工程动物细胞培养制药工艺过程.pptx

Click to edit Master title style,Click to edit Master text styles,Second level,Third level,Fourth level,Fifth level,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,*,基因工程动物细胞培养制药工艺,药用蛋白质合成复杂，要有准确折叠空间结构，要有糖基化，才能使药品发挥真正功效。细菌和酵母等产品要么是包涵体，要么难以糖基化功效修饰。动物细胞培养技术来生产有功效蛋白质，大规模动物细胞尤其是人源细胞培养在药品生产中位置会越来越主要。,人畜病毒疫苗:口蹄疫苗、狂犬病疫苗、牛白血病和脊髓灰质炎、乙肝疫苗。,干扰素、单克隆抗体、重组基因工程产品。,组织型血纤蛋白溶酶原激活剂、免疫珠蛋白G、M、尿激酶、人生长因子等。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第1页,第一节 动物细胞制药表示系统与特征,昆虫系统、哺乳动物细胞系统，最成功、主要表示活性外源蛋白有效系统，应用于药品蛋白质表示。,一、哺乳动物细胞表示系统与特征,1.动物细胞特征,细胞膜、细胞质,和细胞核,没有细胞壁。,亚细胞器，功效独特。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第2页,2.动物细胞代谢,动物细胞不一样代谢路径及其对应酶体系定位于特定亚细胞区域。经过胞内运输（囊泡包裹）实现区域之间物质、信息和能量流动，经过穿梭实现不一样代谢路径之间交换。,在动物细胞培养中，葡萄糖和谷氨酰胺提供能量并作为合成代谢前体，所以动物细胞培养含有一定灵活性。,葡萄糖受限可增加谷氨酰胺消耗得以赔偿，反之亦然。谷氨酰胺是动物细胞氮源，谷氨酰胺受限时，可增加其它氨基酸消耗得以赔偿。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第3页,糖代谢特点：,动物细胞吸收葡萄糖后，进行糖酵解，大部分葡萄糖分解为丙酮酸，深入被还原为乳酸，乳酸分泌到胞外并在培养液中积累。,丙酮酸还可转化为乙酰辅酶,A,，进入三羧酸循环，彻底氧化产生,CO,2,和水。小部分（,4,8,）葡萄糖进入戊糖磷酸路径，把葡萄糖转化为,4,、,5,、,7,碳糖和还原力,NADPH,，,5,碳糖用于核酸合成，其它中间产物进入脂肪酸代谢、核酸代谢和氨基酸代谢。,葡萄糖代谢旺盛，会产生大量乳酸，对细胞产生毒性。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第4页,氨基酸代谢特点：,吸收谷氨酰胺后，进入氨基酸代谢路径，经过脱氨、转氨等作用，合成其它必需和非必需氨基酸。,大多数谷氨酰胺在脱氨酶催化下，生成谷氨酸，并释放氨，对细胞产生毒性。小部分谷氨酰胺经过转氨生成其它嘌呤、嘧啶和氨基糖等合成代谢前体。,谷氨酸还原酶把谷氨酸转化为中间产物,-,酮戊二酸，进入三羧酸循环，为细胞提供能量。所以谷氨酰胺在细胞能量代谢中含有主要作用。谷氨酰胺与丙酮酸和草酰乙酸发生转氨作用，生成丙氨酸和天门冬氨酸，丙氨酸可进入培养液并积累。在快速生长动物细胞培养体系，转氨作用是主要代谢路径。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第5页,不一样培养条件，葡萄糖和谷氨酰胺代谢重合于丙酮酸。在正常细胞系中，丙酮酸羧化产生草酰乙酸，而草酰乙酸起源于谷氨酰胺。,在连续细胞系中，没有这种流动。能量是以,ATP,和,NADPH,形式提供，起源于葡萄糖和谷氨酰氨，但二种细胞系对各个代谢路径贡献和所起作用不一样。,常流加葡萄糖或谷氨酰氨，控制整个代谢过程，防止有毒废物积累。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第6页,3.蛋白质糖基化,蛋白质合成是以mRNA为模板，在核糖体上完成。而蛋白质糖基化无需模板指导，所以糖蛋白寡糖结构轻易发生改变。,糖蛋白单糖单元:-D-葡萄糖、-D-半乳糖、-D-甘露糖、-D-木糖、-D-岩藻糖、N-乙酰-D-葡萄糖胺、N-乙酰-D-半乳糖胺和-N-乙酰神经氨酸（或唾液酸）。,糖基化类型：寡糖基以共价键与蛋白质氮原子结合为N-糖基化，或与氧原子结合为O-糖基化。这两种糖基化位点和数量及糖种类都不一样。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第7页,N-糖基化：聚糖部分连接在天门冬酰胺氨基上，其模体保守序列为Asn-X-Thr/Ser(X为除脯氨酸以外任意氨基酸)。假如X为Trp、Asp、Glu和Leu，对糖基化有负影响，而第三位Thr能增强糖基化。,N-糖基化分为高甘露糖型、复合型和杂合型三种类型，共同关键是3个甘露糖和2个N-乙酰葡萄糖胺组成5糖（Man,3,GluNAc,2,），其它糖形成支链。,高甘露糖型支链为甘露聚糖（59聚体），无其它糖。,复合型含有2个以上支链，如乙酰半乳糖胺、果糖和唾液酸等。