酸解离温敏性水凝胶药物载体在肿瘤治疗中的应用.pdf

癌症治疗一直是临床需要攻克的重大难题之一.化疗是癌症治疗的主要手段,目前临床上的化疗药物有阿霉素、索拉菲尼和道诺霉素等.然而,实体肿瘤的多药耐药(m u l t i d r u gr e s i s t a n c e,MD R)会影响化疗效果,MD R可在药物治疗中产生,也可由肿瘤内源性微环境(如酸性、缺氧和谷胱甘肽S转移酶的上调)诱导 .同时,化疗药物本身的缺点也会影响化疗效果,如肿瘤选择性差、靶向性差以及对正常组织和器官有毒副作用等.因此在化疗过程中需要改变药物的给药方式,在提高疗效的同时降低毒副作用.水凝胶基本上是一种含有大量水的三维交联网状聚合物材料,其具有良好的生物相容性,已广泛应用于生物医学领域,如药物传递、细胞治疗与组织工程 等.将化疗药物包载在水凝胶内,然后植入肿瘤部位,既可以延长药物的作用时间从而提高疗效,又可以减少药物对正常组织和器官的毒副作用,是一种良好的肿瘤治疗方式.原位成型水凝胶具有可注射性,在治疗过程中可减小创面,与预成型水凝胶相比,是一种具有潜在应用价值的药物负载材料.原位成胶通常采用化学和物理交联种方式.化学交联水凝胶的凝胶化过程需要将单独存储的有机交联剂加入到基质中,并且在一些情况下需要外部条件(如紫外光照射等)来启动.物理交联水凝胶是通过配位作用、链缠结和氢键等物理作用来构建的,相比之下,物理交联水凝胶避免了有机交联剂的加入,具有更好的生物相容性,在实际应用中更加方便.虽然稳定的内部三维网络结构可以赋予水凝胶良好的载药能力,但也会阻碍药物的按需释放,因此研制一种具有稳定持久释放功能的原位成胶的水凝胶载体具有非常重要的意义.本研究通过可逆加成断裂链转移(r e v e r s i b l ea d d i t i o n f r a g m e n t a t i o nc h a i nt r a n s f e r,R A F T)聚合制备了A B A型酸解离温敏性嵌段聚合物水凝胶聚(N 异丙基丙烯酰胺 )原酸酯聚乙二醇 原酸酯聚(N 异丙基丙烯酰胺 ),命名为P O P,其中:A嵌段为聚N 异丙基丙烯酰胺,提供聚合物的疏水性和 温敏性 ;B嵌段为聚乙 二醇(p o l y e t h y l e n eg l y c o l,P E G),提供聚合物的亲水性以及生物相容性;原酸酯键位于亲、疏水嵌段之间,在酸 性 环 境 中,原 酸 酯 键 不 稳 定 而 发 生 断裂 .P O P水 凝 胶 可 作 为 化 疗 药 物 阿 霉 素(D o x)的载体,载药P O P溶液通过注射器注入肿瘤部位后快速地原位转化为水凝胶固体植入物,从而实现精准的药物靶向递送.同时,由于肿瘤部位p H值为 左右,水凝胶聚合物中的原酸酯键断裂,凝胶网络会逐渐崩塌降解,从而实现D o x的稳定持久释放,延长D o x的作用时间并提高其生物利用度.因此,P O P水凝胶有望提高肿瘤治疗的成功率,为临床上提高化疗药物的疗效提供了一种有效的手段.实验部分 主要试剂与仪器 氨基,丙二醇、三氟乙酸乙酯、对甲苯磺酸吡啶鎓(p t o l u e n es u l f o n i ca c i d,P T S A)、原甲酸三甲酯、聚乙二醇(P E G )、氰基 (苯基硫代硫代硫代)戊酸N 琥珀酰亚胺酯(C y a n o (p h e n y l c a r b o n o t h i o y l t h i o)p e n t a n o i ca c i dN s u c c i n i m i d y l e s t e r,C T A NH S)、三乙胺、偶氮二异丁腈(a z o d i i s o b u t y r o n i t r i l e,A I B N)、N 异丙基丙烯酰胺(N i s o p r o p y l a c r y l a m i d e,N I P AM)、二 氯 甲烷(d i c h l o r o m e t h a n e,D CM)、四 氢 呋 喃(t e t r a h y d r o f u r a n,TH F)、乙 酸 乙 酯(e t h y la c e t a t e,E A)、,二氧六环、甲苯、N,N 二甲基甲酰胺,以上试剂均购于阿拉丁试剂(上海)有限公司.除N I P AM和A I B N在使用前需重结晶纯化外,其他所有试剂均直接使用.安捷 伦VNMR S 型 核 磁 共 振 氢 谱 仪(p r o t o nn u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e,H NMR)(苏州纽迈分析仪器股份有限公司);蔡司S u p r a 扫 描 电 子 显 微 镜(s c a n n i n ge l e c t r o n m i c r o s c o p e,S EM)(北京普瑞赛司仪器有限公司);A g i l e n tP L G P C 凝 胶 渗 透 色 谱 仪(g e lp e r m e a t i o nc h r o m a t o g r a p h y,G P C)(上 海 禹 重 实 业 有限公司).