胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用.pdf

4 8 8 临 床 军 医 杂 志(C l i n J M e d O ff i c)2 0 0 8年8 月 第3 6卷第4期 胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用 陆智杰，昊飞翔，缪雪 蓉，俞 卫锋(解放 军第二 军医大学东方肝胆外科 医院麻 醉科，上海2 0 0 4 3 8)摘要：目的观察胰腺癌疼痛患 者的胰腺肿瘤标本 内胰蛋 白酶的 m R N A及其蛋 白的表达。方法取视觉模 拟疼 痛评分(V A S)在 5分 以上 的胰腺肿瘤患者的新鲜组织标本，采用 R T P C R及 E L I S A的方法对胰蛋白酶的 m R N A及其蛋白的表达进行检测。结果胰腺癌组织中人 胰蛋白酶 mR N A水 平明显高于正常胰腺 组织，E L I S A显示胰腺癌组织 的胰蛋 白酶水 平明显增高，与正 常胰腺组织相 比，差 异具 有统计学 意 义(P5 R e s u l t s T h e mR N A l e v e l w a s s i g n i fi c a n d y h i g h e r i n p a n c r e a t i c c a r c i n o ma t i s s u e t h a n i n n o ma l p a n c r e a t i c t i s s u e A n d o u t c o me of E L I S A s h o w e d t r y p s i n l e v e l of p a n c r e a t i c c a r c i n o ma t i s s u e s i g n ifi c a n d y i n c r e a s e d c o m p a r e d w i t h t h a t of n o m al p a n c r e a t i c t i s s u e(P0 0 5)C o n c l u s i o n Hi g h e x p r e s s i o n of t ryp s i n i s f o u n d i n p a n c r e a t i c c a r c i n o ma p a t i e n t s wi t h p a i n，w h i c h ma y me d i a t e n o c i c e p t i o n b y a c t i v a t i o n o f p r o t e a s e a c t i v a t e d r e c e p t o r 一 2 i n p r i ma ry s e n s o ry ne u r o n s Ke y wor ds：t ryp s i n；pa n c r e a t i c c a rci no ma；pa i n；p rot ea s e a c t i va t e d r e c e p t o r-2 1 9 9 1-2 0 0 0年来，中国胰腺癌病 死率水平在不断上 升，6 5岁以上人群尤为明显。胰腺癌患者发生疼痛极为 常见，胰腺癌患者的疼痛发生率及其严重程度与肿瘤程度 相关，约3 0 一 6 0 病灶相对局限的早期胰腺癌患者和逾 8 0 的进展期胰腺癌患者有癌痛体验，患者死亡前的癌痛 发生率更高达9 0。胰蛋白酶(T r y p s i n)为蛋 白酶的一种，在胰脏是作为酶 的前体胰蛋白酶原而被合成的，是肽链 内切酶，它能把多 肽链中赖氨酸和精氨酸残基中的羧基侧切断。它不仅起消 化酶的作用，而且还能限制分解糜蛋 白酶原羧肽酶原、磷 脂酶原等其他酶的前体，起活化作用。胰蛋白酶还可激活 蛋白酶活化受体-2(p r o t e a s e a c t i v a t e d r e c e p t o r，P AR-2)，近 年来，发现蛋白酶活化受体-2可能介导胰腺炎的疼痛，给清醒大鼠胰管 内注入胰蛋白酶和 P AR-2特异性肽激动 剂均可以引起疼痛行为反应。在胰腺炎症时，胰腺组织胰 蛋白酶可激活 P A R-2，在胰腺癌发生时，是否同样具有蛋白 酶的高表达呢?为此，我们选取东方肝胆外科医院确诊的 胰腺癌病例，视觉模拟疼痛评分(V A S)在 5分 以上的胰腺 肿瘤患者的新鲜组织标本，对胰蛋白酶的 mR N A及其蛋白 的表达进 行检测，以验证胰蛋 白酶是否高表达，并激活 P A R 2引起胰腺癌疼痛。1 材料与方法 1 1 实验材料选 取人 胰腺 癌 患者 的肿瘤新 鲜组 织。人 胰蛋白酶 E L I S A试剂盒为武汉中美科技有限公司产品。考 马斯亮蓝试剂盒为南京建成生物工程研究所产品。R T P C R 试剂盒为德国 Q i a g e n公司产品。T a g酶为美国 B i o L a b s公 司产 品。