花生过敏原Ara h2.02的克隆、表达及免疫学鉴定.pdf

收稿日期:2010?06?27;*通讯联系人.基金项目:国家自然科学基金(30871752),深圳出入境检验检疫局科技计划(SZ2008105),深圳市深港创新圈和深圳大学创新团队基金资助项目.作者简介:易海涛(1984?),男,湖北广水人,硕士研究生,主要从事医药生化与分子生物学方面的研究.文章编号:1000?5862(2010)05?0531?05花生过敏原Ara h2.02 的克隆、表达及免疫学鉴定易海涛,?刘志刚,?闫?浩,?刘?芳,?赵郭存,?夏立新*(深圳大学 医学院 过敏反应与免疫学研究所,广东 深圳?518060)摘要:通过提取花生总 RNA,设计特异性引物,RT?PCR 克隆花生 Ara h2.02 基因,将反转录的基因连入pMD19?T Simple Vector,提质粒酶切鉴定并测序,将测序正确的片段连入原核表达载体 pET?32a(+)上,并转入 BL21(DE3)宿主表达菌中,IPTG 诱导表达、Western?blotting 检测该重组蛋白的免疫原性.测序结果表明:克隆的花生 Ara h2.02基因片段全长为 519 bp,编码为 172 个氨基酸,与 GenBank 中蛋白序列 100%相同.诱导表达后的蛋白经 SDS?PAGE 鉴定,目的蛋白大小与理论值相符.Western?blotting 结果表明该蛋白能与花生过敏病人混合血清中的 IgE 结合具有免疫原性.成功克隆并表达了花生过敏原 Ara h2.02,该基因表达的重组蛋白具有良好的免疫原性.关键词:花生;过敏原;Ara h2.02;克隆;表达;免疫印迹中图分类号:Q 785?文献标识码:A过敏性疾病被世界卫生组织列为 21 世纪重点防治的 3 大疾病之一,是当前世界性的重大卫生学问题,世界各国过敏反应性疾病的总发病率高达 10%30%,此类型疾病包括食物过敏、过敏性哮喘和过敏性鼻炎等,是临床上的常见病、多发病1?2.世界粮农组织(FAO)1995 年报告,90%以上的食物过敏是由牛奶、鸡蛋、鱼、贝壳海产品、花生、大豆、坚果类和小麦引起 3.食物中能使机体产生过敏反应抗原分子称为食物过敏原,它们大多为蛋白质4?5.据报道,花生过敏占食物过敏的 10%47%6,因此花生蛋白是重要的食物过敏原.花生是?90年代中国食物结构改革与发展纲要 中提出的重点开发利用植物蛋白之一.随着国民饮食结构的变化,花生消费将不断增加,花生过敏发病率可能会呈上升的趋势.重组过敏原是当今乃至未来变态反应学的重要研究方向7.目前国际免疫联合会命名小组委员会认可的花生过敏原有 11种8,其中Ara h2是一种主要的花生过敏原,超过 90%的花生过敏患者血清 IgE 都能够识别 Ara h29.大量研究表明:Ara h2 包含有 2 个亚型,分别为Ara h2.01和Ara h2.02,与过敏原Ara h2.01相比,Ara h2.02多1 个IgE 结合表位,因此其致敏性可能更严重10.本文成功克隆表达出花生 Ara h2.02 蛋白,并对该蛋白进行免疫学鉴定,为花生过敏的临床诊断和治疗奠定了生物学基础.1?材料与方法1.1?材料和试剂1.1.1?材料?花生从深圳市南山区学府路人人乐超市购买;所用花生过敏患者的 10 份阳性血清以及 3 份阴性对照血清取自于海口市人民医院(经 Unit CAP 检测,二级以上);大肠埃希菌(E.coli)Top10 和 BL21(DE3)由深圳大学过敏反应与免疫学研究所提供.1.1.2?试剂?RNA 提取试剂盒购于德国Qiagen 公司,cDNA 合成试剂盒(AMV first strand cDNA synthesis kit)购于美国 Bio Basic Inc.(BBI)公司.克隆所用的特异性引物由华大基因合成;琼脂糖凝胶回收试剂盒 Gel Ex?第 34 卷第 5期2010 年 9 月?江西师范大学学报(自然科学版)JOURNAL OF JIANGXI NORMAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)Vol.34 No.5?Sep.2010traction Kit(50)D2500?01 以及质粒小量提取试剂盒 Plasmid Mini Kit!