实验过程 P O P聚合物的合成P O P的合成过程如图所示,图中,聚合度x .)丙二醇三 氟乙 酸 乙 酯(q)的 合 成.将g 氨基,丙二醇用 m LD CM溶解,逐滴加入 g三氟乙酸乙酯,室温下搅拌反应 h.反应完毕后,旋蒸除去D CM,剩余物用 m LE A复 溶,然 后 分 别 用 质 量 浓 度 为k g/L的N a HP O水溶液和饱和N a C l水溶液萃取次,收集上层有机溶液并用无水硫酸镁干燥,浓缩后得到合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷淡黄色油状液体产物丙二醇三氟乙酸乙酯(q).)原酸酯三氟乙酸乙酯(q)的合成.将gq、m gP T S A、g原甲酸三甲酯溶解于 m LD CM中,室温下搅拌反应 h.反应完毕后,旋蒸除去D CM,剩余物用 m LE A复溶,然后用质量浓度为 k g/LN a C l水溶液萃取次并用无水硫酸镁干燥,浓缩后得到白色油状液体产物原酸酯三氟乙酸乙酯(q).图P O P聚合物的合成路线)原酸酯聚乙二醇原酸酯(q)的合成.将gq、g聚乙二醇(P E G )、m gP T S A溶 解 于 m L甲 苯,下 搅 拌 反 应 h.反应完毕后,旋蒸除去甲苯,m LTH F复溶,然后逐滴加入 m L质量浓度为k g/L的N a OH水溶液.室温搅拌反应 h后,旋蒸除去TH F,剩余物用D CM萃取次,然后用无水碳酸钾干燥.经正己烷中沉降和真空干燥后得 到 白 色 固 体 粉 末 原 酸 酯聚 乙 二 醇原酸酯(q).)双硫酯聚乙二醇双硫酯(q)的合成.将gq、gC T A NH S和 g三乙胺溶解在N,N 二甲基甲酰胺中,常温下避光反应 h后在正己烷中沉降,然后真空干燥,得到红色固体粉末双硫酯聚乙二醇双硫酯(q).)嵌段聚合物聚P O P的合成.P O P聚合物是通过R A F T聚合反应得到的,反应过程如下:将 gq、gN I P AM、m gA I B N溶解于 m L的,二氧六环中,在个冷冻真空解冻循环脱氧后,搅拌反应 h.反应结束后,在正己烷中沉降,然后真空干燥得到白色线性聚合物粉末P O P.水凝胶的制备将 gP O P聚合物加入到m L的p H 磷酸盐缓冲液(p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n,P B S)中,然后放置在 冰箱中静置溶解,直至聚合物彻底溶于P B S(聚合物与P B S的质量比为),再将溶液置于 环境中,即可获得酸解离温敏性嵌段聚合物水凝胶.材料表征材 料 的H NMR结 果 由A g i l e n t VN MR S 光谱仪记录,使用氘代DM S O作为溶剂;Z e i s sS u p r a 型S EM用于研究水凝胶的微观结构;聚合物的数均分子量和多分散性采用A g i l e n tP L G P C 型G P C测量;储能G、损耗模量G和黏度在配备 mm平行板配置的A n t o nP a a rMC R 流变仪上进行.水凝胶温敏性和酸解离性室温下,取 L配置好的P O P溶 液于m L玻璃瓶中,然后将其置于 恒温培养箱,使其成胶.m i n后,向内滴加滴微酸性去离子水(p H),在预定时间内(、h)取出拍照,并使用S EM记录水凝胶的微观特征.载药水凝胶的体外药物释放研究精密称取适量的D o x溶于P B S(p H)中,使用岛津UV 光谱仪记录D o x的紫外可见光谱,在最佳波长(n m)下读取吸光度值并制作D o x的标准曲线.水凝胶的药物释放是在不同p H值下进行的,过程如下:精密称取适量第期杨怀,等:酸解离温敏性水凝胶药物载体在肿瘤治疗中的应用的D o x,配 置 成D o x质 量 浓 度 为 m g/m L的P O P溶液.取 LP O P溶液封于透析袋并将其浸入载有 m L不同p H值(p H、)的释放介质(P B S)中,然后放入 恒温振荡培养箱(转速为 r/m i n)中;在预定的时间(、h)取出m L释放介质,并随即添加相同体积的新鲜介质,使用紫外可见光谱仪记录在波长 n m处各时间点D o x的吸光度值,再根据D o x的标准曲线计算各时间点对应的质量浓度.每组实验重复次.D o x的累积释放率(Q)的计算公式为:Q(rr)/()其中:r为该时间点测量的质量浓度;r为上一个时间点测量的质量浓度.