儿童脊髓性肌萎缩症的基因诊断.pdf

袁舶 刍第2 o 卷 第1 0 期2 0 0 5 年1 0 月 J A p p l C l in P e d ia tr V o 1 2 0 N o 1 0 O c to b e r 2 0 0 5 小 儿 神 经 基 础 与 I搐 床 联合主办 实用 儿科 临床 杂 志 编 辑 部 一 一 论 著 儿童脊髓性肌萎缩症 的基 因诊断 梁国安，周柏林，余钟声 (1 浙江省台州医院，浙江 台州 3 l 7 0 0 0；2 浙江大学医学院附属儿童医院，杭州 3 l 0 0 0 3)摘要目的探讨儿童脊髓性肌萎缩症(S MA)的特异性 基因诊断方法。方法应用聚合酶链 反应一 限制性片段 长度多态 性(P C R RF L P)技术，对 l 9例临床诊断 为 S MA患 儿及 2 1 名健康儿童的运动神经元存活(S MN)基 因进行检测 结果S MA患 儿 S MN基因的第 7和第 8号外显 子均缺 失，健康儿童 S MN基 因的 第 7和第 8号外显子均未缺失 结论检测 S MN基因第 7 和第 8号外显 子缺失 的方法 町用于 S MA的基因诊断，且 P C R RF L P技术对 S MA的诊断具有较 高的特 异性 和敏感性。实焉 L 科临床杂志 2 0 0 5,2 0(1 0 ：1 0 1 11 0 1 2 关键词 脊髓性肌萎缩；运动神经元；基 因 中图分类号 R 7 2 9 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 35 1 5 X(2 0 0 5)1 0 1 0 1 1 0 2 Ge ne Di a g no s i s o f Sp i n al M u s c ul a r At r op hy i n Chi l d r e n LI AN G Gu o一，。Z HOU J l i n：YU Z h o n g s h e n g：(1、F a iz h o u H o s p i t a l o f Z h e j i a n g P r o v in c e，T a i z h o u 3 1 7 0 0 0，C h i n a；2 Th e Af f i l i a t e d Ch i ld r e n s H o s p i t a 1 Medi c a l C o l l e g e o f Z h e j i a n g Un i v e r s i t y，H a n g z h o u 3 1 0 0 0 3，C h i n a)A b s t r a c t：Ob j e c t i v e T o e s t a b l i s h a g e n e d ia g n o s i s a s s a y f o r s p i n a l mu s c u la r a t r o p h y(S MA)i n c h i l d r e n Me t h o d A n a l y s is o f t h e s u r v i v a l mo t()r n e u r o n(S MN)g e n e in 1 9 S MA p a t i e n t s a n d i n 2 1 n o ml a l c o n t r o l s we r e p e r f o rat ed b y u s i n g t x)l y me r a c h a i n r e a c t i o n f r a g me n t l e n g t h p o l y mo r p h i s r n(I)(：RRFLP)me t h cM Re s u l t De le t i o n of e x o n 7 a n d 8 i n S MNt g e ne we r e f o u n d i n a l l 1 9 S M A p a t ie n t s，wh i l e n o s u c h c h a ng e s we r e f o u n d i n n or ma l c o n t r ols，Co n c l u s i o n Th e SM Nt g e n e e x o n 7 a nd 8 e x a mi n e c a n b e a p p l i ed t O S M A g e n e d i a g n o s i s a n d t h e P(1lR RFLP me t h o d h a v e hig h e rn s i t i v it y a nd p a r t i c u l a ri t y t O t h e S M A d i a gn o s i s J A p p l C l i nP e d i a t r 2 0 0 5 2 0(1 0)：1 0 1 11 0 1 2 Ke y wo r d s：s p i n a l mu u I a r a t r o p h y；n ：)t o r n e u r o n,g e n e 脊髓 性 肌萎缩 症(s p i n a l mu u la r a t r o p h y，S MA)是 一组 常见的由于脊髓前角细胞变性 导致的进行 性肌无 力、肌萎缩 为特征的常染色体隐性遗传病。