(100)D6943?01 均购于美国 OMEGA公司;克隆载体 pMD19?T Simple Vector、表达载体 pET?32a(+)、LA?Taq DNA 聚合酶、限制性内切酶 EcoR!和Hind、T4 DNA 连接酶以及 DL2000 DNA Marker 均购于宝生物工程(大连)有限公司(Takara);羊抗人二抗IgE 购于美国 KPL 公司.1.2?方法1.2.1?引物的设计合成?从GenBank 上下载花生 Ara h2.02 的核酸序列,利用 GeneTool 软件设计并合成特异性引物(由华大基因合成):上游引物为 5#CGgaattcATGGCCAAGCTCACCATACTAGTA 3#;下游引物为5#CCCaagcttTTAGTATCTGTCTCTGCCGCCAC 3#,其中分别插入 EcoR!(gaattc)和 Hind(aagctt)酶切位点以及保护碱基(CG)和(CCC).1.2.2?花生 Ara h2.02 基因的RT?PCR 扩增?取 2 粒饱满的花生于液氮中充分研磨,取约 100 mg 于 RNaseFree 离心管中,按照Qiagen 公司试剂盒说明书提取总 RNA.采用美国 Bio Basic Inc.(BBI)公司 cDNA 合成试剂盒(AMV first strand cDNA synthesis kit),以总 RNA 为模板反转录成 cDNA,以合成的 cDNA 产物为模板进行PCR 扩增.电泳检测 PCR产物,并割胶回收.1.2.3?pMD19?T Simple Vector?Ara h2.02 载体的构建以及测序?利用T4DNA 连接酶将回收纯化的 RT?PCR产物与 pMD19?T Simple Vector 进行连接,连接产物转入经 CaCl2处理的感受态细胞即 E.coli Top 10 克隆菌中.通过含氨苄青霉素(Amp)的 LB 平板进行抗氨苄筛选,挑取阳性菌落(含重组质粒)进行扩增提取质粒,并对质粒进行双酶切(EcoR!和Hind)鉴定,对双酶切合理的质粒进行测序.1.2.4?花生 pET?32a(+)?Ara h2.02 表达载体的构建以及测序?对测序正确的 T 质粒与原核表达载体pET?32a(+)分别进行 EcoR!和Hind 双酶切,并将获得的目的基因片段Ara h2.02 和切开的 pET?32a(+)载体进行胶回收,利用T4DNA 连接酶将回收产物相互连接,构建重组表达质粒.将重组质粒转化入 E.coliTop 10,通过含氨苄青霉素(Amp)的LB 平板进行抗氨苄筛选,提取阳性质粒,进行双酶切鉴定,并对阳性克隆进行测序鉴定.1.2.5?重组表达载体 pET?32a(+)?Ara h2.02在 E.coli BL21(DE3)中表达?将重组表达载体 pET?32a(+)?Ara h2.02 转化到 E.coli BL21(DE3)中,转化成功后挑取抗 Amp 阳性菌落于 20 mL LB 培养基中,37 ,160r/min 过夜培养.次日将上述培养液倒入 500 mL 灭菌的新鲜的培养基中,再加入 500?L 氨苄青霉素进行二活培养,二活一段时间后测菌液的 OD 值,待菌液 OD 值为 0.6 时,取 1 mL 菌液作为诱导前的对照,然后加入500?L IPTG 诱导4 h.诱导后取 1 mL 菌液作为诱导后的对照,分别将诱导前、诱导后的菌液离心,并分别用1 mL去离子水清洗,离心弃上清液,再用 80?L 纯净水重悬菌体.将上述诱导后的菌液离心、弃上清液,沉淀用 30 mL 20 mmol/L Tris?HCl(pH=8.0)溶解,溶解后超声破碎,超声 20 min 左右后离心,再将沉淀和上清液分装.沉淀先用 1 mL 去离子水清洗,离心弃上清液,再用80?L去离子水重悬,上清液取 80?L.然后将诱导前、诱导后上清液和沉淀 80?L 分别加入 20?L LoadingBuffer,再用十二烷基硫酸钠?聚丙烯酰氨凝胶电泳(SDS?PAGE)检测表达情况.1.2.6?重组花生Ara h2.02 的免疫活性测定?免疫印迹(Western?blotting),先将含有目的蛋白的样品和蛋白Marker 进行 SDS?PAGE,然后再在 350 mA 条件下进行SDS?PAGE 转膜,电泳 50 min 后即将胶上的蛋白转移到硝酸纤维素膜(即NC 膜,且将 NC 膜剪成4 cm 和 2 cm 宽的长条)上.10 份对花生过敏病人的混合血清作为一抗,羊抗人 IgE 作为二抗,3 名健康人混合血清作为阴性对照,DAB 试剂盒显色分析.2?