水凝胶安全性将 m LP O P溶液经皮下注射到小鼠的背部,第 天处死小鼠,通过组织学分析来评估水凝胶对 主 要 器 官(心、肝、脾、肺、肾)的 潜在毒性.所有动物研究均按照实验方案进行,所有相关实验均经安徽医科大学动物护理和使用机构委员会(I A C U C)批准(L L S C ).载药水凝胶对肿瘤的抑制为了 建 立 小 鼠 背 部 肿 瘤 模 型,将 H e p G 细胞经皮下注射到小鼠背部,喂食周后,肿瘤体积约为 mm.实验分为组(n),分别为P O P水凝胶、D o x溶液、P O P D o x复合水凝胶.其中D o x的质量浓度为m g/m L.将水凝胶经皮下注射到肿瘤部位,纯D o x溶液经尾静脉注射到小鼠体内.第天处死小鼠取出肿瘤,通过苏木精伊红染色法(h e m a t o x y l i n e o s i ns t a i n i n g,H&E)来评估药物对肿瘤的抑制程度.统计学分析使用O r i g i nP r o 软件分析平均值和标准差.结果与讨论 P O P聚合物的结构分析q 和q 的合成可参考文献 .P O P聚合物合成中各步反应产物的H NMR谱图如图所示.从图 a可以看出,化学位移在 处为原酸酯基团的特征峰,化学位移在 处出现的峰是q 中P E G段亚甲基的特征峰.图P O P聚合物合成中各步反应产物的H NMR谱图从图 b可以看出,将R A F T聚合的链转移基团双硫酯键引入到q 中,化学位移在 处是C T A NH S中苯环的特征峰.从图 c可以 看出,化学位 移 在 、处均是P N I P AM的质子信号峰,表明成功将N I P AM聚合到分子链中,从而合成目标产物P O P聚合物.同时结合G P C数据(Mn ,聚合物分散性指数(p o l y m e rd i s p e r s i t yi n d e x,P D I)为 ,从而确定了P O P聚合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷合物的结构式为(聚(N 异丙基丙烯酰胺 )原酸酯聚 乙 二 醇 原 酸 酯聚(N 异 丙 基 丙 烯 酰胺 ).P O P水凝胶温敏性行为分析N 异丙基丙烯酰胺(N I P AM)具有温敏性,当温度升高时,P O P聚合物分子中的P N I P AM链逐渐转变为疏水性物质.同时,P E G链作为亲水性物质,聚合物链在水溶液中形成胶束聚集体,进而形成水凝胶.通过对水凝胶流变学性质的测定,探讨了水凝胶的温敏性.温敏性结果如图、图所示.图热成胶形貌从图 a可以看出,当温度从 升高到 ,P O P溶液从溶液变成凝胶,微观形貌为典型的孔道结构(图 b).从图 a可以看出,前G 大于G,后G 大于G,表明P O P水凝胶的最低成胶温度约为,低于人体体温().从图 b可以看出,剪切速率越大,P O P溶液的黏度 越 小,表 明P O P水 凝 胶 具 有 剪 切 变 稀特性.图P O P水凝胶流变学性质以上结果表明,P O P溶液可以注射到人体内,并响 应 人 体 温 度 从 而 变 成 水 凝 胶 固 体 植入物.P O P水凝胶的酸解离行为分析水凝胶的酸解离结果如图所示,从图 a可以看出,水凝胶在 h已经发生部分解离,但凝胶结构基本保存,h基本解离完全,变成了悬浊液.从图 b可以看出,P O P水凝胶三维网络在 h仅发生部分崩塌,h完全崩塌.结果表明,在酸性环境中,由于聚合物链中的原酸酯键发生断裂,从而导致凝胶网络结构被破坏,水凝胶发生解离.图P O P水凝胶在不同时间点的酸解离结果 载药水凝胶的体外释放行为分析体外的药物释放结果如图所示,从图可以看出,在p H 的环境中水凝胶中药物的释放速度最快,h释放率为 ;其次是在p H 的环境中,h释放了 ;在p H 的环境中释放速度最慢,h的释放率为,仅 有p H 的 环 境 中 释 放 量 的/左右.结果表明,药物在水凝胶中的释放具有很强的p H值依赖性,环境的p H值越低,药物释放的速度越快,说明P O P水凝胶对D o x具有良好的稳定持久释放作用.第期杨怀,等:酸解离温敏性水凝胶药物载体在肿瘤治疗中的应用图P O P D o x水凝胶的体外药物释放曲线 P O P水凝胶的生物安全性评价器官切片的H&E染色结果如图所示.由图可知,将P O P水凝胶注射入小鼠皮 d后,小鼠的主要器官均未发现明显的病理性异常,表明P O P水凝胶具有良好的生物安全性,可用于生物应用.图小鼠主要器官的H&E染色图像 载药水凝胶对肿瘤的治疗效果分析肿瘤组织切片的H&E染色结果如图所示.图H e p G 肿瘤的体内抑制效果从图 a可以看出,经P O P D o x水凝胶处理后,肿瘤组织中出现的凋亡细胞面积最大,相比之下,D o x治疗组表现出较弱的诱导细胞凋亡的能力,而P O P水凝胶治疗组基本未发生细胞凋亡.