PCR引物设计(以p53基因为例).ppt

p53基因引物设计,临床八年1305班,冯昊,CONTENTS,目录,Part,1,引物设计原则,P,art,2,获取目的基因,Part,3,引物设计,引物的设计原则,设计的目的是在两个目标间取得平衡：,扩增特异性,和,扩增效率,PART,ONE,1,2,引物长度,一般引物长度为1830碱基。决定引物,熔解,温度（Tm值）最重要的因素就是引物的长度,。长度越长，,Tm,值越大。,长度过长，退火温度和延长温度相差太小，不利于延伸反应。长度过短，特异性低,GC含量,一般为,40%60%,，一对引物的,GC,含量和,Tm,值应该协调。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5端加适量的A、T或G、C尾巴,引 物 设 计 原 则,3,引物自身和引物之间,引物自身不应形成二级结构（如发夹结构）,引 物 设 计 原 则,引物之间不能形成二聚体（包括同种引物之间或上游引物与下游引物之间）且引物不能与DNA其他区域错配,引 物 设 计 原 则,4,引物末端,引物,3,端,：由于延伸从,3,端开始，因而不能进行任何修饰；同时不应选择A，因为A-A、A-G错配。,3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发,引物,5,端,：主要限定引物长度，对扩增特异性影响不大；可以修饰，如添加限制性内切酶位点，将PCR产物亚克隆,引 物 设 计 原 则,引物,5,端修饰技术,附加核酸序列,用 途,限制酶位点 克隆（如定向克隆）,噬菌体启动子 合成,RNA,探针、测序,蛋白质结合序列 产物纯化、检测,核糖体结合序列 高效表达,加错配,碱基造成突变 定点诱变,5,避开靶基因的二级结构区,PART,TWO,获取目的基因,利用Genbank数据库搜寻DNA、mRNA或者蛋白质序列来设计引物,获 取 目 的 基 因,www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/,mRNA对应DNA序列,蛋白质一级结构,蛋白质编码区,外显子对应的DNA序列、基因、编号,单击CDS后,PART,THREE,引物设计,利用生物软件和网页进行引物的设计和评价,引 物 设 计,Primer premier 5,最常用的引物设计软件,Oligo 7,常和PP5联用评估引物,NCBI Primer-blast,近几年NCBI推出的网站,此区域输入待测DNA序列,上游引物,下游引物,引 物 设 计,结 果（一例）,引物与DNA结合情况,RT-,PCR,由于后面要应用于RT-PCR，复制的是cDNA，而cDNA中没有内含子，所以在设计引物时应该用,编码区,结果,：,简并引物,是指代表编码单个氨基酸所有不同碱基可能性的不同序列的混合物。,简 并 引 物,M-A C,S-G C,W-A T,R-G A,Y-T C,K-G T,B-G T C,D-G A T,H-A C,T,V-G C A,N-A G C,T,T,h,anks,