二醋酸纤维素_离子液体膜固定肌红蛋白制备过氧化氢传感器.pdf

DOI:103724/SP J1096201101358二醋酸纤维素-离子液体膜固定肌红蛋白制备过氧化氢传感器董社英*1谷广哲1于竹青1周元臻1汤宏胜2郑建斌21(西安建筑科技大学理学院，西安 710055)2(西北大学分析科学研究所 陕西省电分析重点实验室，西安 710069)摘要将二醋酸纤维素(CDA)-(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体)(bmim BF4)-肌红蛋白(Mb)的复合物修饰在玻碳电极(GCE)表面，制备了一种新型 Mb 修饰电极(CDA-bmimBF4-Mb/GCE)。光谱分析表明:固定在 CDA-bmim BF4-Mb 膜中的肌红蛋白保持了其天然构象和生物活性。离子液体促进了 CDA-bmim BF4-Mb 膜中的电子转移，极大地提高了修饰电极的导电率。Mb 修饰电极对过氧化氢的还原具有明显电催化作用，其表观米氏常数 Km为 1 758 104mol/L;催化电流与过氧化氢的浓度在 5 0 100!mol/L范围内呈线性关系;检出限为 2 0!mol/L(S/N=3)。关键词肌红蛋白;二醋酸纤维素;离子液体;过氧化氢;电催化2011-01-30 收稿;2011-04-22 接受本文系西安建筑科技大学重大科技成果创新基金(No ZC1004)、陕西省教育厅专项科研计划项目(No 11JK0570)及陕西省自然科学基础研究基金青年人才项目(No 2009JQ2011)资助*E-mail:dongsyy126 com1引言研究蛋白质和酶的电催化过程，对于认识重要生命物质在生命体内的代谢过程具有重要意义1，2。目前，用于制备肌红蛋白(Mb)修饰电极的材料主要有透明质酸、介孔分子筛、碳纳米管、金属氧化物、黏土等 3 9。如何开发更为有效的固定蛋白质的途径，是当前酶电极研究的热点。纤维素作为一种环境友好型高分子材料，具有良好的可成膜性、生物相容性及生物降解性而被应用于蛋白质和酶的固定 10。二醋酸纤维素(Cellulose diacetate，CDA)是纤维素衍生物中最早进行商品化生产，并且不断发展的纤维素有机酯 11，但在蛋白质及酶的固定化方面的应用比较少见。因此，这方面的研究具有重要意义。CDA 导电性较差，限制其在电催化的应用，故用作蛋白质固定化时需加入电位窗口宽、导电效率高和溶解能力好的离子液体12，13。本研究以 CDA-bmim BF4(1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸盐离子液体)复合膜将肌红蛋白(Mb)固定于玻碳电极(GCE)表面，采用紫外-可见吸收光谱、傅里叶变换红外光谱、扫描电子显微镜及电化学交流阻抗法对包埋于膜内的 Mb 进行了表征，利用 i-t 曲线法研究了修饰电极对 H2O2的电催化性能，为氧化还原蛋白的固定化以及电化学传感器的构建提供了一种新的生物兼容性材料。2实验部分2 1仪器与试剂CHI832 电化学工作站(上海辰华仪器公司);三电极体系，工作电极为修饰玻碳电极(=3 mm)，参比电极为饱和甘汞电极，辅助电极为铂丝电极;SB4200DTD 超声波清洗机(宁波新芝公司);NicoletEvolution 300 紫外-可见分光光度计(英国);JEOL JSM-5800 扫描电镜(SEM)，加速电压为 15 kV。肌红蛋白(Mb，wolsen)，实验中用 pH=7 0 的磷酸盐缓冲溶液(PBS)配成 5 0 g/L 的 Mb 溶液;二醋酸纤维素(CDA，陕西师范大学化学与材料科学学院提供);30%H2O2(西安化学试剂厂);缓冲溶液为 pH=7 0 的 PBS 溶液，实验用水为二次蒸馏水，其它试剂均为分析纯。电化学测定前均先通高纯氮气除去研究溶液中的溶解氧，并维持在氮气气氛下测定。2 2 bmim BF4的合成将 0 3 mol N-甲基咪唑和 0 33 mol 溴代正丁烷加入250 mL 圆底烧瓶中，于70 搅拌反应3 h，得到 bmim Br。将上述产物溶于 100 mL 丙酮中，加入 0 3 mol NaBF4，室温搅拌反应 5 h;反应结束后，第 39 卷2011 年 9 月分析化学(FENXI HUAXUE)研究报告Chinese Journal of Analytical Chemistry第 9 期1358 1362将产物抽滤，去除 NaBr 固体;滤液旋转蒸发去除丙酮，冷却至室温，析出白色 NaBr 晶体，上层为黄色液体;抽滤，加入 CH2Cl2使得 NaBr 固体充分析出;在 70 下真空干燥 24 h，得到离子液体 bmimBF4。产物经 FTIR 和1HNMR 分析确认，纯度通过 HPLC 分析14。2 3CDA-bmim BF4-Mb/GCE 修饰电极的制备玻碳电极先用005!m 的 Al2O3抛光成镜面，再依次用 HNO3(1 1，V/V)、无水乙醇及水分别超声清洗5 min。准确称量 7 0 mg CDA 溶解于1 00 mL 丙酮中，得7 0 g/LCDA 溶液;向其中加入0 02 mL bmimBF4离子液体，充分摇匀即得 bmim BF4-CDA 混合液。