其发生率在活产婴儿中为 l 万，在携带者中为 1 5 0，居致死性常染色体隐性遗传病第 2位，仅次于囊性纤维变。1 9 9 5 年 L e f d w r e 等【!在5 q l 3 1 发现了运 动神经元存 活(s u r v i v a l mo t o r n e u ron，S MN)基 因，S MN基 因 在一条染色体上具有 2个拷贝，在端粒侧称 S MNt，位于中心 粒侧称 S MN c。我们应用 t K R法，结合限制性片段长度多态 性(R F L )技术，对临床诊断 l 9例 S MA患 儿作 S MN基因缺 失 的研究。资料与 方法 一、一般 资料S MA患 儿 1 9例 均来 自 2 0 0 2年 8月 2 0 0 4年 1 月浙江大学 医学院 附属儿 童医 院神经 科 门诊或 住 院病例。男 1 2例，女 7例，发病年龄 1 4 d 7岁 均符合临 床诊断 及分 型 标 准l 3 J，经 肌 电 图及 肌 肉活 检 确 诊。其 中 I型1 4例，型 2例，I 型 3例。正常X-t N组 2 1 名，男 l 1 名，女 1 0名，年龄 2个月 1 2岁。二、方法1 D N A的提取：取抗凝静脉血 0 2 n ，加 0 8 7 氯化氨 l n ，3 7水浴 1 5 mi n，2 0 0 0 r ra i n离心 1 0 mi n，弃上清 液。再重 复 2次。沉 淀 即为 白细 胞。用 蛋 白质 沉 淀法 提 取 收稿 日期 2 0 0 5 0 7 2 5 作者 简介 梁 国安，男，主治医师，硕 士学位，研 究方 向为神经 系统 疾病。I)N A，紫外分光光度计测定 D N A浓度，用 双蕉水调整 D N A浓度 为 1 13 0 n g J L。2 P C R扩增：(1)引物序列 分别 为：扩增 S tV L t 基 因 7号 外 显子 引 物 为 5 -A G A CF AI I 2 AA CI T A A V KI G A T C 3 、5 丌 I 丌 邢 几 r I 1 3 ，其 中第 2条引物 为错配引物；扩增 S mN t 基因 8号外显子引物 为 5 -(v r A (、(A AI(：凸 d A A 3、5 一(=1(r r I I lA(G一 3 (2)R反应体系为 5 0 L，其中 4d N T 4 L(最终浓度 2 0 0 ml o l L)，l 0B u f f e r 5 I t L，引 物 均 为 l L(最 终 含 2 5 p mo 1)，Ta q酶 0 5 L(最终 含 2 5 U)，DN A模板 6 t I，加 入双蒸水 3 2 5 I 。每次 实验 均设 阳性 和阴性 时 照(阳性患 者 D N A样品 由宾 夕法 尼 亚 大 学 陈 克 连 先 生 惠 赠)。采 用 P C R自动扩 增 仪 扩 增。(3)P C R反 应 条件 为 9 4 预 变性 5 rai n，9 5变性 l 5 s，第 7外显子 5 5退 火 l 5 S，第 8外显 子 6 0退火 1 5 s，7 2 延伸 l 5 s，共 4 0个循环，最 后 7 2延 伸8 rai n。3 R F L P分析：酶切体系 2 5 t t L，其中 1 0B u f f e r 2 5 L，牛血清清蛋 白 0 2 5 I*L，P C R扩增产 物 1 0 L，外显子 7加入 D r a l 7 U，外 显子 8加 入 D d e I 7 U。3 7 水浴 3 h。终 止酶切后，取 2 0 L，在 4 琼 脂糖 凝胶(已混匀 适量 溴化 乙 锭)中电泳，在凝胶成像分析 系统 中观 察 录结果 结 果 一、正常对照组及 S MA组 D r a I 酶切 结果正 常对照 组 2 1名中 2 0名均可 见 S MNt 基 因外显 子 7的 P C R扩 增 产物 1 8 8 b p条带 和 S MN e 基因 P(：R扩增产物 酶切后 的 l 6 4 b D条 维普资讯 http:/ 1 01 2 癣 用 N 啪第 2 0 卷 第l o 5 1 2 0 0 5 年1 0 月 J A p p l C l iH P e d ia tr V o 1 2 0 N o 1 0 O c to b e r 2 0 0 5 带。l 例仅见 S MNt P C R扩增产物 1 8 8 b p条带，无 S MN c 基 因 P C R扩增产物酶切后的 1 6 4 b p条带。诊 断为 S MA 1 9例 患 儿均 未见 S MNt 基 因外显 子 7的 P C R扩增产物 1 8 8 b p条 带 仅见 S MN c基 因 P C R扩 增 产物 酶 切后 的 1 6 4 b p条带。