结果2.1?花生 Ara h2.02 基因的克隆提取花生总 RNA,设计特异性引物进行 RT?PCR,将扩增的产物经琼脂糖凝胶电泳(图 1),在 519 bp 左右有一亮带,大小与理论上的预计值相符.2.2?pMD19?T Simple Vector?Ara h2.02 载体的构建将上述凝胶电泳产物进行胶回收,回收产物与 pMD19?T Simple Vector 连接,并将连接产物转入 E.coli532江西师范大学学报(自然科学版)2010 年Top 10,通过抗Amp 筛选,挑取单菌落进行扩增,提质粒并做双酶切鉴定,目的条带与RT?PCR 一致(图 2),而且测序结果与 GenBank 上 Ara h2.02 基因序列一致.M:D NA 标志物(DL2000);1.克隆后的花生过敏原 Ara h 2.02.图 1?花生 Ara h2.02 RT?PCRM:DNA 标志物(DL 2 000);1 2:花生过敏原 Ara h2.02.图2?pMD19?T Simple Vector?Ara h2.02 载体双酶切(EcoR!和 Hind)鉴定2.3?花生 pET?32a(+)?Ara h2.02表达载体的构建用 EcoR!和Hind 双酶切 pET?32a(+)?Ara h2.02 表达载体,琼脂糖凝胶电泳结果表明,切出的目的条带大小为 519 bp 左右,与理论值相符(图 3).将阳性菌及其质粒进行测序,结果表明 GenBank 上Ara h2.02 基因序列一致.2.4?花生 pET?32a(+)?Ara h2.02载体诱导表达含有 pET?32a(+)?Ara h2.02 的 BL21(DE3)表达菌在 0.1 mmol/L 的 IPTG 诱导 4 h 后,超声破碎,分别对诱导前、诱导 4 h 后、超声上清液、超声沉淀物进行 SDS?PAGE 电泳,结果显示:Ara h2.02 蛋白主要存在于沉淀部分(图 4).由图 4 知,表达的蛋白大小约为 38 kDa,由于该基因诱导表达的产物因连接有 pET?32a(+)上的His?Tag,去掉pET?32a(+)载体的N 端含有的硫氧环蛋白和 6个His?Tag(大约为 20kDa),恰好是Ara h2.02蛋白大小 18 kDa.M:DNA 标志物(DL 2 000);1 2:花生表达载体质粒 pET?32a(+)?Ara h2.02经 EcoR!和 Hind 双酶切后.图 3?表达载体 pET?32a(+)?Ara h2.02 EcoR!和 Hind双酶切鉴定图M:蛋白标志物;1:诱导前;2:IPTG 诱导 4 h 后;3:超声后上清;4:超声后沉淀.图 4?花生 Ara h2.02 蛋白的诱导表达533第 5期易海涛,等:花生过敏原Ara h2.02 的克隆、表达及免疫学鉴定M:蛋白标志物;1:病人混合血清;2:健康人的血清.图 5?重组花生Ara h2.02 蛋白的免疫印迹分析2.5?重组 Ara h2.02 的免疫活性鉴定Western?blotting 结果显示,10份过敏患者混合血清在约 38 kDa 处有一明显条带,而健康人血清中则无条带,表明重组Ara h2.02 蛋白有着与 IgE 良好的结合活性(图 5).3?讨论食物过敏已成为重要的食品安全问题.据统计,全世界有 8%的儿童和 2%的成年人对食物过敏11.发达国家超过 20%的人受食物过敏性疾病困扰12.在8 类食物过敏原中,花生被认为是最重要的花生过敏原之一13.叶世泰教授在我国常用食品致喘 40 例分析中指出,花生等油料作物居食物过敏原的前列 14.花生过敏反应是人体对花生过敏原产生的由 IgE 介导的 I 型超敏反应15.花生常引起严重的过敏反应,如咽喉水肿、急性严重哮喘、过敏性休克,发生很快,如不及时抢救,有可能导致死亡16.花生过敏同其他食物过敏一样属于即时性过敏,但是与其他食物过敏的不同之处在于,花生过敏病人的这种疾患是终身的,即病人不会随着年龄的增长而对花生的过敏性消失17.Ara h2 分为Ara h2.01 和Ara h2.02 2 种亚型,两者的差异是Ara h2.02多出1 个由 12个氨基酸组成的肽段18.正是因为如此,Ara h2.02 比Ara h2.01 相对分子质量大(其中 Ara h2.01 为 16 670 kDa,Ara h2.02 为18 050 kDa)19.