实验一淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定 - 副本.doc

本科学生实验报告

学号： 124120463 姓 名：
学院： 生命科学学院 专业、班级： 12级生物技术班
实验课程名称： 酶工程实验一
教 师： 吴倩
云南师范大学教务处编印

实验一 淀粉酶产生菌的分离及酶活性测定
一、目的要求
1、掌握从土壤中分离酶产生菌的方法，学会应用微生物生态知识分离产酶微生物。
2、掌握淀粉酶活性测定的原理，学会淀粉酶活性的测定方法。
二、基本原理
（一）淀粉酶产生菌的分离
1.菌种的采集
①要获得产生某种酶的菌种，可从富含该酶作用底物的场所去采集。
②胞外酶的稳定性和最适反应条件通常和菌的最适生长条件一致，因此要筛选具有某一特性的酶时，只要到相应的环境中采样即可。
2.富集培养
①原理：采集到的样品中如果所需的菌很少，需要先经过富集培养，使所需的菌大量繁殖，而不需要的菌则不生长或少生长，以利于筛选。
②富集的方法：控制培养的温度、pH和营养成分等。
3.菌种的分离
①淀粉与碘液反应会形成蓝色化合物。
②淀粉酶能使淀粉分解为葡萄糖，而葡萄糖与碘反应不会形成蓝色化合物，结果可使淀粉酶产生菌周围形成透明圈，从而筛选出淀粉酶产生菌。

（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1.原理：根据淀粉酶水解淀粉生成还原性糖，还原糖与3，5 -二硝基水杨酸共热后被还原成棕红色的氨基化合物，在一定的范围内，还原糖的量和反应液的颜色呈比例关系，可利用比色法在540nm进行测定。
2.酶活定义：在一定pH5.5、 37℃条件下，每分钟内从底物溶液中分解释放1μmol葡萄糖所需要的酶量为一个酶活单位U/g。
酶活计算公式：酶活（U/g）=A×5×K×N×1000/（T×W）
A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率
N:稀释倍数 5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积
T:反应时间（min） 1000:转换因子1mmol=1000μmol
W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）

3绘制标准曲线
①先配制一系列浓度不同的标准溶液，用选定的显色剂进行显色，在一定波长下分别测定它们的吸光度A。
②以A为横坐标，浓度c为纵坐标，则得到一条拟合度较好的直线，称为标准曲线。
③然后使用用完全相同的方法和步骤测定被测溶液的吸光度，便可从标准曲线上找出对应的被测溶液浓度或含量

三、器材
1试剂:
可溶性淀粉、碘、碘化钾、HCl、柠檬酸、Na2HPO4·12H2O等
2培养基:
分离、纯化培养基
3仪器:
①平皿、 三角瓶、大试管、 1mL和10mL移液枪、涂棒；
②天平、超净工作台、培养箱、电冰箱、恒温调速摇瓶柜、离心机、恒温水浴锅、紫外分光光度计、比色皿、记时器、高压灭菌锅。
四、操作步骤
（一）淀粉酶产生菌的分离
1.培养基的配制及灭菌
倒平板配制分离培养基 高压灭菌30min 冷却至约50℃
倒7块平板/140mL 冷却备用
2.制备土壤稀释液
①称取土样1g，放入9mL无菌水试管中，摇动10min，静置10min,制备得到10-1土壤稀释液；
②用无菌吸管吸出1mL土壤悬液，加入盛有9mL无菌水的大试管中，充分混匀，制备得到10-2土壤稀释液；
③再从中吸出1mL加入盛有9mL无菌水的大试管中，混匀后得到10-3土壤稀释液；
④以此类推，分别制备得到10-4、10-5、10-6、10-7土壤稀释液。
3.涂布
用无菌吸管分别吸取10-3、10-4、10-5 、10-6 和10-7土壤稀释液各0.1mL，对号放入已经写好记号的平板中央，用无菌玻璃涂棒涂匀。
4.培养纯化
挑取其中透明圈较大的单菌落，划线于平板，37℃倒置培养2～3d(如发现杂菌需再一次进行纯化直到获得纯培养)。
5.产淀粉酶微生物的鉴定
向平板内加入稀碘液数滴后进行观察
（二）淀粉酶产生菌的发酵及葡萄糖标准曲线绘制
1.淀粉酶产生菌的发酵
①分离培养基（140mL）的配制：
可溶性淀粉：0.7g 蛋白胨：0.7g 酵母膏：0.7g
KH2PO4 : 0.07g MgSO4•7H2O :0.02g CaCl2•2H2O : 0.08g
琼脂 : 2.8g
②配置发酵培养基200mL/组（40mL/瓶） 将纯培养得到的（透明圈最大的） 菌落接种于发酵培养基中30℃ 150r/min摇瓶发酵约72h。
2.葡萄糖标准曲线的制作
①精确称取0.100g葡萄糖，用缓冲溶液定容至100ml，制得浓度为1mg/ml的葡萄糖的标准溶液。标准曲线如下图表所示：
葡萄糖标准溶液
体积（ml）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
葡萄糖含量（mg）
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
12
缓冲液（ml）
2.0
1.8
1.6
1.4
1.2
1.0
0.8
DNS (ml)
3
3
3
3
3
3
3
定容总体积(ml)
15
15
15
15
15
15
15
OD（540nm）