其 中 2例正 常儿 童及 2 例 患儿的电泳结果见图 1。二、正常对照组及 S MA组 D d e l 酶切 结果j E 常 对照组 均可见 S MNt 基 因外显子 8的 P C R扩增 产物 1 8 8 b p和 S M N c 基 因 P C R扩增 产物 酶切后 的 1 2 0、6 8 b p共 3条带。其 中 2例正常儿童 的电泳结果 见 图 2。诊 断的 S MA 1 9例患 儿 均 未见 S MNt 基因外 显子 8的 P C R扩增产物 1 8 8 h p 条带，仅 见 S MN c 基 因 P C R扩增产 物 酶切 后 的 1 2 0、6 8 b p条带。其 中 2例患儿的电泳结果见 图 2。讨 论 S MA是一组常见的致死性常染色体隐性遗传病，1 9 9 5 年以前 本病 主要依 靠病 史、体征、肌 电图 和肌 肉活 检等 有 创 检 查进 行综 合诊断 l 3 ，误 诊 率和漏 诊率 很 高，故有 必 要建立 基因诊 断予以早 期确 诊，也 为产前 诊断 奠定 基 础，这是 目前 防治 S MA、提高人 口素质最有效 的方法 B r z u s t o wic z等 于 1 9 9 0年 将 S MA 基 因 首 次 定 位 于 5 q l 3。1 9 9 5年 L e f e b v r e和 R o y为首 的两组 实 验室 分别 报道 他们各 自克 隆 的 2个 不 同 基 因，均 位 于 5 q l 3 1。L e f e b v r e 等l 2 一 克隆的基因命名为 S MN基因，R o y等 克隆的基因命 名为神 经元 凋亡 抑 制 蛋 白(n e u r o n a l a p o p t c s i s i n h i b i t o r y p r o t e i n，N AI P)基因。1 9 9 7年 C a r t e r 等 J 发 现在 此 区域 的 基本 转 录因子 2 p 4 4(b a s a l t r a n s c r i p t i o n f a c t o r 2 1M4，B TF 2 p 4 4)基 因 的缺失亦与 S MA 有关。研 究 表明，S MN基 因是 S MA 的决 定基因，其 他 2个均 为修饰 基 因。S MNt 基 因缺失 是该病 发 病的主要原 因。近年 来，不 同 作 者 及不 同地 区相 继报 道 了 S MN t在 S MA 患 儿 中 的 纯 合 缺 失 缺 失 率 为 8 7 1 00 0 ，且 与 S MA表 型无 明显关 系。Wi r t h 川 j 根据 目 前统计学 资料 及 S MN表达 产物生 物学 行为研 究认为，三 S MA均 由 S MN 突 变 引 起，而 大 约 5 的正 常 人 群 可 发 现 S MNc 纯合缺失。S MN基因共 含有 8个外 显子，S MNt 和 s MN c 基 因在第 7和第 8号外显子 分别存 在单个碱 基 的差异，前 几年 多数 实 验 室采用 聚合酶链反应一 单链构象 多态性(P C R S S C P)进行检 测，其实验要求高，电泳时 温度变 化等 可通 过 影响单 链 D N A 的折叠 而易造成 假 阳性或 假阴性 结果 1 1，使其 在临 床实 验室应用受到 限制。我 们参照 国外报 道l 8 ，采用 P C R R F L P 法进行检测：由于 S MN c外显子 8上有 1 个 D d e I的酶 切位 点，而 S MN t 的外显 子 8没有 这个位点，P C R扩增 S MN外显 子 8后进行 D d e I酶切，能检 测是 否有 S MN t 的外 显子 8的 缺失。S MN t 外 显子 7也 可用 P C R后 酶切进 行 检 测，S MNt 外显子 7的密码子 2 8 0为 r T(、，S MNc 外显 子 7密码 子 2 8 0 为 1 v 兀，在引物 3 端第 2个 碱基上 引 入突变 碱基 T，使有：卷 义链上碱基 G变为 A，与 S MN c外显子 7的密码子 2 8 0形成 D r a l 的酶切 位点，S MN t 外 显子 7不存在此位点，酶切后 电泳 能显 示两者差别。7号外 显子 t K R扩增产物经 D r a l 酶切后，因 S N L Nt 基 因上无该 酶切 位点，未能切 动；而 S MN c基 因由 于采用错 配引物构建了一个 D r a l 酶切位点，1 8 8 b p片段经 限 制性 内切酶消化后得 到 1 6 4 b p及 2 4 b p片段。在 正常对 照 中，同时可见到 1 8 8 b p和 1 6 4 b p 2条 带(2 4 b p片段较 短，已 走 出胶)。同样，在 8号外 显子，因 S MN c基因存 在 D d e l 酶切 位点，酶切后 得到 l 2 0 b p和 6 8 b p片段，S MNt 无此 位点，故 在正常对照组 中忙 刁 时可见 1 8 8 b p、l 2 0 b p和 6 8 b p 3条带。该 法的优点是灵敏 度高、诊 断快 速准 确、方 法简 便且结 果 容 易 判断。