常用蛋白标签.pdf

2323表9 His-tag被认为是蛋白纯化的首选标签的五个因素原文检索：http:/http:/http:/ al.(2005)HaloTag Interchangeable Labeling Technology for cell imaging and protein capture.Cell Notes 11,2-6.Puck T T,et al.Genetics of somatic mammalian cells III.Long-term cultivation of euploid cells from human and animal subjects.J.Exp.Med.108:945-956,1958.PubMed:13598821CHO-K1细胞小词典小词典CHO-K1细胞是实验中十分常用的一个细胞株，在生物制药中的应用也非常广泛。该细胞株培养条件简单，贴壁强度适中，比较容易转染，很适合用它来研究一般哺乳动物基因的功能。来源：中国仓鼠（Cricetulus griseus）卵巢 形态：表皮细胞 生长特性：贴壁CHO-K1由CHO衍生而来，CHO是T.T.Puck 在1957年从一只成年中国仓鼠的卵巢中获得的。二、常用蛋白标签1.His-tag历久弥新的6组氨酸标签金属螯合亲合层析，又称固定化金属离子亲合层析（Immobilized metal ion affinity chromatography,IMAC），是近30年发展起来的一种新型分离技术。最早由Paroth等人提出1。该方法利用蛋白质表面的一些氨基酸，如组氨酸、色氨酸、半胱氨酸等能和金属离子发生特殊的相互作用的原理，从而对蛋白质加以分离。这些作用包括配价键结合、静电吸附、共价键结合，其中以配价键结合为主，而且这其中又以6组氨酸标签（His-Tag）应用最为广泛。以His-Tag纯化标签结合金属螯合亲合层析，为重组蛋白质的分离纯化提供了一个有力的工具。由于金属螯合亲合层析具有配体简单、吸附量大、分离条件温和、通用性强等特点，上样条件可选择范围广，在高盐、一定浓度的变性剂以及去垢剂的条件下，带6His纯化标签的蛋白质都可以和亲合填料特异性结合，逐渐成为分离纯化蛋白质等生物工程产品最有效的技术之一2。1.1 His-tag是蛋白纯化的首选标签Susanne Graslund等人3在对10,000多个不同蛋白的表达纯化进行总结，认为His-tag是蛋白纯化的首选标签，主要有五方面的因素（表9）。N-端的His-Tag与细菌的转录翻译机制兼容，有利于蛋白表达；采用固定化金属离子亲合层析纯化His-Tag融合蛋白操作简便；His-Tag对目的蛋白本身特性几乎没有影响，而不象GST标签那样容易形成二聚体，从而影响蛋白的特性；His-Tag非常小，不会改变目的蛋白自身的可溶性，相反一些大的标签如MBP，可大大提高融合蛋白的可溶性，尽管目的蛋白本身是不可溶或者折叠不正确；His-Tag非常小，在融合蛋白结晶后对蛋白结构没有影响。生命奥秘 24 生命奥秘 241.2 His-tag亲和层析填料His-tag可与多种金属离子发生特殊的相互作用，包括Ca2+、Mg2+、Ni2+、Co2+等，其中以镍离子使用最为广泛。镍琼脂糖凝胶FF的配基是最经典的IDA，镍离子有六个螯合价位，Ni-IDA螯合了三价，剩余三价，而Ni-NTA螯合了四价的，剩余是两价。因此，Ni-IDA琼脂糖凝胶作用力要比Ni-NTA琼脂糖凝胶的强。也正因为这个原因，IDA的载量要比NTA高，而在同样条件下Ni-IDA洗杂质和目标蛋白的要比Ni-NTA的咪唑浓度高。但是NTA的填料更稳定，能耐受更强的还原剂，更不容易脱落。图30 Ni2+结构图。图片来源：和固定化金属离子亲合层析（IMAC）是非常稳定的，但在有螯合剂的情况下其金属离子就会脱落，所以在纯化His-Tag融合蛋白时，不能有任何的螯合剂存在。Audur Magnusdottir等人认为，在E.coli的裂解液普遍存在一些非特异的弱螯合剂，如在三羧酸循环中产生了二羧酸类物质；E.coli在面临某些压力情况下，会产生高特异性的金属螯合剂Metallophores，这是由于这些螯合剂的存在导致His-Tag融合蛋白纯化的纯度和产量大大降低。这些螯合剂一般存在于细菌的细胞周质中，通过一个简单的步骤就可除去这些螯合剂，使得His-TagTM蛋白的纯度和产量得到提高4。产量增长倍数全部裂解液 低份子量成份 高份子量成份 渗透压休克图31 裂解液细胞周质低分子量成分降低了IMAC柱的结合能力。柱状图显示了在IMAC纯化前去除高分子量成分、低分子量成分或细胞周质材料与直接经由经典步骤溶解细胞的相对增益之间的比较。含有His标记的GFP的E.coli细胞与缺少重组蛋白的细胞混合，目的是激活被His标记的低丰度目的蛋白。所有样品都经由IMAC纯化，而被His标记的GFP的产量则通过测量洗脱部分的荧光值而获知。图片来源：Nature Methods 252521 Avi-tag简介2.2 与化学方法标记生物素相比，酶催化标记生物素的优势图32 Avi-Tag的结构。图片来源：参考文献Porath J,Carlsson J,Olsson I et al.(1975)Metal chelate affinity chromatography,a new approach to protein fractionation.1.Nature,258(5536):598-9.Chaga GS.