②待测酶液的制备：
a.将发酵液倒入离心管中离心，离心条件4000转/5分钟，将离心后的上清液倾入试管中，稀释一定倍数测定其酶活力
b.底物溶液—2%淀粉溶液（需当天配置）
称取2.0克可溶性淀粉，用约80mL缓冲液调匀，加热煮沸直到淀粉完全溶解；冷却，并用缓冲液定容至100mL。
注：如果测定所得OD值不在有效值（0.2-0.8）范围内，则相应地降低或增大稀释倍数后再进行测定。
③淀粉酶酶活测定方法
操作步骤
空白管
样品管A
样品管B
步骤1
吸取1.8mL可溶性底物溶液
吸取1.8mL可溶性底物溶液
吸取1.8mL可溶性底物溶液
步骤2
37℃保温5分钟
37℃保温5分钟
37℃保温5分钟
步骤3

加入待测酶液0.2毫升
加入待测酶液0.2毫升
步骤4
37℃精确保温15min
37℃精确保温15min
37℃精确保温15min
步骤5
加入3mLDNS试剂终止反应
加入3mLDNS试剂终止反应
加入3mLDNS试剂终止反应
步骤6
混合均匀
混合均匀
混合均匀
步骤7
加入0.2毫升待测酶液，沸水浴煮沸5min
沸水浴煮沸5min
沸水浴煮沸5min
步骤8
流水冷却
流水冷却
流水冷却
步骤9
加蒸馏水10mL，混匀
加蒸馏水10mL，混匀
加蒸馏水10mL，混匀
步骤10
OD540nm比色
OD540nm比色
OD540nm比色

五、酶活测定注意事项注：
1.试管上编号：贴上用圆珠笔写上编号的胶布，以防止保温或沸水加热时脱落；
2.移液枪的使用：向试管内加入待测酶液或DNS时，枪头不要触碰管壁，也不要伸入液面下，连续吸取同一种溶液时可以不用更换枪头！
3.精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
4.避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5.实验结果的记录与分析
六、实验报告
（一）淀粉酶产生菌的分离结果
筛选
结果
稀释
倍数
产淀粉酶菌落数
菌落形态
透明圈
大小
10-3
  6
 菌落疏松，呈绒毛状、絮状、蜘蛛网状，大多为白色，有的为淡黄色和黑色
 1.1cm,1.0cm
0.9cm,0.8cm
0.5cm,3cm
10-4
  1
 绒毛状，圆形，白色
 0.8cm
10-5
1
絮状，白色
0.9cm
10-6
1
絮状，淡黄色
0.5cm
10-7
  0

（二）葡萄糖标准曲线绘制
①葡萄糖标准曲线的制作
编号
1
2
3
4
5
6
葡萄糖含量
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
OD（540nm）
0.084
0.285
0.491
0.718
0.922
1.133

②糖化酶活力测定结果
编号
样品管A
样品管B
OD（540nm）
0.332
0.289

③糖化酶活力的计算
OD的平均值=（A+B）/2=(0.332+0.289)/2=0.3105
根据酶活计算公式：
酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5
A:样品的OD值(平均值) K:标准曲线的斜率
N:稀释倍数 5:0.2毫升反应液转换为1毫升体积
T:反应时间（min） 1000:转换因子1mmol=1000μmol
W:葡萄糖的分子量（180.2g/mol）
代入数据可得：
酶活（U/g）=（(A×K+b)×N×1000/（T×W））×5
=((0.3105×0.9479+0.126）×1×1000/(15×180.2)) ×5
= 0.7775
3、思考题：请你建立一个“筛子”，从土壤中筛选出能产生植酸酶的微生物。
答：采集土样(除土层表面枯枝、 杂草和砂石， 收集距表层5cm~10cm土壤)
将采集的土样进行10 -1 ~10 -6 梯度稀释后，分别涂布于改良的含溴甲酚绿的植酸钙平板初筛培养基上，在30℃的恒温箱中培养3d，然后观察菌落周围是否
形成透明水解圈。
因为培养集中含有水溶性较差的植酸钙，因而含植酸钙的平板上会呈现浑浊态。若菌株代谢产生植酸酶，植酸钙被酶降解，在菌落周围形成透明水解圈，可起到一定指示作用。此外可选取溴甲酚绿、溴甲酚紫、中性红及刚果红等4种常用染色剂添加至平板初筛培养基中，在加深培养基背景色的同时，以增强植酸钙水解后形成的透明圈可见性。