,杂合型最少含有一条复合糖链，另一个链含有甘露糖。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第8页,O-聚糖连接在Thr/Ser羟基上，还没有发觉保守序列。,O-聚糖有四种不一样关键结构，都含有N-乙酰半乳糖胺基，糖基化会影响蛋白质局部构象。,O-糖基化比较小，普通为16个寡聚糖，但比N-糖基化改变更大。,O-糖基化只在高尔基体上进行，糖基单元有木糖、葡萄糖。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第9页,糖基化磷脂酰肌醇锚着点：它在膜与蛋白质之间形成稳定相互作用，都含有相同关键结构：胆胺-PO,4,-Man,2,-GlcHN,2,-肌醇-PO,4,-脂。,胆胺形成膜内蛋白桥，而肌醇在膜内。,在细胞培养生产重组蛋白时，磷脂酶C可切割这类蛋白，有利于纯化。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第10页,细胞特异性糖基化路径淋巴细胞中进行，它不依赖于内质网和高尔基体。,IgG糖基化，等分GlcNAc残基连接在关键甘露糖上，该糖基化在抗体依赖性细胞介导细胞毒性中起主要作用。,IgG蛋白铰链区，富含Ser、Thr和Pro，5个Ser全部糖基化。,促黄体激素、促甲状腺素等硫酸化只能在垂体中发生。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第11页,尽管哺乳动物细胞含有细胞内糖基化装置，但不一样细胞系，糖基化特征不一样。,鼠和猪细胞倾向于添加乙酰果糖而不是乙酰唾液酸，在鼠杂交瘤或人鼠杂交瘤生产抗体中，乙酰果糖占优势。,CHO,细胞不能合成等分,N-,乙酰葡萄糖胺，而鼠细胞系却能形成半乳糖末端，对人有免疫原性。,要依据糖基化结构，选择适宜细胞系。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第12页,细胞系,Fuc,Gal,唾液酸,1,6,1,3 Fuc,1,3Gal,SO,4,-GalNAc,2,3,2,6,糖基化,等分GluNAc,BHK,+,0,+,0,+,0,-,0,CHO,+,-,0,0,+,0,+,0,鼠杂交瘤,+,0,+,0,+,0,+,0,C127,+,0,+,+,+,+,+,0,J558L,+,0,+,-,+,+,+,0,人淋巴细胞,+,0,0,0,+,+,0,+,人垂体,+,0,0,+,+,+,0,+,Namalwa,+,0,0,0,+,+,-,-,人鼠杂交瘤,+,0,0,0,+,+,+,0,工程动物细胞培养制药工艺过程,第13页,2.哺乳动物细胞表示系统,基因工程哺乳动物细胞系：失去分化能力无限生长细胞系，即永久性细胞。表示蛋白质能正确加工、修饰并折叠形成含有生物活性功效分子，靠近或类似天然产物。,糖基化等修饰是糖蛋白行使功效所必需，而且对产品质量有影响，如生物活性、稳定性、免疫原性等。原核细胞表示EPO无糖基化，在体内表现无活性。原核表示GMCSF虽有活性，但在体内产生抗体。,动物细胞表示产物分泌到培养液，轻易分离纯化。约有70同意蛋白质药品由哺乳动物细胞系统表示制造，而且数目还在不停增加。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第14页,表示系统,O-糖基化,寡聚甘露糖,高甘露糖,复合体,大肠杆菌,0,0,0,0,酿酒酵母,0,昆虫Sf9,0,仓鼠CHO,0,仓鼠BHK,0,鼠杂交瘤,0,鼠骨髓瘤,0,C127,0,J558L,0,人淋巴细胞,0,0,Namalwa,0,人鼠杂交瘤,0,工程动物细胞培养制药工艺过程,第15页,大肠杆菌,酵母,哺乳动物细胞,产物浓度,高,高,低,分子量,低,高,高,二硫键,有限,不受限制,不受限制,分泌,无,有或无,有,形式,包涵体,单链，天然,单链，天然,折叠,不正确,正确,正确,糖基化,无,可能,完全,逆转录病毒,无,无,可能,热原,可能,无,无,培养特点,轻易,轻易,较难，成本高,分离纯化,复杂,复杂,简单,工程动物细胞培养制药工艺过程,第16页,细胞类型,表示水平（g/ml）,猴CV1,110,猴CV1,0.05,猴COS,1,小鼠成纤维细胞C127,15,小鼠成纤维细胞3T3,0.10.5,CHO（dhfr,）,0.010.05,CHO（dhfr,）,10,工程动物细胞培养制药工艺过程,第17页,动物细胞表示系统不足是细胞生长迟缓，生产效率较低，产量远远落后于其它表示系统。,骨髓细胞MPG11生产IgG能力为5pg/(细胞.分钟)，10L反应器，密度为107/ml，生产能力不到1g/d。,连续细胞系增加了生长和代谢速率，但同时造成了副产物增加。,动物细胞对培养条件要求苛刻和敏感，对温度、pH、渗透压、剪切力等忍受能力差。培养基要求高，需要添加氨基酸、维生素等，往往需要附加血清，提供生长因子，费用较高。同时可能有潜在致病因子、免疫原性存在。,表示载体改进和宿主细胞改造是动物细胞表示系统研发主要内容。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第18页,3.