1 2 标本的选取及分组分为两组，实验组 1 0例为胰腺 癌组，视觉模拟疼痛评分(V A S)在 5分以上；对照组 1 0例 为正常胰腺组织组。收稿 日期：2 0 0 8-0 3-2 1 基金项 目：本课题受上海 市科 委基金 资助(0 7 4 1 1 9 6 0 9)作者简介：陆智杰(1 9 7 4 )，男 上海人，主治医师，医学硕士(通讯作者：俞卫锋教授，博士生导师 E m a i l：y w f 8 0 8 s o h u c o rn)。维普资讯 http:/ 第 4 期 胰蛋白酶在胰腺癌疼痛中的作用陆智杰，等 4 8 9 1 3 R l Z P C R方法检测人胰蛋 白酶 mR N A的表达人胰 蛋白酶基因序列(N M-0 0 2 7 7 1 2)由 G e n e b a n k获得，据其序 列特点，设计引物序列如下：5-C A T G T r C T G T G T G G G C T r C C T 3；5-G T A G A C C T r G G T G T A G A C T C C-3。取预标本匀浆，加人T r i z o l 试剂 1 m l，振荡 1 5 s混匀后，加人酚 2 0 0 l，混 匀，加人氯仿：异戊醇溶液 2 0 0 ，混匀。4 o C，1 5 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n，抽取上清人新管；加人 4 0 0 氯仿：异戊醇溶 液，混匀后 4，1 5 0 0 0 r m i n离心 1 0 m i n，抽上清人新管，用5 0 0 ml 异丙醇室温下沉淀 1 0 mi n，4，1 5 0 0 0 r m i n离 心 1 0 m i n，弃 上清，用 7 0 乙醇溶 液 1 m l 清洗 2次，溶解 于 M i l l i q 水 5 0 l 中，分光光度计检测浓度和纯度 一 8 0 低 温保存。而后以上述引物行 R T P C R，解链温度为5 4，进 行 3 0个循环。1 4 E L I S A检测人胰蛋白酶水平的变化取正常胰腺组 织及胰腺癌组织，匀浆后考马斯亮蓝测定总蛋白，采用双抗 体夹心 A B C E L I S A法检测，将抗人胰蛋 白酶单抗包被于酶 标板上，标准品和样品中的人胰蛋白酶与单抗结合，加人生 物素化的抗大鼠人胰蛋白酶，形成免疫复合物连接在板上，辣根过氧化酶标记的 S t r e p t a v i d i n与生物素结合，加人酶底 物 O P D，出现黄色，加终止液硫酸，颜色变深，在 4 5 0 n m 处 测 O D值，人胰蛋白酶浓度与 O D值成正比，可通过绘制标 准曲线求出标本中人胰蛋白酶浓度。1 5 统计学方法计量资料以均数 标准差表示，用 S A S 6 1 2统计 软件进行分 析，数据 比较均 采用近 似 F检 验(S N K q)，P5分。另获 取对照组正常胰腺组织标本 1 0例。2 2 R T P C R方 法检测人胰 蛋 白酶 m R N A的表达 R T P C R测定人胰蛋 白酶 mR N A水平，可扩增 出 1 3 4 b p的序 列，如图 1 所示。胰腺癌组织中人胰蛋白酶 mR N A水平明 显高于正常胰腺组织。图 1 R T-P C R示胰腺及 胰腺癌组 织中胰蛋 白酶 mR N A水平 2 3 E L I S A检测人胰蛋白酶水平的变化 E L I S A测定 的 标准曲线方程为 Y=1 7 6 5 5 x一0 6 2 3 6，相关系数 R =0 9 9 8 1，具有良好的相关性。标准曲线如图2所示。根据所测的 O D值及标准 曲线，对胰腺癌及正常胰腺 组织的胰蛋白酶值进行计算，胰腺癌组织的胰蛋 白酶水平 明显高于正常胰腺(P0 0 5)。详见表 1(因胰腺癌组有 3 例胰腺组织坏死，未能检测，故测 了 7例。为方便比较正 常组也测了 7 例)。6 O 5 0 4 0 3 0 返 0 1 0 0 0 0 0 5 0 1 0 1 5 0 2 0 2 5 0 3 0 3 5 图 2 E L I S A标 准曲线 表 l 胰腺 癌与正 常胰腺组织 中胰蛋 白酶水 平比较(吕 L)组 别 胰腺 癌 正 常胰腺 3讨 论 胰腺癌的腹痛表现多种多样，并可在胰腺癌病程及诊 治过程中发生变化。典型腹痛表现为上腹部疼痛，腹痛性 质常见上腹钝痛、阵发性剧烈上腹痛和涉及腰背部的上腹 痛。本研究所选择的方法，多是以上腹痛为首发症状 J，视 觉模拟疼痛评分(V A S)都在 5分以上。晚期胰腺癌疼痛相 当剧烈，不仅为躯体方面的疼痛，而是涉及社会、心理和精 神方面的全方位疼痛，常伴有强烈的 自主神经系统和心理 学异常，部分患者 对癌痛的恐惧甚 至超过对死亡的恐惧。因此，癌痛控制已成为患者的第一需要和构成胰腺癌姑息 治疗不可缺少的重要组成部分。胰蛋白酶为蛋白酶的一种，而在胰腺癌的患者中，半数 以上出现胰蛋白酶增高。肿瘤侵犯正常胰腺，可导致胰蛋 白酶被激活。此外肿瘤组织中也可能分泌其他能够激活 P A R-2的蛋白酶。因此，肿瘤组织完全有可能通过这些蛋 白酶直接激活初级传人感觉神经元，继而将伤害性感受信 号逐级传递到中枢，这很可能是胰腺癌疼痛的重要 的发生 和维持机制之一。