从图 b可以看出,P O P D o x水凝胶治疗组的肿瘤凋亡面积(约 )明显大于D o x治疗组(约 )和P O P治疗组(几乎无效果).结果表明,P O P水凝胶可以响应肿瘤的微酸环境而发生解离,从而稳定持久释放药物、抑制肿瘤,是一种良好的药物载体.结论本研究合成了一种酸解离温敏性嵌段聚合物水凝胶P O P,P O P水凝胶具有良好的酸解离性和温度敏感性,可作为药物的载体,实现药物的稳定持久释放.与此同时,P O P水凝胶具有良好的生物安全性,对肿瘤的微酸环境具有良好的响应性,可以作为化疗药物载体治疗肿瘤.因此,本研究成果有望提高化疗药物的生物利用度,并为其临床广泛应用提供理论和实验依据.参考文献L IR,X I EY N a n o d r u gd e l i v e r ys y s t e m sf o rt a r g e t i n gt h ee n d o g e n o u s t u m o rm i c r o e n v i r o n m e n t a n ds i m u l t a n e o u s l yo v e r c o m i n gm u l t i d r u gr e s i s t a n c ep r o p e r t i e sJ J o u r n a lo fC o n t r o l l e dR e l e a s e,:T EW K D G l u t a t h i o n e a s s o c i a t e de n z y m e si na n t i c a n c e rd r u gr e s i s t a n c eJ C a n c e r R e s e a r c h,():F AN G,P ANJ,F ANP,e ta l T h ec l i n i c a lo b s e r v a t i o no fv e r a p a m i l i nc o m b i n a t i o nw i t hi n t e r v e n t i o n a l c h e m o t h e r a p yi na d v a n c e dg a s t r i c c a n c e rJ E u rR e vM e dP h a r m a c o l S c i,():B A GHE R IS,B A GHE RZ,HA S S AN Z A D EHS,e ta l C o n t r o l o f c e l l u l a r a d h e s i v e n e s s i nh y a l u r o n i c a c i d b a s e dh y d r o g e l t h r o u g hv a r y i n gd e g r e e so fp h e n o lm o i e t yc r o s s l i n k i n gJ J o u r n a lo fB i o m e d i c a l M a t e r i a l s R e s e a r c h P a r t A,():L I UX,S T E I G E RC,L I NS,e t a l I n g e s t i b l eh y d r o g e l d e v i c eJ N a t u r eC o mm u n i c a t i o n s,():MA D LC M,HE I L S HO RNSC,B L AU H M B i o e n g i n e e r i n gs t r a t e g i e st oa c c e l e r a t es t e mc e l lt h e r a p e u t i c sJ N a t u r e,():Z HA OX,GUOB,WUH,e t a l I n j e c t a b l e a n t i b a c t e r i a l c o n d u c t i v en a n o c o m p o s i t ec r y o g e l sw i t hr a p i ds h a p er e c o v e r yf o rn o n c o m p r e s s i b l eh e m o r r h a g ea n d w o u n dh e a l i n gJN a t u r eC o mm u n i c a t i o n s,():YANX,F AN GW W,XU EJ,e t a l T h e r m o r e s p o n s i v e i ns i t uf o r m i n gh y d r o g e lw i t hs o l g e l i r r e v e