昆虫细胞表示系统与特征,表示载体为昆虫病毒，转染昆虫细胞，表示出目标蛋白质。昆虫病毒主要有杆状病毒科核多角体病毒。,苜蓿尺蠖核多角体病毒秋黏虫细胞表示系统，家蚕核多角体病毒家蚕幼虫表示系统。,MicroGene Sys企业表示艾滋病基因工程疫苗，随即猪生长素、CD4膜蛋白及疟疾疫苗、鸡新城病毒疫苗、血吸虫GST疫苗、乙肝表面抗原、重组人GMCSF等。日本同意用家蚕系统生产干扰素已上市。生物试剂盒标准品大多用昆虫表示系统生产。,最少有600各种昆虫能够作为宿主，每年有数百个基因利用昆虫系统进行表示，越来越成为非常有用表示宿主。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第19页,优点,1）安全：杆状病毒无致病性，产品安全性受FDA认可。,2）易喂养：家蚕丧失了野外生存能力，喂养，发育快，,3）高量表示：用强开启子，外源基因可超量表示。表示产物在昆虫细胞内能结晶，对产物纯化非常有意义。,4）高效表示：可容纳较大外源基因（12kb），表示数个外源基因，而且正确装配成有功效分子。如表示抗体重链和轻链，自主装配成有功效抗体。,5）翻译后加工：昆虫细胞能进行一系列翻译后加工，包含糖基化、脂肪酸酰基化、磷酸化、氨基酸乙酰化、氨酰化等，大部分产物显示出良好活性。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第20页,缺点：,1,）重组率低，筛选困难，周期长，需要,4,10,天。,2,）外源基因表示在转染晚期，大约在,20h,后起始基因表示，在,72,94h,细胞裂解死亡，基因表示时间约,30,50h,，高水平表示不连续且时间短，这对表示不利。,3,）昆虫细胞糖基化等加工路径与哺乳动物细胞不完全相同，它不提供复杂,N,糖基化，如添加半乳糖和唾液酸残基，有可能造成溶解性、稳定性、免疫性等改变。表示水平非常高，加工装备跟不上，蛋白质修饰效率可能不高。,研究开发主要方向：有效病毒表示载体；,决定基因表示时期开启子，无血清培养昆虫细胞系。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第21页,第二节 基因工程动物细胞系构建,构建高效表示载体,转染动物细胞,筛选判定,取得生产用工程化细胞系,工程动物细胞培养制药工艺过程,第22页,动物细胞表示载体：病毒载体，质粒载体。,病毒载体：,逆转录病毒、腺病毒、痘苗病毒、杆状病毒等载体，对原始病毒改造而来。,同源重组构建腺病毒载体，在静止期转染细胞，表示时间较长。,痘病毒载体可插入,25,40 kb,外源基因，甚至是多个基因。无感染性和致癌性，可用于构建基因工程疫苗。,美国,Genentech,企业已用,SV40,载体生产乙肝疫苗，其它载体可用于基因治疗。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第23页,质粒载体：,微生物质粒载体类似，普通是穿梭质粒，含有两个复制子和抗性筛选标识基因。,大肠杆菌复制子，细菌中繁殖。,抗生素抗性标识，原核细胞筛选。,动物细胞复制子，,在宿主细胞中稳定表示。,还有丝状噬菌体复制子。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第24页,开启子序列：含有RNA聚合酶识别和结合位点，方便有效转录。TATA盒，确定起始位置；GG盒，影响转录频率。,起源于病毒、动物基因和噬菌体开启子。,动物病毒开启子：逆转录病毒长末端重复序列（LTRS）、SV40病毒早期和晚期开启子、腺病毒晚期开启子、人巨噬病毒（CMV）马上早期基因开启子。,动物基因开启子：转录因子EF-1开启子、泛素蛋白开启子、-肌动蛋白开启子、干扰素-开启子、IgG开启子、鼠金属硫蛋白基因开启子等。,噬菌体T7开启子比动物基因开启子表示水平高。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第25页,PolyA信号序列：保持mRNA稳定性，预防降解，确保了转录产物加工和正确性，但序列不宜太长，防止能量过分消耗。添加PolyA信号和5端转录暂停位点，能够降低上游序列转录通读造成背景。,牛生长素（BGH）基因PolyA信号比SV40 PolyA更强，惯用于高效表示载体中。,终止序列：AAUAAA或连续终止密码UGA、UAA和UAG，能预防转录通读，使转录在正确位点结束。,在转录起始点上游或下游使用相同类型增强子，有利于提升外源基因转录水平。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第26页,双顺反子表示载体：,两个基因在同一开启子控制之下，内部核糖体进入位点使同一,mRNA,中第二个基因得到翻译。将,dhfr,与目标基因串连，,dhfr,cDNA,插入内含子中，其转录产物被剪切，翻译不出蛋白质，而目标基因转录产物得到翻译。,顺反子在多亚基蛋白偶联表示及其控制策略等方面有广泛应用前景。,使筛选轻易，而且能高效表示。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第27页,选择适宜开启子，可实现定向表示。