经肽段分析已经确定 Ara h2一共含有 10 个 IgE 结合表位,其中的 3 个抗原决定簇被认为是优势表位,并且在这 3个抗原决定簇中的2 个区域内都有专一的氨基酸序列DPYSPS,该序列被认为是IgE 结合所必需的.而对于 Ara h2.02多出的 12个氨基酸刚好形成第 3个重复序列 DPYSPS因而多出 1个 IgE 结合的线性表位20,因此其致敏性可能更严重.本研究在国内率先成功克隆表达了花生 Ara h2.02 蛋白,该重组蛋白与 10 名花生过敏患者混合血清中的IgE 有良好的结合活性,而对健康对照的混合血清没有结合活性,表明重组花生 Ara h2.02 蛋白具有良好的免疫原性.该实验为今后利用重组过敏原蛋白进行临床诊断和治疗及分子疫苗的开发打下了基础.参考文献:1?Liu Zhi?gang,Bai Yu,Ji Kunmei,et al.Detection of Dermatophagoides farinae in the dust of air conditioning filters J.Int Arch AllergyImmunol,2007,144(1):85?90.2?闫浩,邬玉兰,夏立新,等.牛乳主要过敏原?乳白蛋白基因的克隆及其原核表达载体的构建 J.江西师范大学学报:自然科学版,2010,34(3):244?248.3?FAO.Report of the FAO technical consultation on food allergies R.Rome:Food and Agriculture Organization,1995.4?杨勇,阚建全,赵国华,等.食物过敏与食物过敏原 J.粮食与油脂,2004(3):43?45.5?赵志常,张建军张皖蓉,等.拟南芥 DnaJ 蛋白的过量表达对细菌耐盐性的影响 J.广西师范大学学报:自然科学版,2010,28(1):54?57.6?Poms R E,CapellettiC,Anklam E.Effect of roasting history and buffer composition on peanut protein extraction efficiency J.Mol NutrFood Res,2004,48(6):459?464.7?李宏,张宏誉.花生过敏原 Ara h1 的基因克隆与原核表达 J.中华微生物学和免疫学杂志,2001,4(21):7?11.8?JinTengchuan,Guo Feng,Chen Yu?wei,et al.Crystal structure of Ara h3,a major allergen in peanut J.Mol Immunol,2009,46(8/9):1796?1804.9?Wijk F V,Hartgring S,Koppelman S J.Mixed antibody and T cell responses to peanut and the peanut allergens Ara h1,Ara h2,Ara h3and Ara h6 in an oral sensitization model J.Clin Exp 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recombinant Ara h2.02,induced by IPTG,which is consensus with the actual value.Theaffinity between recombinant Ara h2.02 and IgE antibodies from pooled peanut?allergic patients serum was identified byWestern?blotting.Peanut recombinant Ara h2.02 protein was obtained with allergenicity.Key words:Arachis hypogaea L.;allergen;Ara h2.02;cloning;expression;Western?blotting(责任编辑:刘显亮)535第 5期易海涛,等:花生过敏原Ara h2.02 的克隆、表达及免疫学鉴定