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1、 血清成分分析 作者：管忠健 指导老师：贾守菊 学号：10112314113 （温州大学生命与环境学院，10生本） 摘要：血清中含有有各种血浆蛋白（α、β、γ-球蛋白、清蛋白）、多肽、胆固醇、谷丙转氨酶、碳水化合物、生长因子、激素、无机物等。实验通过邻苯二甲醛法测定血清胆固醇的含量；通过盐析、透析与浓缩等方法分离血清中的清蛋白和γ-球蛋白并用醋酸纤维素薄膜电泳进行鉴定；通过纸层析法鉴定谷丙转氨酶活性。同时我们又探究比较家鸡和乌鸡血清中的胆固醇含量、谷丙转氨酶活力。 关键词：血清、家鸡、乌鸡、胆固醇、清蛋白、γ-球蛋白、谷丙转氨酶 前言：血清，指血液凝固后，在血浆中除去纤
2、维蛋白分离出的淡黄色透明液体或指纤维蛋白已被除去的血浆。其主要作用是提供基本营养物质、提供激素和各种生长因子、提供结合蛋白、提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤、对培养中的细胞起到某些保护作用。血清清蛋白与γ-球蛋白是血清的重要成分，通过实验掌握盐析法分离提纯蛋白质的原理和方法；掌握透析法脱盐与蛋白质浓缩的方法； 掌握凝胶过滤层析的技术方法；掌握利用醋酸纤维素薄膜电泳法分离与鉴定血清清蛋白的原理和方法。谷丙转氨酶是肝功能检查项目中一项比较灵敏的指标，实验用纸层折法观察肝脏谷丙转氨酶（ALT）的转氨基作用；用分光光度法测定血清谷丙转氨酶的活力。胆固醇广泛存在于动物体内，尤以脑及神经组织中最
3、为丰富，在肾、脾、皮肤、肝和胆汁中含量也高。其溶解性与脂肪类似，不溶于水，易溶于乙醚、氯仿等溶剂。胆固醇是动物组织细胞所不可缺少的重要物质，它不仅参与形成细胞膜，而且是合成胆汁酸，维生素D以及甾体激素的原料。血清胆固醇是测定血脂的常规项目，试验用邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇，来比较家鸡与乌鸡血清的区别。 一、 实际材料、试剂和器材 （一）材料分析 乌鸡血清、家鸡血清、动物肝脏 （二）试剂 1、 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） （1）邻苯二甲醛试剂：称取邻苯二甲醛（A.R.）50mg，以无水乙醇（A.R.）溶解并稀释到50mL，冷藏，有效期1个半月。（2）90%醋酸（3）标准胆
4、固醇应用液（0.1mg/mL）（4）混合酸：取 试剂2加等体积浓硫酸混匀即成。 （5）标准胆固醇贮液（1mg/mL）：准确称取胆固醇（A. R.）100mg以醋酸定容至100mL。 2、血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 （1）血清 （2）PBS（3）（NH4）2SO4溶液 （4）双缩脲试剂（5）酪蛋白 （6）蔗糖（7）BaCl2溶液 3、凝胶层析 （1）Sephandex 4B 凝胶（2）生理盐水（3）5%重铬酸钾（4）5%蓝葡聚糖 4、谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 （1）0.9% NaCl溶液 (2
5、)海砂 （3）1% 谷氨酸溶液（1%KOH溶液中和） （4）1% 丙酮酸钠溶液（用1%KOH溶液中和） （5）0.1% KHCO3溶液 （6）0.025% 溴乙酸溶液（用1%KOH中和） （7）2% 乙酸溶液 （8） 、苯酚的饱和水溶液：将2份酚和2份水（按重量计算）混合后，放入分液 漏斗中，振荡。静止24h后分层，将下部酚层放入瓶中备用。新配制的酚展层剂可以反复使用1周。 （9）0.1% 水合茚三酮的正丁醇溶液 (10)0.1% 标准谷氨酸溶液 (11)0.1% 标准丙氨酸溶液 (12)1% KOH溶液 （9） （13