同时 也可与 P C R S S C P法相互验证，互为补充。本组 l 9例临床诊断 S MA患儿 均同时缺 失 S MNt 基 因的 第 7和第 8号外 显子，而 2 l 例 正常儿童均无此缺失。提示检 测 S MNt 基因第 7和第 8号外 显子缺 失 的方法 可用 于 S MA 的基因诊断，P C R RF L P技 术对 S MA 的 诊断具有 较 高的 特异性和敏感性，具有 临床实用 意义，对 S MA家 系的遗 传咨 询及产前诊断亦有重要 价值。(本文 图 l，2见插 图 l 0 一)参考文献 l l J Mo n a n i UR，C o o v e r t D D B u r g h e s A t MA n i n ml mo d e l s o f s p i n a l mu u l a r a t r o p h y J J Hu m Mo l G e n e t 2 0 0 0 9(1 6)：2 4 5 l 2 4 5 7 【2 J L e f e b v r e S，B u r g l e n L R e b o u l l e t S e t a 1 I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r iz a t io n o f a s p i n a l mu u l a r a t r o p h yd e t e r n fi n i n g g e n e J C e l l，1 9 9 5 8 0(1)：1 5 5 1 6 5 3 左启华 4,J L 神经 系统疾病 M 第 2版 北 京：人民卫生 出版社 2 00 2：8 6 086 2 4 李 文磊 吴婷 丁新 生，等 脊髓性 肌萎缩 症的基 因诊断 J 国 外医学：神经外科 学分册，2 0 0 4 3 1(4)：3 4 6 3 4 9 5 王旭 邹 丽萍 方方 等 运 动神经 元存活 基因与 儿童期脊 肌 萎缩症 临床特 征研究 J 临床儿科 杂志 2 0 0 5 2 3(5)：2 7 5 2 7 7 1 6 J R o y N Ma h a d e v a n MS Mc l e a n M e t a 1 I h e g e n e f()r n e u ron a l a p o p t o s is inh i b i t o r y p r o t e in is p a r t i a l ly d e le t e d in i n d i v i d u a l s wi t h s p i nal mu u l a r a t mp h y J J l l，1 9 9 5 8 0(1)：1 6 7 1 7 8 7 j(t a r t e r T A k mn e n m n n(、(Wa n g C H e t a l A n mh ic o p y t r a n r i p t io n r e p a i r g e n e B TF 2r,4 4 ma p s t()t h e SM A r e g io n a n d d e mo n s t r a f e s S MA a s s()c i a t ed d e l e t i o n s l J j Hu m Mo l(?le t 1 9 9 7 6：2 2 92 3 6 8 l e f e b v r e S B u r l e t P Vio u e t Le t a 1 A x o v e l a s s()c i a t i 0 n o f t h e S MN p r o t e in wi t h t w o ma j o r n o nr i b o s o n m l n mc l e o l a r p r o t e i n s a n d it s i mp l i c a t i o n i n s p i nal n l u u l a r a t r o p l i y J J，Hu m Mo l G e n e t 2)0 2 1 l(9)：1 0 1 7 1 0 2 7 9 曾卫民 尹飞 杨金莲 等 同时检 测两种 运动神 经元存活 基因 第 7外显子缺失的简便方法及 其临床应 用 J 实用 儿科临 床杂 志 2 0 0 3 1 8(2)：1 0 8 1 0 9 1 0 Wi r t h B A n U l X a t e o f t h e n mt a t io n s p e c t r u m o f t h e s u r v iv a l m o t o r n e u r o n g e n e(S M N1)in a u t c,o nml r e c e,iv e s p in a l n l u u l a r a f r o p h y(S MA)J J，Hu m Mu t a t，2 0 0 0 1 5(3)：2 2 82 3 7 1 1 Nie l n DA，N o v o r a d o v s k y A(；o ld ma n I)，e t a 1 s S(P p r i me r d e s ig n b o n s i ng l e s t r a n d DNA s t r u c t u r e p r ed ic t ed b y a DNA fi)l d in g p r o g r a ml J j Nml e i 。