,CMV开启子和人EF-1开启子，可实现同一载体上二个基因独立表示。,组织特异性开启子：如鼠、山羊酪蛋白开启子，可使基因主要在乳腺中表示。,N端设计分泌信号肽：如Ig 链可变区和恒定区之间序列，使外源基因表示产物向胞外分泌。,C端设计跨膜锚定序列：可使外源蛋白展示在细胞表面。,亚细胞定位信号肽：目标基因产物将转运到细胞核、线粒体、内质网或细胞质中，这对基因功效研究非常适当。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第28页,基因扩增系统：,在逐步提升选择压情况下，使选择标识基因拷贝数增加，并可连带其两侧序列一起扩增，从而提升表示基因水平。,最惯用二氢叶酸二氢叶酸还原酶（,DHFR,）基因系统和谷氨酰氨合成酶（,GS,）基因系统。,氨甲喋呤基因与目标基因重组，氨甲喋呤使,dhfr,基因与目标基因大量增加，到达数千拷贝。,硫胺蛋氨酸使,GS,系统基因得到大量扩增。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第29页,二、受体细胞,1人源细胞株系,Namalwa：类淋巴母细胞，非整体核型。表示IgM，悬浮生长。外源基因表示水平较高，可用无血清培养基高密度培养，已成功地表示了rhEPO、rhG-CSF、tPA等。英国Wellcome企业用Namalwa细胞反应器达8000L，用Sendai病毒诱导，大规模生产干扰素，并同意上市。,WI-38：二倍体成纤维细胞系，2n=46，第一个被用于制备疫苗。贴壁生长，对很多病毒敏感，广泛用于疫苗生产。,MRC-5：二倍体成纤维细胞系，但生长较WI-38快，对逆境有一定抗性也用于制备疫苗。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第30页,2哺乳动物细胞株系,CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离上皮样细胞系，贴壁型生长，是当前使用最为普遍和成熟表示糖基化蛋白药品宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表示外源蛋白，而内源蛋白分泌极少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高忍受能力。蛋白质翻译后修饰准确，表示产物结构、性质和生物活性靠近天然。,有各种衍生突变株应用于药品生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶酸还原酶缺点株表示药品有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子、DNA酶，已上市。,使用氨甲酰喋呤，增加外源基因拷贝数，提升蛋白质表示水平。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第31页,BHK21：幼仓鼠肾脏中分离成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表示重组凝血因子已被获准上市。,C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离取得上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表示各种外源基因，其中EPO水平达10 mg/L，生产rhGH已被同意上市。,3T3,：,HIN Swiss,小鼠胚胎培养物中分离建立连续细胞系，能大量表示外源蛋白，广泛用于药品毒理学研究。,骨髓瘤细胞：,J558L,是小鼠,BALB/c,骨髓瘤细胞，分泌,IgA,，用于转染研究。,NSO,和,SP2/O,Ag14,不分泌,Ig,，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第32页,杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合细胞中分离取得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，轻易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表示。很多杂交瘤细胞系用于抗体制备。,Vero：从成年非洲绿猴肾中分离取得贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已经有突变细胞系能用无血清培养。最为惯用Vero E6增殖各种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被同意用于人体。也可作为转染宿主细胞，用于表示外源基因蛋白质药品和病毒检测。,COS,：是从,SV40 DNA,转化非洲绿猴肾细胞,CV1,中分离得到，广泛用于外源基因瞬时表示研究。,GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗研究。