用微量进样器依次取 2!L Mb 溶液(5 0 g/L)及 1!L bmim BF4-CDA 混合液，滴加到清洗好的玻碳电极表面，在 4下晾干 5 h，得到的电极记为CDA-bmim BF4-Mb/GCE。电极不用时，浸没于 PBS 溶液(pH=7 0)中，于 4 冰箱中保存。2 4实验方法采用三电极系统:酶修饰电极为工作电极、铂丝为对电极、饱和甘汞电极为参比电极。选取 PBS(0 01 mol/L，pH=7 0)为工作底液，扫速为 150 mV/s，室温(25)条件下进行 CV 测试，记录 CDA-bmim BF4-Mb/GCE 对 H2O2的安培响应。3结果与讨论3 1CDA-bmim BF4-Mb 的光谱研究血红素类蛋白质在 408 nm 左右的 Soret 吸收带(图 1)可作为判断其变性的重要标志15。为了考察 CDA-bmim BF4的生物兼容性，分别测定了 Mb 和 CDA-bmim BF4-Mb 混合物的紫外-可见吸收光谱。从图 1 可见，天然 Mb 的最大吸收峰位于 409 nm(曲线 a)，CDA-bmim BF4-Mb 混合物的最大吸收位于 412 nm(曲线 b)，吸收峰的位置略有红移;同时，吸光度有所降低，说明 Mb 与 CDA-bmim BF4发生了作用。Lei 等 16，17 认为这是由 CDA-bmim BF4复合物的表面势能及其吸光性质决定的，但这并不会影响 Mb 血红素周围肽链的结构及其状态。因此，在 CDA-bmim BF4溶液中，Mb 仍然保持了相应的生物活性。蛋白质的酰胺和酰胺基团的红外吸收带能够提供多肽链二级结构的信息18，19。在 Mb 的FT-IR 光谱中(图 2a)，出现在1632 和1589 cm1处的吸收峰分别为 Mb 中酰胺 和酰胺 的吸收峰。酰胺 是由于肌红蛋白肽链骨架中的肽段连接处 C=O 的伸缩振动引起的;酰胺 来源于 N H 弯曲和 C N 伸缩振动。当 Mb 固定于 CDA-bmim BF4膜内时，可观察到与天然 Mb 峰形相似的酰胺 和酰胺吸收峰(图2b)。但酰胺 吸收峰位移到 1603 cm1处，可能是由于修饰膜 CDA-bmim BF4的吸收峰(图 2c)与Mb 的吸收峰有一定重叠引起的。这也表明 Mb 在 CDA-bmim BF4膜内基本保持了其天然构象。3 2CDA-bmim BF4-Mb/GCE 的表征通过扫描电镜研究了 CDA 和 CDA-bmim BF4-Mb 在玻碳电极表面的表观形貌。由图 3 可见，二者表观形貌差异很大。CDA 呈现一致、有序、疏松的状态，当加入 bmim BF4离子液体及 Mb 后，电极表面形成一层致密、平滑的膜，并呈现蛋白质颗粒嵌入的形态，表明 Mb 已成功地结合到 CDA-bmim BF4膜中。K3Fe(CN)6作为考察电极性能的常用探针，被用于研究不同修饰电极的电化学性能。由图 4 可知，在 0 5 mmol/L K3Fe(CN)6-0 1 mol/L KCl 溶液中，裸玻碳电极(曲线 a)上出现了一对峰形较好的氧化还原峰;电极仅修饰 CDA 时(曲线 b)，氧化峰及还原峰电流均明显降低，表明 CDA 膜阻碍了K3Fe(CN)6的电子转移;当将 CDA 及 bmim BF4的混合溶液修饰到电极上时(曲线 c)，相对于仅修饰 CDA 的电极(曲线 b)，电流又明显升高。这可能因为离子液体具有良好的导电率，并且咪唑类离子液体的结构与溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)、溴化十二烷基三甲基铵等可溶性单链阳离子表面活性剂相似，基于这些物质形成的单分子层构建了一个电子通道，从而促进了 K3Fe(CN)6和基底电极之间的电荷转移 20;而在 CDA-bmim BF4-Mb 修饰玻碳电极上(曲线 d)，K3Fe(CN)6氧化还原峰电流再次降9531第 9 期董社英等:二醋酸纤维素-离子液体膜固定肌红蛋白制备过氧化氢传感器图 1Mb 在不同溶液中的紫外-可见吸收光谱Fig 1UV-Vis spectra of(a)myoglobin(Mb)，(b)cel-lulose diacetate(CDA)-1-butyl-3-methylimidazolium tet-rafluoro-borate(bmim BF4)-Mb，(c)CDA andd)bmim BF4in 0 1 mol/L pH 7 0 PBS图 2天 然 Mb(a)，CDA-bmimBF4-Mb(b)和CDA-bmim BF4(c)的傅里叶变换红外光谱图Fig 2FT-IR spectra of natural Mb(a)，CDA-bmimBF4-Mb(b)and CDA-bmim BF4(c)图 3(a)CDA 和(b)CDA-bmimBF4-Mb 在玻碳电极表面的扫描电子显微镜图Fig 3SEM images of(a)CDA and(b)CDA-bmimBF4-Mb on a GCE surface图 4不同电极在 K3Fe(CN)6溶液中的循环伏安图Fig 4Cyclic voltammograms of(a)GCE，(b)CDA/GCE，(c)CDA-bmimBF4/GCE and(d)CDA-bmim BF4-Mb/GCESolution:05 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1 1，V/V)containing 01 mol/L KCl Scan rate:015 V/s低，表明 Mb 成功修饰到电极表面，从而阻止了 Fe(CN)63 向电极表面的扩散21。