(2001)Twenty-five years of immobilized metal ion affinity chromatography:past,present and future.2.J Biochem Biophys Methods,49(1-3):313-34.Structural Genomics Consortium,Architecture et Fonction des Macromolcules Biologiques,Berkeley Structural Genomics Center,et al.(2008)3.Protein Production and Purification,Nature Methods,5(2):135-146.Audur Magnusdottir,Ida Johansson,Lars-Gran Dahlgren et al.(2009)Enabling IMaC purification of low abundance recombinant proteins from 4.E.coli lysates.Nature Methods 6(7):477-478.2.Avi-tag15个氨基酸残基组成的短肽标签Avi-tag是一个由15个氨基酸残基组成的短肽标签（图32），在体内或体外都能被生物素连接酶在赖氨酸残基连接上一个生物素，从而实现蛋白的生物素化。而抗生物素蛋白或链霉亲和素可以专一地与生物素结合，正是基于这两个反应，Avi-tag技术可以应用于蛋白的固定、纯化和显影等。借助Avi-tag和生物素连接酶，基本上所有的蛋白质都能被有效的、特异性地标记上生物素标签。在体外试验中，BirA酶标记生物素的效率超过了95%。Avi-tag借助生物素连接酶的酶催化反应来标记生物素，相比使用化学方法给蛋白质标记生物素标签无疑具有一系列的优点：无论在体外或者体内，几乎所有的蛋白都可以在一个独特的Avi-tag位点轻易且有效地被生物素化；由于此类生物素化是通过酶和底物的反应来实现，反应条件相当温和而且标记的专一性极高。相反，化学标记法是随机的标记，如果蛋白质的结合位点或催化位点被生物素标记，那么蛋白质就有可能丧失活性。而且使用化学方法标记的蛋白质会在链霉素表面以任意方式结合，这也会造成被标记蛋白正常构象受到破坏从而失去其功能。此外，化学标记法还无法应用于异质蛋白样品（heterogeneous populations of protein）的标记。因为化学标记法是非特异性的标记，所以还缺乏重复性，每次试验的结果容易不一致。针对这些缺点Avi-tag系统 生命奥秘 26 生命奥秘 26通过特异性的生物素化技术都能很好地解决。化学方法的生物素标签是85个氨基酸，而生物素Avi-tag只有15个氨基酸，大小是前者的五分之一，这对尽量降低标签对蛋白的空间结构的影响来讲非常重要。2.3 Avi-tag的应用（图33）2.4 Avi-tag ORF表达克隆及其应用Avi-Tag系统能简单、高效地纯化蛋白或固定吸附蛋白。由于Avi-tag标签非常小，所以基本上能使所有的蛋白质固定到任何介质表面，例如微量滴定板（micro-titer plate）、层析介质（chromatography media）、生物传感芯片（biosensor chip）、硝化纤维素膜（nitrocellulose）以及PVDF膜等。它可以广泛应用于医学和工业领域，并且已经在这些领域中得到了越来越多的应用：生物传感（Biosensor）、诊断（Diagnostic）、闪烁迫近分析法（Proximity assay）、药物筛选（Drug Screening）。Avi-tag标签已经被证明在如下领域是非常适用的。（1）蛋白纯化：利用单体抗生物素来进行Avi-tag融合蛋白纯化比其它常用的标签技术，如6His效率更高。（2）蛋白检测：与抗生物素或链霉亲和素结合之后，Avi-tag融合蛋白就可以被多种方法检测，例如Western blot和T细胞染色。（3）细胞分选（4）敏感蛋白检测：固定化的Avi-tag标签融合蛋白的应用广泛，包括从高通量筛选到表面等离子体共振检测蛋白间相互作用等方面。图33 Avi-tag标签的应用。左图：敏感蛋白检测系统；右图：蛋白纯化。图片来源:广州复能基因有限公司开发的载体能在目的蛋白的N端、C端加上Avi-tag标签，高效融合表达，对Avi-tag的融合表达载体进行了优化，并构建好了人类、小鼠的编码基因ORF与Avi-tag融合表达克隆（http:/ ORF融合表达克隆，直接进行下游的研究工作。2727图34 Avi-tag融合表达克隆图片来源：图35 293细胞中带Avi-Tag的eGFP被生物素连接酶生物素化。图片来源：全长蛋白编码ORF起始终止OmicsLinkTM AviTagTM ORF Expression CloneOmicsLinkTM AviTagTM ORF Expression CloneAviTag1.监测蛋白表达2.蛋白分离及纯化3.蛋白复合物分离4.固定（蛋白芯片）5.蛋白质细胞定为及成像生物素化蛋白蛋白生物素由于生物素连接酶是来源于细菌等低等生物，在高等哺乳动物细胞是没有这类酶，也就无法在哺乳动物细胞内把Avi-Tag ORF融合表达克隆标记上生物素，因此哺乳动物细胞表达的Avi-Tag融合蛋白往往需要体外生物素化，这就大大限制了Avi-Tag的应用。广州复能基因有限公司结合Avi-Tag与IRES技术，建立了在高等哺乳动物细胞内进行酶促催化生物素化的体系，使得哺乳动物细胞表达的Avi-Tag融合蛋白在胞内就被生物素化（http:/ 原文检索：http:/