1、实验四 碱性蛋白酶活力的测定
一、实验原理
以酪蛋白为底物测定碱性蛋白酶的活力。酪蛋白经蛋白酶作用后，会降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽就沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中。溶解于三氯醋酸溶液中的肽的数量正比于酶的数量和反应时间。因而采用Folin法测定上清液中肽的含量就可以计算酶的活力。
二、试剂和仪器
试剂：0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）、5%三氯醋酸、1%酪蛋白溶液（称取5g酪蛋白置于500mL 0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）中，加热使其溶解）、0.4mol/L
2、碳酸钠溶液、100μg/mL酪氨酸溶液、Folin试剂，稀释3倍使用
仪器：水浴锅、721分光光度计（含比色皿）、秒表、常规玻璃仪器
三、实验步骤
1、酶液的萃取
称取1g粗酶制剂置于研钵中，加少量缓冲液一起研磨，然后定容至100mL，从容量瓶中取出5mL酶液（视酶活而定）再定容至100mL，稀释后的酶液经滤纸过滤后得到澄清的酶液。
2、酶活力的测定
样品管：取不同量的酶液（0.1~1.0mL：0.2mL、0.4mL、0.6mL），用0.1mol/L碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液（pH10）（对应为0.8mL、0.6mL、0.4mL）补足体积到1.0mL，然后在每个样品管中再加入1mL预先
3、在40℃保温的1%酪蛋白溶液，混匀，在40℃准确保温10min，加入2mL 5%三氯醋酸溶液，迅速摇匀，于室温静置半小时。
空白管：先在每支试管中各加入1.0mL 1%酪蛋白溶液和2.0mL 5%三氯醋酸溶液，摇匀后，再加入1.0mL的酶液，酶液浓度分别与对应的样品管相同，在40℃下准确保温10min，以下操作同样品管。
将酶反应混合物过滤后收集滤液，在1mL滤液中加5mL 0.4mol/L碳酸钠溶液和1mL Folin试剂，摇匀后在40℃恒温水浴中显色20 min，以相应的空白管中的反应液为对照，在680nm下测定样品管中反应液的吸光度。
3、标准曲线
为了确定酪氨酸与OD值的对应关
4、系，需事先用不同浓度标准酪氨酸溶液与Folin试剂反应显色，测定OD值标准曲线。
（1） 不同浓度的标准酪氨酸溶液按下表配置：
管号
酪氨酸的浓度
（微g/mL）
100微g/mL
酪氨酸溶液（mL数）
蒸馏水
（mL数）
空白
0
0
1
1
10
0.1
0.9
2
20
0.2
0.8
3
30
0.3
0.7
4
40
0.4
0.6
5
50
0.5
0.5
6
60
0.6
0.4
（2） 向上表配制的不同浓度的酪氨酸溶液中分别加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL，Folin试剂1mL，置于40℃恒温水浴显色
5、20min，在680nm下以空白为对照，测定各样品管溶液的吸光度。
（3）以吸光度（OD）为纵坐标，酪氨酸浓度为横坐标，绘制标准曲线，由直线斜率计算K值。
四、数据记录与处理
1、根据标准曲线计算K值
酪氨酸浓度/[µg/mL]
0
10
20
30
40
50
60
吸光度
0.000
0.078
0.177
0.286
0.361
0.403
0.533
用Excel拟合得，K=114.7（OD值为1时相当的微克数）。
2、 酶活力计算
酶液加
入量/mL
相当于粗
酶制剂/克
空白管
OD值
样品管
OD值
净OD值
酶活
6、力/[*104单
位数/克酶制剂]
平均酶活力/[*104单位数/克酶制剂]
0.2
0.0001
0.000
0.361
0.361
16.56
13.48
0.4
0.0002
0.000
0.569
0.569
13.05
0.6
0.0003
0.000
0.709
0.709
10.84
酶活力的计算：
酶活力（单位数/克酶制剂）=4/10×K×OD×n
式中：4——反应混合物总体积为4mL；
10——酶反应时间为10min；
K——标准曲线中OD值为1时相当的酪氨酸微克数，结果为114.7；
n——酶液的稀释倍数
五、 讨论
1、 酶反应的温度、pH和时间对被水解的肽键数量有直接的影响，因此必须严格控制。
2、 用三氯醋酸终止反应后，过滤反应混合物所得的滤液必须是澄清的。
3、 因为Folin试剂对酸性环境比较敏感，容易发生变化，因此在测定时有顺序的规定，需要先加入碳酸钠溶液形成一个碱性环境，之后再加入Folin试剂，使其能正常发挥作用。
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