图 5 为不同修饰电极在 0 5 mmol/L K3Fe(CN)6-0 1 mol/L KCl 溶液中所获得的交流阻抗曲线。与裸 GCE(曲线 a)相比，其表面滴涂 CDA(曲线 b)后阻抗增加，表明 CDA 在电极表面所成的膜阻碍了电子转移;加入导电性良好的 bmim BF4(曲线 c)使 CDA/GCE 表面阻抗降低。当 Mb 固定在CDA-bmim BF4/GCE 表面上(曲线 d)，阻抗又明显增大，说明 Mb 成功地固定在 CDA-bmim BF4膜中。3 3CDA-bmim BF4-Mb/GCE 的电催化作用图 6 为 CDA-bmim BF4-Mb/GCE 对连续加入的 5 0!mol/L H2O2的安培响应，修饰电极对 H2O2呈现较快的响应。插图的工作曲线表明，H2O2浓度在 5 0 100!mol/L 范围时，修饰电极催化响应电流与 H2O2浓度呈良好的线性关系，I(!A)=0 03857CH2O2(!mol/L)+0 4181(r=0 9988);检出限为2 0!mol/L(S/N=3)。表观米氏常数 Km是酶促反应的特征动力学参数，是表征酶与底物之间亲合力大小的标准。电化学方法测定 Km的 Lineweaver-Burk 方程如下式22:1/Iss=1/Imax+Km/ImaxC式中，Iss为一定底物(H2O2)浓度下修饰电极的稳态响应电流;Imax为底物饱和条件下测得的稳态电流最大值;C 为底物浓度。在一定范围内，用图 6 插图工作曲线中的数据作 1/Iss-1/C 图，拟合得到线性0631分 析 化 学第 39 卷书书书方程 1/Iss=0 08967+15 76/C(H2O2)(r=0 9986)，由其斜率和截距求得 Km=1 758 104mol/L。Km越小，表明酶与底物的亲合力越大，酶的活性受抑制的程度越小。与 Mb-HMS/GCE(Km=5 2mmol/L)23 相比，较小的 Km说明 CDA-bmim BF4-Mb/GCE 对 H2O2有较高的催化能力。图 5不同修饰电极的交流阻抗曲线Fig 5Electrochemical impedence spectra recorded at(a)bare，(b)CDA，(c)CDA-bmimBF4and(d)CDA-bmim BF4-Mb modified GCESolution:0 5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6(1 1，V/V)containing 0 1 mol/L KCl Applied potential:02 V(vs SCE)Frequency range:0 01 104Hz图 6CDA-bmim BF4-Mb/GCE 在 0 5 V 处对 H2O2的安培响应Fig6Amperometric responses of CDA-bmim BF4-Mb/GCE at 0 5 V upon successive additions of 10!L5 mmol/L H2O2to 10 mL pH 7 0 bufferInset:The linear relationship of current and concentration ofH2O23 4CDA-bmim BF4-Mb/GCE 的重现性和稳定性采用 CDA-bmimBF4-Mb/GCE 修饰电极对 10!mol/L H2O2平行测 8 次，所得相对标准偏差为6 3%。采用6 支同一批次制备的电极对10!mol/L H2O2平行测6 次，所得相对标准偏差为5 7%。稳定性是衡量电极实用性的重要指标。考察了 CDA-bmim BF4-Mb/GCE 氧化还原峰电流与其保存时间的关系。结果表明，随着保存时间的增加，峰电流缓慢减弱，保存 7 d 后，峰电流仅减少了 5%。说明Mb 在二醋酸纤维素-离子液体修饰玻碳电极上的直接电子转移比较稳定，这可能是二醋酸纤维素与玻碳电极间较好的亲合力作用的结果。References1Brunori Maurizio Biophys Chem，2000，86(2-3):221 2302Cao W X，Christian J F，Champion P M，Rosca F，Sage J T Biochem，2001，40(19):5728 57373Shangguan X D，Zheng J B Electroanalysis，2009，21(7):881 8864Liu X J，Xiao H，Shang L B，Wang X Y，Li G X Anal Lett，2005，38(3):453 4625Dai Z H，Xu X X，Ju H X Anal Biochem，2004，332(1):23 316LV Ya-Fen，YIN Ya-Jing，WU Ping(吕亚芬，印亚静，吴 萍)Acta Phys Chim Sin，(物理化学学报)，2007，23(1):5 