PCR抑制剂和增强剂PPT参考课件.ppt

单击此处编辑母版标题样式,单击此处编辑母版文本样式,第二级,第三级,第四级,第五级,*,PCR,抑制剂和增强剂,1,PCR,抑制剂,SDS,苯酚,乙醇,异丙醇,乙酸钠,氯化钠,EDTA,血红素（,heme,）,hemin,（氯高铁血红素）,tannic acids,（丹宁酸）,肝素,尿素,二甲苯胺,溴酚兰,腐殖质,植物多糖,聚苯乙烯、聚丙烯,铁离子,bilirubin,（胆红素）,胆酸盐,2,抑制剂来源,抑制剂,来源,胆酸盐,粪便,复杂多糖,粪便，植物材料,胶原质,组织,血红素（,heme,）,血液,腐植酸,土壤，植物材料，自然界水,黑色素,头发，皮肤,尿素,尿,血色素,hemoglobin,血液,靛青染料,粗斜纹棉布,聚苯乙烯，聚丙烯,紫外线照射塑料管,蛋白酶,牛奶,钙离子,牛奶，骨头,3,抑制剂的作用浓度,SDS,离子去污剂，蛋白变性，,0.01%,即可完全抑制,PCR,反应，,0.005%,可显著降低产量,苯酚,蛋白变性，,0.5%,即可完全抑制,PCR,反应，,0.2%,可显著降低产量,乙醇,大于,1%,的浓度可抑制,PCR,反应，但在某些系统中可增加产量。,异丙醇,抑制作用比乙醇稍强,乙酸钠,大于,5mM,时抑制,PCR,反应,氯化钠,大于,25mM,时抑制,PCR,反应,EDTA,0.5mM,可使,PCR,产物减少，,1mM,完全没有,PCR,产物。,血色素,1mg/ml,肝素,0.15I.U./ml,尿素,20mM,（相当于,10l PCR,体系中含,0.6l,尿液）,氯高铁血红素,0.1ng/l,丹宁酸,0.1ng/l,4,例,1,：操作时温度不同产生的抑制剂,Shames,等人（,1995,）使用,PVP,（,polyvinylpyrollidone,）在,4,分离粪便中的细菌,DNA,，然后用,Chelex100,处理。尽管用,PVP,在室温也可以分离,DNA,，但得到的,DNA,用于,PCR,扩增效果不够好，也许因为在更高的温度释放出了更多的,PCR,抑制剂。,5,例,2,：间接产生的抑制剂,Yoshii T,等人,1992,年，用单根头发提取,DNA,扩增线粒体,DNA,一段,333bp,的非编码区。,所有实验均截取,5cm,长的毛干,后研究表明染色剂中的过氧化氢可以使不溶于水的黑色素变成水溶性的。,头发种类,截取毛干区域,扩增成功率,自然黑发,离根部,11cm,内,100%,离根部,11cm,外,部分成功,离根部,16cm,外,几乎不成功,白头发,离根部,31cm,外,可成功,染成深咖啡色的黑头发,完全失败,染成深咖啡色的白头发,可成功扩增,6,PCR,增强剂,PCR,增强剂可以增加所需,PCR,产物的产量或减少非特异性产物。有许多的,PCR,增强剂，原理各不相同，这些试剂不可能对所有的,PCR,反应都起作用。根据其作用和原理，可以大致分为三类：,1.,用于扩增高,GC,含量或形成复杂二级结构的模板（共溶剂）,2.,用于保护,DNA,聚合酶的活性和稳定性,3.,用于优化引物和模板的结合,7,1.,用于扩增高,GC,含量或形成复杂二级结构的模板的增强剂,甜菜碱（,betaine,），二甲基亚砜（,DMSO,）和甲酰胺（,formamide,），甘油，适合于扩增高,GC,含量和形成复杂二级结构的模板。,甜菜碱,1M,、,DMSO1-10,（,5%,？）、甲酰胺,1-5,、甘油,1,-10,对某些反应可以显著提高产量，但过量的这些试剂会抑制,PCR,反应。,8,在高浓度时，许多添加剂和共溶剂都可以抑制,PCR,，对不同浓度的引物和模板,DNA,的组合都应该通过经验来确定其最适浓度。根据我们的观点，当,PCR,出现问题时首先考虑的不应该是使用这些增强剂，而应该是对反应体系的控制成分进行优化，尤其是镁离子和钾离子的浓度。,这个普遍规律的一个例外是,GC-Melt,（,Clontech,公司）的应用,，我们发现它常常能够克服和解决对富含,G+C,的模板进行扩增时效率低下的问题。,分子克隆实验指南,Frackman,et al.,(1998),have demonstrated(using NMR analysis)that the PCR additive provided by QIAGEN in their PCR core kit(Q-Solution)and that provided by CLONTECH in the Advantage-GC cDNA PCR kit is in fact,Betaine,which is available at a fraction of the cost as a 5M solution from Sigma-Aldrich(cat.