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第33页,3昆虫细胞株系,Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，轻易放大，高效表示外源基因。,Sf9：从秋粘虫卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最惯用昆虫表示细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表示外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基搅拌反应器中生长。,TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表示重组蛋白能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第34页,三、细胞转染,转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞技术通用名称。基因导入真核细胞方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导转化。,方法,表示类型,毒性,细胞类型,特点,基因枪,瞬时，稳定,无,各种细胞组织，器官,有效，仪器操作,显微注射,瞬时，稳定,无,各种细胞,有效，技术难度大,电穿孔,瞬时，稳定,无,各种细胞,有效，仪器操作,冲击波,瞬时，稳定,无,各种细胞，局部组织,简单有效，仪器操作,工程动物细胞培养制药工艺过程,第35页,方法,表示类型,毒性,细胞类型,特点,逆转录病毒,瞬时，稳定,无,对应宿主细胞,有效,原生质体融合,瞬时，稳定,无,悬浮细胞,技术复杂,生物转染特点,工程动物细胞培养制药工艺过程,第36页,化学转染是最惯用转染方法。,其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（,DEAE,）葡聚糖（,dextran,）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，经过细胞内吞作用进入细胞。,磷酸钙与,DNA,形成不溶性沉淀，带正电荷,DEAE,葡聚糖与带负电荷,DNA,磷酸基团结合，阳离子树脂包裹,DNA,形成脂质体。,渗透性休克和,DMSO,等化学试剂能促进,DNA,进入细胞。转染试剂盒商业化供给，尤其是脂质体材料转染试剂。,影响原因：细胞培养物密度、,DNA,大小、纯度与用量、化学试剂用量与处理时间、促进剂使用等。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第37页,方法,表示类型,毒性,细胞类型,特点,磷酸钙,瞬时、稳定,无,贴壁细胞，悬浮细胞,简单,DEAE-葡聚糖,瞬时,有,CV1，COS,简单,阳离子树脂,瞬时、稳定,有或无,贴壁、原代悬浮细胞,简单，有效,化学转染特点,工程动物细胞培养制药工艺过程,第38页,四、转染体筛选与分离,转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因瞬时表示。,为了取得稳定整合细胞系，先在非选择性培养基上培养2448小时，让细胞倍增12代，使转染DNA表示。再按1：15百分比转移到选择性培养基上，每24天更换培养基，连续23周，促进抗性细胞生长，去除死细胞残骸，最终得到独立克隆。,在转染中大约有万分之一细胞将稳定整合外源基因，所以需要显性选择标识来分离转染细胞。,哺乳动物细胞选择标识，使用与之相对应选择剂。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第39页,选择剂,基因,使用浓度,氨甲喋呤,dhfr,0.01300 mol/L,氨喋呤,tk,0.4 mol/L,5-溴脱氧尿苷,tk,30 g/ml,G418,Zeocin,neo,100800 g/ml,潮霉素B,hyg,10400 g/ml,杀瘟稻菌素,bsd,210 g/ml,霉酚酸,gpt,25 g/ml,嘌呤霉素,乙酰基转移酶,0.510 g/ml,Xyl-A,ada,4 mol/L,工程动物细胞培养制药工艺过程,第40页,汇报基因,特点,使用与分析方法,cat,内源活性低，蛋白稳定，线性范围窄，,体外，荧光或免疫分析,lacZ,有内源活性，X-gal染色，线性范围宽,体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析,碱性磷酸酶,分泌型，线性范围宽，受到细胞类型限制,体外，比色、化学发光或荧光分析,gus,蛋白质稳定，线性范围宽，X-Gluc染色,体内外，染色，比色、化学发光或荧光分析,gfp,无内源活性，分子量小，稳定，无需底物，紫外线激发,体内外，荧光分析,工程动物细胞培养制药工艺过程,第41页,第三节 动物细胞培养需求与培养基制备,动物细胞离体后，失去了消化等系统，不能利用多糖、蛋白质等聚合程度高化合物。