在本研究中，通过 E L I S A及 R T-P C R方 法对胰腺癌组织中胰蛋 白酶及其 mR N A水平进行测定，发 现胰腺癌组织中胰蛋白酶及其 mR N A水平明显高于正常胰 腺组织(P0 0 5)，这说明胰腺癌发生时胰蛋 白酶的水平 及蛋白水解酶的活性都明显升高，这可能与胰腺癌的发生 有关。但同时，也促进胰蛋白酶及蛋 白水解酶与 P A R-2结 合，激活 P AR 2，通过细胞内的信号转导，传递痛觉信号，导 致胰腺癌疼痛的发生。这与 K a y s s i 等 在结肠的研究中一 致，认为胰蛋白酶及 P A R-2以白分泌、正反馈的方式在促 进肿瘤增生的 同时，也激活了 MA P K E R K通路，同时抑制 维普资讯 http:/ 4 9 0 临 床 军 医 杂 志(C l i n J M e d O f fi e)2 0 0 8 年 8月 第 3 6卷 第4期 了I K电流，从而使 D R G神经元处于高兴奋状态，维持长期 的内脏痛。胰蛋白酶是最有效的 P A R-2激活剂 J，可激活胰腺导 管上皮细胞的 P A R-2。活化 的 P A R-2可通过磷酸肌醇、酪 氨酸磷酸化、蛋 白激酶 C、C a 等介导细胞内信号转导，近 年来研究主要集中在细胞外信号 调节激酶(e x t r a e e l l u l a r s i g n a l r e g u l a t e d k i n a s e，E R K)转 导途 径。j。P A R-2激 活剂 能经多种途径激活 E R K 1 2，E R K 1 2激活后可使细胞骨架 蛋白、微管相关蛋白和磷脂酶 A 2磷酸化，启动多种细胞质 反应，E R K还可通过激活 c A MP反应元件结合蛋白(c A MP r e s p o n s e e l e m e n t b i n d i n g p r o t e i n，C R E B)，以C R E B依赖性的 方式调控下游基因的表达，包括 c f o s、N K 一 1、强啡肽和 B D N F 等。在大 鼠 C C I 的神经病理性疼痛模型 中，鞘内注射 E R K抑制剂 U 0 1 2 6或 E R K反义寡核苷酸可减弱机械性的 超敏和痛觉过敏，这说明 E R K信号通路与 C C I 诱导的神经 病理性疼痛有关 。因此，蛋 白水解酶一 P A R-2 一 E R K C E RB 信号转导通路可能是胰腺癌引起长期疼痛的可能机制。总之，本研究通过对胰腺肿瘤疼痛患者胰蛋白酶水平 进行测定，发现在胰腺癌组织中胰蛋白酶及其 m R N A的水 平增高，可激活 P A R-2，可能通过 P K C、E R K等通路，介导疼 痛的发生。参考文献：1 王丽 杨攻焕 李辉，等 1 9 9 1 _ 2 O O O年 中国胰 腺癌 病 死率的 变迁 J 中华内科 杂志，2 0 0 5，4 4：5 0 95 1 3 2 H o o g e r w e r f WA，S h e n o y MWi n s t o n J H e t a 1 T r y p s i n m e d i a t e s n o c i e e p t i o n v i a t h e p r o t e i n a s e a c t i v a t e d r e c e p t o r 2：a p o t e n t i a l l y n o v e l r o l e i n p a n c rea t i c p a i n J G a s t r o e n t e r o l o g y，2 0 0 4 1 2 7 8 8 3 8 91 3 王成锋 赵 平重 胰腺癌 的预 防和早期诊断 J 国际 外科 学 杂志 2 0 0 7，3 4(9)：5 8 45 8 7 4 K a y s s i A A ma d e s i S，B a u t i s t a F，e t a 1 M e c h a n i s ms o f p rete a s e a c t i v a t e d rec e p t o r 2-e v o k e d h y p e r e x c i t a bi l i t y o f n o c i c e p t i v e n e u I o n s i n n e r v a t i n g t h e mo u s e c o l o n f J P h y s i o 1 2 0 0 7 5 8 0：9 7 7 9 91 5 窦勇鹰，谢立群 李俊 美 等 蛋白酶激活受体 的研究进展 J 世界 华人 消化杂志 2 0 0 6，1 4(1 2)：l 2 0 6一l 2 0 9 6 E t h i e r C，L a b e l l e Y，P o i r i e r G G P A R P。