生物素标记蛋白操作方法.doc

抗体生物素标记操作方法
一般每个抗体可以标记3-5个生物素，标记时，生物素与抗体的比率受抗体浓度影响，对于10 mg/ml 的抗体溶液来说，生物素应超过蛋白12倍（摩尔数），对于2 mg/ml 的抗体溶液应超过20倍，生物素也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。
蛋白样品不得含有叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物。
一、试剂和器材：
1、 标记反应溶液：0.1M pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）
NaCl 8.77 g ；Na2HPO4·12H2O 32.3g ；NaH2PO4·2H2O 4.5g；加双蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 调pH至 7.2，最后定容为 1000mL
2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：称取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量为587） ，溶解于95 µl 超纯水中，临用前配置，不可储存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，开瓶前平衡至室温。也可以配置200 nmol/L 储备液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃稳定几个月。
由于NHS-PEG4-Biotin昂贵，而且使用量少，不能保存，配制时，直接将NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以实际称量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入超纯水。
3、超滤管
⑴、Millipore超滤管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，残留体积200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心10min。
⑵、Millipore超滤管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，残留体积80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允许的最大离心力14000×g）离心5 min。
⑶、Amicon Ultra -0.5ml离心超滤管（Millipore），效果更好，典型的最终浓缩物体积：5-15ul。
二、抗体超滤处理
标记前需要应用截留分子量为50kDa 的超滤柱对抗体进行标记前纯化处理(如果不是抗体，一定要按蛋白分子量来确定超滤柱截留分子量)，以除去蛋白样品中可能含有的叠氮钠、BSA、甘氨酸、Tris或其他任何有自由氨基的添加物，防止干扰标记反应。
具体操作步骤：
1、 于超滤柱中加入200μl 标记反应溶液，加入500ug 单克隆抗体，混匀。
2、 4℃，6000rpm，离心2min。弃滤液。
3、于超滤柱中加入100μl 标记反应溶液，混匀。4℃，Max 14000×g，2min。
4、 重复步骤2 6到7次。
5、 混匀超滤柱中的残留的液体，室温静置1min。
6、 将超滤柱反转倒置于一新的超滤管中，4℃，1000×g，2min，收集滤液。
7、 取50μl PBS于超滤柱中混匀，静置1min。
8、 倒置超滤柱，4℃，6000rpm，2min。收集滤液，与步骤6的滤液合并，4℃放置备用。用标记反应溶液调节抗体浓度到2mg/ml （0.25ml）。
三、生物素标记抗体
1、 计算抗体标记需要生物素用量。
抗体浓度 2 mg/ml时的简要计算：
1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of 10mM NHS-PEG4-Biotin
具体计算方式见附录一（标记生物素计算）
2、 超滤后的滤液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室温反应1h。
3、 葡聚糖凝胶分离纯化(去除游离生物素)：
四、葡聚糖凝胶分离纯化标记抗体操作步骤：
（一）、试剂：
1、纯化柱处理液 :100 mmol/L Na0H;
2、纯化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH7.4)，每升含0.5g NaN3 ，8g NaCl;
3、样品洗脱液:同纯化柱平衡液;
4、标记抗体保护液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。

（二）、凝胶过滤：
方法见“凝胶过滤法纯化微量标记蛋白”
五、标记抗体的长期保存方法
将“标记抗体保护液50×）”加入到标记抗体溶液中，使BSA终浓度为0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。

六、数据记录：
抗体浓度： mg/ml 加入抗体体积： µl
标记前抗体体积： µl 加入NHS-PEG4-Biotin体积： µl
纯化柱规格： cm × cm 凝胶体积： ml
加入标记抗体体积： µl
所有洗脱溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白检测仪显示出峰后，改为0.5ml/管收集，并记录数据：
管号
1
2
3
4
洗脱液体积

A280

管号
5
6
7
8
洗脱液体积

A280

管号
9
10
11
12
洗脱液体积

A280

附录：
一、 标记生物素计算：
1、不同抗体浓度时，抗体与Sulfo-NHS-Biotin的比率：
Sulfo-NHS-Biotin MW：589

Sulfo-NHS-Biotin：抗体
抗体浓度10-12mg/ml时
12
抗体浓度4-7mg/ml时
16
抗体浓度1-3 mg/ml时
20
抗体浓度0.5mg/ml时
50

2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：
Sulfo-NHS-Biotin （mg)
PBS（µl)
Sulfo-NHS-Biotin （mg/µl)
0.56
95.1
0.00589

3、标记生物素计算加入体积计算：

计算公式
抗体浓度
2 mg/ml时*
抗体浓度（ mg/ml）

4.5
抗体加入量（ml)

0.11
抗体加入量（mg)
抗体浓度×抗体加入量
0.495
抗体的毫摩尔数（其他蛋白注意分子量）
抗体加入量/1500000
0.0000033
需要的活化Biotin量（mmol）
抗体的毫摩尔数×20
0.000066
活化Biotin量（mg）
Sulfo-NHS-Biotin量
（毫摩尔）×589
0.038874
需要10mmol/L 活化Biotin体积（µl）
活化Biotin量（mg）
/活化Biotin浓度（mg/µl)
6.6