6、1/15 mol/L pH=7.4的磷酸缓冲液:取1/15 mol/L磷酸氢二钠（称取Na2HPO4 9.47g或Na2HPO4·12H2O23.87g，溶于蒸馏水中定容至1000mL）825mL；1/15 mol/L磷酸二氢钾（称取KH2PO4 9.078g溶于蒸馏水中定容1000mL）175mL混合。 （14）GPT基质液（谷丙转氨酶底物）:取分析纯α-酮戊二酸29.2mg，DL-丙氨酸1.78g置于小烧杯内，加入1mol/LNaOH溶液约10mL，使其完全溶解，并用1mol/LNaOH溶液或1mol/L盐酸调整pH至7.4，加磷酸缓冲液定容至100mL。可加氯仿数滴防腐。此溶液每毫升
7、含α-酮戊二酸2.0微摩尔，丙氨酸200微摩尔。在冰箱内可保存一周。 （14）1mmol/L 2，4-二硝基苯肼:在200mL锥形瓶内放入分析纯2，4-二硝基苯肼19.8mg，加100mL 1mol/L盐酸。把锥形瓶放在暗处并不时摇动，待2，4-二硝基苯肼全部溶解后，滤入棕色瓶中，置冰箱内保存。缓冲液溶解后定容至100mL。临用前配制。 （16）0.4mol/LNaOH溶液 （三） 器材 离心机、移液管、透析袋、试管、吸管、容量瓶、烧杯、电子分析天平、分光光度计、铁架台、凝胶柱（10×1.0cm）、玻璃棒 胶头吸管、吹风机、培养皿、滤纸、剪刀、恒温水浴锅、量筒。 二、实验方法与方案设
8、计 实验一 血清胆固醇的定量测定（邻苯二甲醛法） 1、标准曲线的绘制 取清洁干燥试管5支，编号，按表2加入试剂。 表2 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制 编号 试剂 编号 编号 编号 编号 编号 0 1 2 3 4 标准胆固醇应用液/mL 0 0.1 0.2 0.3 0.4 醋酸/mL 0.4 0.3 0.2 0.1 0 邻苯二甲醛试剂/mL 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 蒸馏水/mL 0.01 0.01 0.01 0.01 0.01 混合酸/mL 4.0 4.0 4.0
9、4.0 4.0 100mL血清中总胆固醇含量/mg 0 100 200 300 400 A550nm 加毕，混匀，静置10min，以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线。 2、样品的测定 取3支清洁干燥试管，编号后，按表3加入试剂。 表3 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——样品的测定 试管 试剂 对照 样品1 样品2 醋酸/mL 0.4 0.4 0.4 血清/mL 0.01 0.01 0.01 邻苯二甲醛试剂/mL 0 0.2 0.2 无水乙醇/mL 0.2 0 0
10、 混合酸/mL* 4.0 4.0 4.0 *硫酸含量的高低对显色有影响，故混合酸的配制和测定过程中的加量都应准确。 显色时要避免高温，采用混合酸液反应时温度不会升得太高，一般在4~32℃时，颜色能稳定2h。 加毕，混匀，静置10min，于550nm波长比色，以对照管校零点，对照标准曲线即知100mL样品中总胆固醇含量（mg）。 实验二 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 （一）血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤 血清清蛋白与γ-球蛋白的盐析实验步骤 取离心管一支，加入2mL血清 加入2mLPBS（稀释血清），摇匀 逐滴加入pH=7.2的（NH4）2SO4溶液2mL，边
11、加边摇 静止30min，离心20min（v=3000rpm） 上清液（主要含有清蛋白） 沉淀（主要含有γ-球蛋白） 加入3.132g(NH4)2SO4，使上清液饱和 加1mLPBS溶解 静止30min 逐滴加入饱和（NH4）2SO4溶液0.5mL （相当于33%饱和（NH4）2SO4溶液） 离心、沉淀 加1mLPBS溶解沉淀 放置30min 放入透析袋 离心20min（v=3000rpm）* *放弃离心后的上清液（主要是α、β球蛋白），沉淀即为初步纯化的γ-球蛋白 （二） 蛋白质透析与浓缩的实验步骤 1. 取玻璃纸（15cm×15cm）两张，折成袋状。将前