,只能利用简单单体化合物如单糖、氨基酸等，为了维持细胞正常生长，还必须添加维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成份等。,动物细胞对培养环境要求高，不一样细胞系要求也不尽相同，培养基要尽可能与体内生活条件靠近。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第42页,一、动物细胞培养营养需求,1.糖类,糖类是细胞主要营养物质，分解后释放出能量ATP。,培养基中都必须添加葡萄糖，有时添加核糖等。,提升细胞生长碳源和能源，主要是葡萄糖和谷氨酰胺。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第43页,2.氨基酸,氨基酸是蛋白质和酶组成单位。氨基酸还参加合成一些含氮化合物，核苷酸四种嘌呤和嘧啶碱基、儿茶酚胺等含氮激素及神经递质等。氨基酸可经过生糖或生酮路径转变为糖或脂肪酸，间接提供能量。,动物细胞：810种必须氨基酸。,离体轻易失去，20种氨基酸中最少12种是必需氨基酸：,精氨酸、半胱氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸等。,谷氨酰胺还可作为主要碳源和能源而被利用。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第44页,3.维生素,维生素是一类微量小分子有机生物活性物质，对代谢和生长起调整和控制作用。,水溶性维生素包含B族维生素和维生素C。B族维生素以辅酶或辅基形式参加酶反应，主要调整酶活性和代谢活性。维生素C，抗坏血酸，在体内参加还原反应、羟化反应，促进胶原蛋白合成和粘多糖合成，抗氧化作用。,脂溶性维生素包含维生素A、D、E、K四种。,维生素A维持正常视觉和上皮组织。维生素D为视固醇类化合物，主要是调整钙磷代谢。维生素E即生育酚，是抗氧化剂，预防生物膜中磷脂不饱和脂肪酸被氧化。维生素K，促进合成凝血酶原，促进血液凝固。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第45页,5.无机盐类,无机盐是细胞代谢所需酶辅基，同时保持细胞渗透压和缓冲pH改变。,Na,和Cl,参加生理电活动，维持水平衡、保持渗透压和酸碱平衡。离体培养为细胞提供足够Na和Cl离子是基本条件，普通生理盐水离子浓度（0.9%NaCl）。,Ca,2,、Mg,2,，对细胞间互黏稳定起主要作用。在离体培养时，螯合细胞间Ca,2,和Mg,2,，能够到达分散细胞目标。,磷是核酸、磷脂等组成成份。,碳酸盐缓冲液是主要体内缓冲体系，与K,、Cl,等在维持酸碱平衡含有主要作用。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第46页,6.生长类因子及激素,细胞之间是相互联络，而非孤立。尤其是高度分化功效动物细胞更是如此。,细胞离体生长时，必要添加激素与细胞生长因子等。胰岛素是最惯用激素，促进糖原和脂肪酸合成，对细胞生长有刺激作用。其它激素有促卵泡激素、甲状腺素、乳激素、生育酚等。,细胞因子有表皮生长因子、成纤维细胞生长因子和神经细胞生长因子，依据不一样细胞添加。,为了细胞贴壁生长，必需添加贴附因子，纤维结合蛋白、胶原等，伸展因子如表皮生长因子、成纤维细胞因子等。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第47页,二、动物细胞培养环境需求,1.水与渗透压,细胞生长离不开水，水是细胞反应主要介质。1）水是一个良好溶媒，营养物质在水中被吸收，废物在水中被排泄。2）含有热稳定性和导热性，调整稳定温度。,正常血浆渗透压主要是无机盐Na,、K,、Cl,、HCO,3,等组成，蛋白质组成胶体渗透压较小。,动物细胞对渗透压有较强耐受性，惯用增减NaCl浓度调整渗透压，每增加1mg/ml NaCl，渗透压增加32 mOsm/kg。,离体培养细胞渗透压应控制为等渗透溶液。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第48页,2.温度,不一样种类动物细胞对温度要求是不一样，变温动物对温度要求没有恒温动物严格。,哺乳动物细胞最正确培养温度为37,，鸡细胞为3940，而昆虫类细胞为2528。,在培养过程中，依据细胞种类选择确定适宜培养温度。,哺乳动物细胞耐受温度范围较窄，在,35-37,内能正常进行代谢和生长，超出范围会引发细胞伤害甚至死亡。,细胞对低温耐受性比高温要强，低温抑制生长，但无伤害作用，在冰点温度附近仍能存活。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第49页,3.氧气,动物细胞生长必须有氧气，无氧下，能取得能量供给，但细胞缺氧时不能生存。离体培养气体含有5CO,2,和95空气，其中氧浓度为21。有时充以N,2,气稀释O,2,浓度。O,2,浓度在60%以上为高氧环境，对细胞毒性较大。,4.pH值,动物细胞对pH值很敏感，低于6.8或超出7.6会产生严重影响。机体细胞pH范围为68，血液和体液中，改变范围很小。人血液pH维持7.36-7.44。