117Dai Z，Xiao Y，Yu X Z，Mai Z B，Zhao X J，Zou X Y Biosens Bioelectron，2009，24(6):1629 16348ZONG Shui-Zhen，CUI Rong-Jing，FEI Lei，LI Wei-Wei，JU Huang-Xian(宗水珍，崔荣静，费 雷，李巍巍，鞠晄先)Chinese J Anal Chem(分析化学)，2010，38(11):1533 15379Wu Y H，Shen Q C，Hu S S Anal Chim Acta，2006，558(1-2):179 18610Zheng W，Li Q，Su L，Yan Y，Zhang J，Mao L Q Electroanalysis，2006，18(6):587 59411Buchanan C M，Gardner R M，Komarek R J J Appl Polym Sci，1993，47(10):1709 171912Sun W，Wang D，Gao R，Sun 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Liquid Film Immobilizing MyoglobinDONG She-Ying*1，GU Guang-Zhe1，YU Zhu-Qing1，ZHOU Yuan-Zhen1，TANG Hong-Sheng2，ZHENG Jian-Bin21(College of Sciences，Xian University of Architecture and Technology，Xian 710055)2(Institute of Analytical Science，Shaanxi Provincial Key Laboratory of Electroanalytical Chemistry，Northwest University，Xian 710069)AbstractThe myoglobin(Mb)was immobilized on the surface of glassy carbon electrode(GCE)by usingcomposite of cellulose diacetate(CDA)and ionic liquid 1-butyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate(bmim BF4)Spectroscopic analysis of the CDA-bmim BF4-Mb film showed that the Mb could retain itsnatural structure and bioactivity The conductivity of the modified electrode had been greatly improved due tothe doping of ionic liquid，which facilitated the electronic transfer of the CDA-bmim BF4-Mb membraneFurther experiment demonstrated that the Mb modified electrode exhibited an electrocatalytic activity for the re-duction of H2O2 The catalytic peak current was linear to H2O2concentration in the range of 5 0 100!mol/L with a detection limit of 2 0!mol/L The apparent Michaelis-Menten constant(Km)was estimated to be 1758 104mol/LKeywordsMyoglobin;Cellulose diacetate;Ionic liquid;Hydrogen peroxide;Electrocatalysis(Received 30 January 2011;accepted 22 April 2011櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫櫫)色谱在材料分析中的应用该书为 色谱技术丛书 之一，系统介绍了材料分析中应用的各种色谱方法与技术，内容包括气相色谱、高效液相色谱、离子色谱、凝胶渗透色谱、毛细管电泳以及一些联用技术在无机材料中的金属元素和非金属元素的分析、无机材料和高分子材料结构分析、聚合物中可挥发物质的分析、高分子材料定性定量分析以及高分子材料分子量分布分析中的应用，并综述了色谱法在材料分析中的应用进展。书中列举了大量的应用实例，便于读者在实际工作中参考。该书可供材料、冶金、高分子科学与工程、环境保护等领域中从事材料分析的技术人员参考。该书(ISBN 978-7-122-10567-7)由化学工业出版社，胡净宇、梅一飞、刘杰民 等编著，定价 42 0。2631分 析 化 学第 39 卷