12、面第一次盐析得到的含有清蛋白的上清液和γ-球蛋白分别倒入两个透析袋中，用线绳系紧上口。 2. 用玻璃棒悬挂在盛有半杯蒸馏水的100mL烧杯中，使透析袋下半部浸入水中，流水透析1h。 3. 将两透析袋取出，埋入蔗糖中浓缩。 【三】 凝胶层析的实验步骤 凝胶层析的实验步骤 过程名称 实验步骤 凝胶预处理 8g葡萄糖胶G-25放入100mL烧杯中 100mL蒸馏水 小火煮沸1h 静止、冷却、倾弃蒸馏水 加入PBS10mL 轻轻搅拌至凝胶悬起 倾入10cm×1.0cm层析柱 装柱 将全部凝胶都倾入柱内，且液面接近凝胶面时，用螺旋夹将橡胶管夹紧，然后
13、小心放松螺旋夹，使液体缓慢流出，到液体刚好流入凝胶面时，将螺旋夹再夹紧，装柱工作完成。 加样 用胶头吸管将柱中上方清液吸出，加入重铬酸钾和蓝葡聚糖混合溶液，用胶塞封住上口。 洗脱 用生理盐水洗脱液进行洗脱。打开螺旋夹，使液体的流速达到6～7dpm（实际10～15 dpm）。 收集 混合液在凝胶柱中分离，蓝色的蓝葡聚糖在下方，黄色的重铬酸钾在上方。用试管收集流出蓝、黄色液体，比色并画出洗脱曲线。 （三） 醋酸纤维素薄膜电泳的实验步骤 醋酸纤维素薄膜电泳实验步骤 浸泡 将醋酸纤维素薄膜在缓冲溶液中浸泡20min，取出识别光面和粗糙面。 点样
14、 用镊子将薄膜置于滤纸上，吸收多余的液体，用铅笔在薄膜粗糙面一端2cm处画一细线，利用盖玻片一侧蘸取样品，于细线处点样。 电泳 将薄膜粗糙面朝下，平悬于电泳槽支架的滤纸桥上，点样一端靠近负极；使U=160V，电泳45min。 染色 将薄膜取出后，置于氨基黑10B染色剂重，染色10min。 漂洗及透明 将薄膜取出，移至漂洗液中漂洗若干次，至背景无色后置于玻板上，用滤纸去除多余液体后滴加透明液透明，烘干。 实验三 谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 （一）谷丙转氨酶提取液制备 谷丙转氨酶提取液制备方法 2g肝脏 + 0.9% NaCl 6mL
15、 + 海砂200mg 在低温下，研磨成浆 用脱脂棉（或双层纱布）过滤，得提取液（滤液不清） （二）转氨作用 试 剂 对照管 测试管 1 测试管 2 0.1moL/L谷氨酸 0.50 0.50 0.50 0.1moL/L丙酮酸钠 0.50 0.50 0.50 0.1% KHCO3 0.50 0.50 0.50 0.025% 溴乙酸 0.25 0.25 0.25 煮沸的酶液 0.50 — — 酶液 — 0.50 0.50 加脱脂棉塞，45℃水浴，1.5h，时时振荡内容物 2% 乙酸 6滴 6滴 6滴 沸水浴2min，使
16、蛋白质完全沉下，过滤，作层析 （三）纸层析 1、方法 纸层析方法 取圆形层析滤纸1张，在圆心处用圆规绘出直径为3cm的同心圆 通过中心将滤纸绘成五等分扇形，用毛细管点样2～4次（直径不超过2mm） 在滤纸的圆心上剪一小孔，直径约1～2mm 取一小滤纸条，将下端剪成刷状，再卷成灯芯插入圆形小孔，不能使灯芯突出纸面 将圆形滤纸平放在盛有层析液（水饱和酚）培养皿上，使灯芯向下与溶剂接触 用大小相同的培养皿盖在滤纸上 溶剂通过灯芯上升到滤纸上向四周展层，直到溶剂前沿移至距滤纸边缘约1cm处时停止（展层时间为1h） 80～100℃烘箱干燥，喷洒水合茚三酮的正丁醇溶液，80～100℃
17、显色 四、血清谷丙转氨酶活力单位测定 1、标准曲线的绘制 试 剂 试管号 0 1 2 3 4 5 丙酮酸钠标准液（mL） — 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 GPT基质液（mL） 0.50 0.45 0.40 0.35 0.30 0.25 pH7.4磷酸缓冲液（mL） 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 0.10 充分摇匀后，置于37℃水浴，保温10min 2，4-二硝基苯肼（mL） 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 充分摇匀后，置于37℃水浴，保温