pH低于7.05会发生酸中毒，高于7.45发生碱中毒。细胞代谢产生CO,2,，使培养液变酸，pH发生波动。合成培养基偏酸性，为了稳定pH，可用缓冲体系配制。在开放体系中，CO,2,逸出，使培养基变碱。通入5CO,2,，可维持在pH7.2-7.4范围内。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第50页,5.生长基质,改变生长表面特征，促进细胞贴附物质。,贴附细胞生长需要一个支持介质，采取在培养液中添加或在器皿表面覆盖生长基质，帮助细胞贴附和生长。,生长基质为胞外基质成份，多聚赖氨酸、纤维连接蛋白、胶原、层黏蛋白、韧黏素等。,生长基质已经有商业化产品，,用PBS或BBS配成10倍贮存液，在37,下包被，静置24小时或室温过夜，对器皿表面进行包被，然后无菌生理盐水洗涤后使用。有些还能够直接加入培养液。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第51页,生长基质,贮存液浓度,使用浓度,使用方法,多聚赖氨酸,0.5 mg/L,0.05 mg/L,表面包被,纤维连接蛋白,10 mg/ml,1 mg/ml,加入培养液,层粘蛋白,510 g/ml,表面包被,韧粘素,75 g/ml,515 g/ml,包被或加入培养液,胶原蛋白,13 mg/ml,0.1 mg/ml,表面包被,工程动物细胞培养制药工艺过程,第52页,6抗生素,动物细胞培养过程中，因为培养基营养丰富，很轻易被微生物污染。即使对使用抗生素仍存在质疑，但还是常添加抗生素，以防止轻度污染。,抗生素使用浓度差异很大，普通范围为50100 g/ml。在大规模生产中，除了青霉素和-内酰胺类抗生素外，其它抗生素能够使用。,抗生素使用对细胞会产生毒性，而且使试验室保留抗药性微生物，应加以注意和克服。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第53页,抗生素,作用对象,工作浓度（g/ml）,稳定性（天）,两性霉素B,真菌,12.5,3,制霉菌素,真菌,50,3,氨苄青霉素,G,、G,细菌,100,3,红霉素,G,细菌，支原体,100,3,四环素,G,、G,细菌，支原体,10,4,庆大霉素,G,、G,细菌，支原体,50,5,利福平,G,、G,细菌,50,3,卡那霉素,G,、G,细菌,100,5,链霉素,G,、G,细菌,100,3,氯霉素,G,细菌,5,5,青霉素G,G,细菌,100,3,工程动物细胞培养制药工艺过程,第54页,三、动物细胞培养基种类与组成,动物细胞对培养基要求高，不一样细胞系要求也不尽相同，所以培养基成份复杂而且昂贵。不过要尽可能提供与体内生活条件靠近培养环境。主要组成成份以下：,糖类、必需氨基酸、维生素、无机盐类、生长类因子及激素、结合蛋白质、贴附与伸展因子及其它附加成份等。,不一样细胞对葡萄糖利用相同，但对氨基酸利用相差很大，不一样细胞过程对氨基酸需求存在差异。当前停留在流加谷氨酰胺上,。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第55页,血清：蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素和生长因子等。胎牛血清、新生牛或成牛血清、马血清、鸡血清、羊血清及人血清，最广泛应用为胎牛血清和新生牛血清。水解乳蛋白和胶原富含氨基酸。血清和水解酪蛋白应用于许多细胞系和原代及传代细胞培养。,脂类化合物对动物细胞培养是必需，实际中类脂及其前体和血清常平行使用。添加蛋白质试剂主要有铁传递蛋白，起离子载体作用，有时用无机铁盐代替。胰岛素起生长素作用，白蛋白起保护剂作用。其它附加成份如核苷类及丙酮酸盐等是培养基必需成份，有利于细胞克隆和特异化细胞培养。,动物细胞培养过程中，被微生物污染。常添加抗生素，以防止轻度污染。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第56页,1.天然培养基,直接取自于动物组织提取液或体液作为培养基，如血浆凝块、血清、淋巴液、胚胎浸出液等。营养价值高，成份复杂，不稳定，起源受到限制，不宜大量培养和生产使用。,2.合成培养基,合成培养基用化学成份明确试剂配制培养基，组分稳定。现在已经有几十种合成培养基，大部分已商品化。,组成：无机盐、糖、氨基酸、维生素及其它成份。,因为细胞种类和培养条件不一样，所用合成培养基也不一样，在动物细胞培养中最惯用培养基有78种。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第57页,3.无血清培养基,无血清培养基是全部用已知成份组配、不加血清合成培养基。在含有营养和贴壁因子基础培养基中，加入适宜细胞生长因子，细胞良好生长，适合于制药生产。,无血清培养基提升了培养质量，防止了使用血清带来麻烦，产品纯化轻易，组分稳定，可大量配制。,无血清培养基通常需要添加激素与生长因子、结合蛋白、贴壁与伸展因子、低分子营养成份等。,大多数无血清培养基含有蛋白质和激素等大分子物质，适宜于各种细胞系培养。对于大规模生产用无血清培养基，往往成份不完全清楚，但简单而且低成本。