A(k l s R e s 1 9 9 5，2 3(1 2)：2 2 8 7 2 2 91 1 2 F u r u wa t a r i C Ya g i A Y a n m g a mi 0 e t u 1 A c o mp r e h e n s i v e s y s t e m t o e x p lo r e p 5 3 mu t a t i o n J J，A，j J(l i n P“t h,1 1 9 9 8 I l 0(3)：3 6 8 3 7 3 1 3 J(T u o I，L o p z E S o l e r B o t ij i a C e t“，A g e n e t i e a n d p h e n o t y p i c a n a l y s i s i n Sp a n i s h s p i n a l u l u t u l a r a t r o p h y p a t i e nt s wi t h(、3 99 4 0 2 d e t AGAG，t h e mo s t f r e q u e n t ly f o u n d s u b t le n mt a t i o n in t h e s M I g e n e J j，Hu m Mu t a t，2 0 0 3 2 2(2)：1 3 61 4 3 维普资讯 http:/ 填 空韪 5 目前认 为新 生儿肺 出血 的病 因主要 与以下 因素有 关：(1)(2)()(4)6 新生儿肺 出血发病率虽然仅 占活产婴的 7 新生儿肺出血的临床表现分 8 病理 学上将2 个肺叶 以上融合性 出血称 为，但其病死率却高达，但两者常为一连续过程。9 新生儿肺 出血采用机械通 气治疗时至今仍首选 1 0 预防新生儿肺出血最有效的方法是 儿 童 脊 髓 性 肌 萎 缩 症 的 基 因 诊 断 6 5 4 3 2 1 M a r k e 2 0 0 0 b o 1 0 0 0 b 1)7 5 0 b p 5 0 0 b o 2 5 0 b 1 O 0 b p 图 1 外显子7 电泳结果I、2：S M A,J L：3、4：正 常儿 童 5：阳性对照：6：阴性对照 Fi g ur e 1 Re s t r i c t i o n En z y me Pr o du c t s o f Ex o n7 1，2：S MA 5：Po s i t i ve Co nt r o l 6：Ne g a t i v e Ma p p i n g o f Amp l i f i e d PCR Pa t i e n t；3，4：No r ma l Co nt r o l：Co n t r o l 2 0 0 0 l 0 0 0 7 5 0 5 0 0 25 O l O O M a r k e r l 2 3 4 5 6 (正 文见 第 1 0 1 1 页)图 2 外显子8 电泳结 果1：阴性对照：2：阳性对照：3、4：正常儿童：5、6：S M A 患儿 Fi g ur e 2 Re s t r i c t i o n En z y me Map p i n g o f Amp l i f i e d PCR Pr o d uc t s o f Ex o n 81：Ne ga t i v e Co n t r o 1；2：Po s i t i ve Co n t r o l；3，4：No r ma l Co n t r o l；5，6：S M A Pa t i e n t 高分辨率计算机断层照像术诊断支气管扩张症 1例 图 1 常规c T 右下肺条索状致密影 Fi g ur e 1 C he s t Co n v e n t i o n a l CT S h o we d S l o t Co mp a c t I ma ge at Ri gh t I nf e r i o r Pu l mo na r Y 图 2 高分辨 率c T 显示“印戒征 Fi gu r e 2 HRCT S h o w e d S i g ne t Ri ng S i n g a n d Th i c k-Wa l l e d Br o n c h u s 插 图 1 n T T (正文 见第 1 0 4l 页)图 3 高分辨率c T 显示扩张支气管的“双轨征，Fi gu r e 3 HRCT Sh o we d Di l a t e d No nt a p er in g Br o nc h u s “?f 维普资讯 http:/