加。短程注射相比一般注射，其分离时间几乎缩短了3倍。短程注射和一般注射的血浆样本电泳图谱见图1。
图1：血浆样品包括137nM的亚硝酸盐以及50nM的内标物的电泳图谱。A为短程注射，B为一般注射。(DAN: 2,3-diaminonaphthalene; NAT: 2,3-naphthotriazole; I.S.: Internal standard).
3.2 荧光毛细管电泳法的精密度与准确度，线性、检测和检量极限
对三份去蛋白血浆样品中标准亚硝酸盐的加入 (0、2、20、40、200、400、500 nM)得到一个线性关系(R2=0.9975)。用50nM的荧光素作内标物(I.S.)。线性回归方程为 y=0.0084x+0.2031，Syx=0.01。其中x表示加入去蛋白血浆样品中亚硝酸盐的浓度，而y表示相对峰面积(NAT的校正峰面积除以I.S.的校正峰面积)，Syx代表y估算的标准偏差。原始血浆中亚硝酸盐的检测极限和定量极限分别是0.6nM和2nM基于3和10的信噪比，在使用Argos 250 B型荧光检设置最大的增益为1100。用于毛细管电泳法分析亚硝酸盐较之前的荧光高效液相色谱的敏感性要好，但略逊于报道中0.01nM和0.27nM的最低检测限。这个方法的准确度取决于250nM的标准加入亚硝酸盐的血浆样本，表示为相对峰面积的相对标准偏差(%RSD)。对于三天的重复注射同日间及异日间的精密度分别为0.2%和1.1%。分析亚硝酸盐的方法是否准确，是由已知数量的亚硝酸钠评估的。平均结果基于三个数据指向每一个被使用的浓度。不同浓度的亚硝酸盐的回收率范围在85.3～112.3%内,表明该方法的精密度是可接受的(见表1)。
3.3 方法的应用
该方法应用于检测人体血浆样本中亚硝酸盐的浓度。七个年轻健康的男性志愿者的血浆样品被用来分析。平均基底的亚硝酸盐浓度用这种方法测量是159.4±58.5nM，这符合常见的报道结果，即大多数研究小组用100nM到200nM所测试的结果。
4 结论
通过荧光毛细管电泳法快速灵敏的测定人体血浆中的亚硝酸盐的方法已经成功开发并得以验证。相比现有的条件要求严格的高效液相色谱法，新的毛细管电泳法具有操作简单和低成本的优点。该方法同时可用于检测和量化其他生物系统中的亚硝酸盐，亦可作为一个有用的工具来探索NO的合成在一般正常和病变过程中的作用。