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第58页,四、培养基控制,1.培养用水质,细胞培养水质最低要求电导率在1X10,6,cm以上。水存放时间不宜超出2周。对于制药，必需使用纯净水配制培养基，普通水必需除去各类元素有毒或有害物质及微生物，还必需除热源，到达纯净水标准。,2.缓冲液,缓冲液：弱酸与弱酸盐或弱碱与弱碱盐组成，pH恒定但不干扰试验。不一样种类细胞对pH 要求不一致，不一样生长阶段对pH要求也不一样。原代细胞pH要求严格，而传代细胞要求较宽。细胞培养过程中代谢产生酸性物质，使培养基pH不停下降。缓冲液中和培养液中酸性物质。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第59页,最广泛使用为碳酸氢钠/碳酸,其次为磷酸二氢钠/磷酸氢二钠，调整二者百分比，配制成不一样pH缓冲液。,碳酸盐缓冲液除了直接缓冲作用外，还有间接作用，碳酸生成挥发性CO,2,后很快逸出。细胞呼吸产生CO,2,与水形成碳酸，任何碱在培养液中都被中和，生产对应碳酸氢盐,其它缓冲液:Tricine-Glycine、MOPS、TES、HEPES、DIPSO、HEPPSO 等等有机缓冲液，缓冲能力强。Tris所含氨基含有高化学反应活性，能抑制细胞生长，并经过生物膜，它调整pH要依赖于温度改变，所以不宜作为培养液。离体培养中，缓冲液多为平衡盐溶液主要组分之一，极少单纯使用。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第60页,3.生理盐水与平衡盐溶液,在缓冲液基础上，添加调整渗透压盐类，在一定程度上能满足细胞对pH和盐离子要求。,缓冲液或缓冲盐溶液用于:配制溶液,处理细胞溶液。对于直接接触、长久培养培养液，惯用生理盐水和平衡盐溶液，是渗透压与胞浆渗透压平衡溶液。,生理盐水供给细胞水分和各种离子，维持一定渗透压，并能良好溶解试剂和药品。有各种不一样成份生理盐水，分别加入pH缓冲剂与指示剂、葡萄糖，形成平衡盐溶液。,平衡盐溶液：集缓冲液缓冲能力、生理盐水等渗能力、营养供给为一体，含有各种功效和作用。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第61页,BSS配制：,1）先分别溶解CaCl,2,、MgCl,2,、MgSO,4,。,2）在另一容器中依次溶解其它试剂。,3）在另一容器中用5.6%NaHCO,3,数滴溶解酚红。,4）将含Ca,2+,、Mg,2+,溶液迟缓倒入步骤2配制溶液中，搅拌，预防沉淀。,5）再加入酚红溶液。,6）补足水，并用NaHCO,3,调整pH。,含葡萄糖BSS过滤除菌，不含葡萄糖时常规高压灭菌。小量培养液可置4度保留。一旦出现沉淀，要重新配制。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第62页,注意事项：,细胞只利用L型氨基酸，不能利用D型，对于DL混合型氨基酸，使用量应该加倍。,谷氨酰胺溶液中很不稳定，要单独配制成浓缩液。,NaHCO,3,普通配成3.7、5.6%、7.4%三种浓度，过滤除菌或高压灭菌，4度保留，使用前加入，调整培养基pH。,为了优化细胞生长环境，还添加其它成份，如嘌呤和嘧啶类，维生素C、谷胱甘肽、巯基乙醇。,普通情况下，培养基成份如氨基酸、维生素、葡萄糖、缓冲液等、补充因子几类，先配制成高倍浓缩母液，过滤灭菌，冷藏。使用时按一定百分比稀释，配制成工作液。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第63页,第二节 动物细胞增殖生长动力学过程,一、单细胞生长增殖周期,从一个细胞分裂形成两个新细胞过程为一个细胞周期或一个细胞世代。单个细胞周期包含细胞间期、细胞分裂期，间期又包含间期1、DNA合成期和间期2三个时期。,不一样细胞类型其分裂周期及各期时间都不一样，培养条件及培养基成份也会影响细胞周期,普通地动物细胞分裂周期为,12,48,小时,经典细胞周期为,24,小时。,对连续细胞系，失去了细胞周期控制，人工培养条件不适，细胞将发生程序化死亡即凋亡。在培养过程中，缺乏生长因子或血清、营养受限和逆境等可引发凋亡发生。,工程动物细胞培养制药工艺过程,第64页,二、细胞群体生长过程,细胞群体生长增殖过程与微生物生长增殖过程相同,1.潜伏期，细胞经历一段悬浮状态，贴附于器皿表面。,2.对数生长久：细胞分裂旺盛，指数增加。细胞相互接触汇合成片，接触抑制，限制分裂和运动，密度不再增加。,3.静止期：分裂数与死亡数相等相对动态平衡时期。,4.衰亡期：细胞死亡数目大于分裂数目标时期。,三、群体细胞生长动力学参数,细胞分裂代数G就可用以下公式计算：,GlogNlogN0）/log2,工程动物细胞培养制药工艺过程,第65页,第四节 动物细胞分离与培养,一、细胞种类,生物体是由各种多样分化细胞组成，如人体细胞类型达200余种。,这些细胞都是由受精卵分裂产生细胞后代生长增殖分化而来。不一样细胞含有不一样功效，细胞分化异常造成癌变。分化程度越高，脱分化能力越差。,在胚胎发育过程