18、20min 0.4mol/LNaOH（mL） 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 5.00 充分摇匀，室温静置10min后，以0号管为空白，520nm波长下比色 A520nm值 各管所含丙酮酸量（μmol） — 0.10 0.20 0.30 0.40 0.50 各管相当于酶的单位数 — 100 200 300 400 500 以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线。 注：（1）丙酮酸钠标准液mL数×摩尔浓度（2μmol/mL） （2） GPT活力单位为
19、每mL血清在37℃与pH=7.4的基质液作用60min，生成1μmol丙酮酸为一个单位（U）。本实验（临床检验）取血清量为0.1mL，报告数据以100mL血清计算，因此将实际测得结果×1000即可。 2、酶活力的测定 试 剂 测定管 测定管 对照管 1 2 0 GPT基质液（mL） 0.50 0.50 0.50 37℃水浴，预温10min 血清（mL） 0.10 0.10 — 充分摇匀后，置于37℃水浴，保温30min 2，4-二硝基苯肼（mL） 0.50 0.50 0.50 血清（mL） — — 0.10 0.4mol/
20、L NaOH（mL） 5.00 5.00 5.00 摇匀后，室温静置10分钟，520nm波长下比色 A520nm值 查标准曲线的对应值，得100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数 实验结果 1、邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇——标准曲线的绘制 以550nm波长比色测定，以吸光度值为纵坐标，胆固醇含量为横坐标，做标准曲线，如图所示： 图1 邻苯二甲醛法测定血清总胆固醇的标准曲线 2、血清谷丙转氨酶活力单位数——标准曲线的绘制 以酶的活力单位数为横坐标，以光吸收值为纵坐标，绘制A520nm与对应的酶活力单位数的标准曲线，如下图所示：
21、 图2 血清谷丙转氨酶活力单位数标准曲线 根据标准曲线得： 材料 项目 100mL血清中总胆固醇含量/mg 100mL血清中谷丙转氨酶的活力单位数 家鸡 8.89 95600 乌鸡 31.7 147800 表1 从上表1中对比分析可得出结论如下： 乌鸡血清中的胆固醇含量和谷丙转氨酶的活力单位数均高于家鸡血清。 3、 血清清蛋白与γ-球蛋白的分离与鉴定 结果分析与讨论： （1）谷丙转氨酶活性的鉴定及活力单位的测定 血清中谷丙转氨酶
22、酶活力的变化，可作为临床辅助诊断指标 在谷丙转氨酶活性的鉴定时得到：由于谷氨酸转化为丙氨酸为可逆反应，所以未煮沸的酶液中存在2条带，距圆心较远端为丙氨酸，较近端为谷氨酸。而煮沸的酶液中由于谷丙转氨酶失活无法使谷氨酸转化为丙氨酸，因此只有谷氨酸一条带。在此实验中我们应注意：实验所用器皿应干净、干燥，防止溶血及其他因素对酶活性影响。 （2）在本次实验中，我通过多家鸡与乌鸡血清中胆固醇、蛋白质及谷丙转氨酶活力等的测定，了解到家鸡与乌鸡虽然在种类上有所差别，但两者的血清成分差异不大，从而可以引出，自然界中大多数动物的血清成分大致一样，表明了生物的统一性。但在酶活力等个别因素上，还是存在差异
23、这也表现了生物界的个别差异性。通过实验，还学习了凝胶等实验技巧，提高了专业水平。 图3 从上图3中对比分析可得出结论如下：全血清中含有四条谱带，其中距离点样区最远端为清蛋白，最近端为γ-球蛋白。由于拍照时没有将其较好排列，因此从图上难看出清蛋白为最远端。 4、谷丙转氨酶活性的鉴定 图4 从上图4中对比分析可得出结论如下：由于谷氨酸转化为丙氨酸为可逆反应，所以未煮沸的酶液中存在2条带，距圆心较远端为丙氨酸，较近端为谷氨酸。而煮沸的酶液中由于谷丙转氨酶失活无法使谷氨酸转化为丙氨酸，因此只有谷氨酸一条带。
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