1 i n d u c e d c e l l d e a t h t h r o u g h i n h i b i t i o n o f t h e MEKERK p a t h wa y i n MNNG tr e a t e d H e L a c e l l s J A p o p t o s i s 2 0 0 7 1 2(1 1)：2 0 3 72 0 4 9 7 J R i t c h i e E S a k a MM a c k e n z i e C e t a 1 C y t o k i n e u p r e g u l a t i o n o f p re te i n a s e-a c t i v a t e d-。rec e pt o r s 2 a n d 4 e x p r e s s i o n me d i a t e d b y p 3 8 MAP k i n a s e a n d i nh i b i t o r y k a pp a B k i n a s e b e t a i n h u ma n e n d o t h e l i a l c e l l s J B 1 J P h a r m a c o 1 2 0 0 7，1 5 0(8)：1 0 4 4 1 0 5 4 f 8 Y a s u h i k o KT a t s u r o KZ h i Y e Z 1 o n o t rep i c a n d m e t a b o tr o p i e r e c e p t o r s p r o t e i n k i n a s e A，p r o t e i n k i n a s e C，a n d S r e c o n t r i b u t e t o C fib e r i n d u c e d ERK a c t i v a t i o n a n d c AMP r e s p o n s e e l e me n t b i n d i n g p r o t e i n ph o s p h o r y l a t i o n i n d o r s a l h o m n e u r o n s，l e a d i n g t o c e n t r a l s e n s i t i za t i o n J J N e u r o s c i 2 0 0 4 2 4：8 3 1 08 3 2 1 9 S o n g XS C a o儿 Xu Y B e t a 1 A c t i v a t i o n o f E R K C R E B p a t h w a y i n s p i n a l c o r d c o n t ri b u t e s t o c h r o n i c c o n s t r i c t i v e i n j u r y i n d u c e d n e u rep a t h i e p a i n i n r a t s J Ac t a P h a r m a c o l S i n，2 0 0 5，2 6 7 8 9 7 9 8 大面积烧伤病人应用鼻饲营养治疗的 体会 翁旭 豪，杨 学荣(解放 军第 1 1 3医院 烧 伤整 形科，浙 江 宁波 3 1 5 0 4 0)关键词：烧伤；肠 内营养 中 图分类号：R 6 4 4 R 4 5 9 3 静脉营养应用于烧伤病人一直受到重视，但随着“肠道 是外科应激中心器官以及肠源性感染”的观点的提出，肠道 营养，尤其是早期肠道营养又引起重视。1 9 9 8年我院采用 鼻饲营 斥治疗大面积烧伤病人 8 0例，现将我们的体会介绍 如下。1 临床 资料 1 1 一般资料 本组烧伤病人共 8 0例，男 6 6例，女 1 4 例，年龄 1 85 2岁，烧 伤总面积 5 4 9 0。1 2 方法鼻饲营养管为直径 0 2 c m硅胶管，以动脉插 管金属导丝引导将营养管置于胃内，再取出导丝，固定鼻饲 管。营养制剂为瑞素(每 1 0 0 m l含蛋白质 3 8 g，脂肪 3 4 g，碳水化合物 1 3 8 g，糖 0 5 g，及 多种矿物质，渗透压 2 5 0 mo s m L，能量 4 2 0 10)。应用 输 液泵 控 制滴 速。大 面积 烧 伤病人，因烧伤后胃肠蠕动减慢，甚至麻痹，一般第 1个 2 4 h 灌 注量不超 过 5 0 0 m l，第 2个 2 4 h灌注量控 制在 1 0 0 0 m l 以内，第3个2 4 h后因肠蠕动恢复，可增加到每2 4 h2 0 0 0m l 左 右，灌 注时观察 胃肠 道 反应，如 出现上 腹部饱 胀 不适，可 减 慢滴速或暂停灌注。整个肠内营养治疗过程中，所有病人 均静脉应用脂肪乳剂、氨基酸、白蛋白等。1 3 结果5例产生胃潴 留，停用 1 d，作止吐等对症处 理，2例自行恢复，3例停用 1 2 d后，再逐步恢复应用；有 1 0例产生腹泻，大便次数明显增多，经用复方苯乙哌啶口 服后恢复；最长置鼻饲管时间达 2月，未发生任何并发症。肠外营养制剂用量明显减少。2 体 会(下接 5 0 8页)维普资讯 http:/