#B 0300),9,2.,用于保护聚合酶的活性和稳定性的增强剂,有的反应中，,0.1mg/ml,的,BSA,、,0.1-10,的明胶（,gelatin,）或非离子型的去污剂，可以解决一些扩增失败的问题，这类试剂可以增加聚合酶的稳定性，减少试剂在管壁上的吸附。,BSA,可以抵抗血色素、黑色素等的抑制作用,.,非离子去污剂，例如,Tween-20,NP-40,和,Triton X-100,等，可以抵抗痕量的强离子去污剂的抑制作用，比如,0.01%,的,SDS,。,10,3.,用于优化引物和模板的结合,铵离子的添加，可以减少引物和模板的错配，提高反应的特异性，可以让,PCR,对反应条件的要求更低，所以很多,PCR,试剂都包含了,10-20mM,的硫酸铵。,氯化四甲胺,tetramethyl ammonium chloride,（,TMAC,）,（,15-100mM,）也起到类似的作用,11,4.,其它增强剂,PEG,亚精胺,单链,DNA,结合蛋白,12,例：,Relief of Amplification Inhibition in PCR with Bovine Serum Albumin or T4 Gene 32 Protein,已知抑制剂：,EDTA,SDS,Triton X-100,，,hemin,（氯高铁血红素），,bilirubin,（胆红素），,sodium glycocholate (,甘胆酸钠,),，,sodium cholate plus deoxycholate,（脱氧胆酸钠），,sodium taurocholate,（牛黄胆酸钠），,tannic acids,（丹宁酸），,humic acid(,腐植酸,),，氯化铁，氯化钠，采自泥炭和,Suwannee,河的腐植酸和,fulvic acid(,棕黄酸,),13,PCR,反应：扩增,Bacteroides distasonis,基因组,消除腐植酸抑制作用的最优,BSA,浓度是,200-400ng/l,，最优,gp32,浓度是,100-150ng/l,因此，所有已知的抑制剂在检测时，都同时做了不含,BSA,和,gp32,的检测和含有,400ng/l BSA,或,150ng/l gp32,的检测。,抑制水平的定义：通过琼脂糖电泳观察，能够可重复性的降低,PCR,产量的最低抑制剂浓度。,14,不添加任何增强剂,15,PCR,体系中加入,400ng/l BSA,16,PCR,体系中加入,150ng/l gp32,17,加和不加增强剂的比较,18,结果,1,抑制剂,不加增强剂时的抑制水平,加入增强剂后的抑制水平,增强剂效果,EDTA,1mM,1mM,无效,FeCl3,1mM,10M,100,倍,bilirubin,（胆红素）,10g/l,100g/l,10,倍，不明显,Humic acid,，,Hemin,，,tannic acid,0.1ng/l,10,ng/l,100,倍,fulvic acid,1ng/l,100,ng/l,100,倍,19,结果,2,1.,BSA,和,gp32,都不能减少最小浓度的下列抑制剂的抑制作用：,0.1M,氯化钠，,0.1M SDS,，,10%Triton X-100,，,1-10g/l,任何一种胆酸盐，,EDTA,。,2.,hemin,的抑制作用可以被,BSA,或,gp32,明显减轻（,1000,倍），但其降解产物,bilirubin,却不能（小于,10,倍）。,3.,氯化铁在含,BSA,或,gp32,时，抑制水平降低,100,倍（,1mM VS 0.01mM,），在氯化铁浓度大于,1mM,时，因为形成难溶的氢氧化物，释放氢离子，,PCR,反应体系的,pH,随着氯化铁浓度的增大迅速降低。没有其它抑制剂影响,pH,值，即使是在很高的浓度。,20,4.,从鸡、奶牛，猪，马，绵羊粪便中提取的细菌片段，从,Ohio,河、大西洋、,Delaware,湾、一片沼泽地、一条淡水河、一条运河的过滤物中的提取物都能抑制,PCR,，但加入,BSA,或,gp32,后，,PCR,体系的容纳能力都可以提高,10-1000,倍。,21,谢谢,22,