r s i b i l i t yf o re f f e c t i v em e t h i c i l l i n r e s i s t a n ts t a p h y l o c o c c u sa u r e u si n f e c t e dw o u n dh e a l i n gJ A C SN a n o,():(下转第 页)合肥工业大学学报(自然科学版)第 卷LD,e ta l T h ei m p e d a n c ec h a r a c t e r i c so fm a r se x p l o r a t i o nr o v e r l i i o nb a t t e r i e sJ JP o w e rS o u r c e s,():S UL,Z HAN GJ,HUAN GJ,e t a l P a t hd e p e n d e n c eo f l i t h i u mi o nc e l l sa g i n gu n d e rs t o r a g ec o n d i t i o n sJ JP o w e rS o u r c e s,():Z HA OS H,WU F,YAN G L X,e ta l A m e a s u r e m e n tm e t h o df o r d e t e r m i n a t i o no f d c i n t e r n a l r e s i s t a n c eo f b a t t e r i e sa n ds u p e r c a p a c i t o r sJ E l e c t r o c h e m C o mm u n,():D U B E S HT E R T,J OMEJ P u l s ep o l a r i z a t i o nf o rL i I o nb a t t e r yu n d e rc o n s t a n ts t a t eo fc h a r g e:p a r tI p u l s ed i s c h a r g e e x p e r i m e n t sJJ E l e c t r o c h e m S o c,():E E D U B E S HT E R T,J OMEJ P u l s ep o l a r i z a t i o nf o rL i I o nb a t t e r yu n d e rc o n s t a n ts t a t e o f c h a r g e:p a r tI I m o d e l i n go f i n d i v i d u a l v o l t a g e l o s s e s a n dS O Cp r e d i c t i o nJ JE l e c t r o c h e mS o c,():E E 史月丽,吴楠,沈明芳,等 C u F/M o O/C复合正极的电化学阻抗谱研究J电化学,():(责任编辑张镅)(上接第 页)GHO B R I LC,G R I N S T A F FM W T h ec h e m i s t r ya n de n g i n e e r i n go fp o l y m e r i ch y d r o g e l a d h e s i v e s f o rw o u n dc l o s u r e:at u t o r i a lJ C h e m i c a lS o c i e t y R e v i e w s,():Z HAN GK,F ANGY,HEY,e ta l E x t r a v a s c u l a rg e l a t i o ns h r i n k a g e d e r i v e d i n t e r n a l s t r e s se n a b l e st u m o rs t a r v a t i o nt h e r a p yw i t hs u p p r e s s e dm e t a s t a s i s a n d r e c u r r e n c eJ N a t u r eC o mm u n i c a t i o n s,():C AOM,WAN GY,HUX,e t a l R e v e r s i b l e t h e r m o r e s p o n s i v ep e p t i d e P N I P AMh y d r o g e l s f o rc o n t r o l l e dd r u gd e l i v e r yJ B i o m a c r o m o l e c u l e s,():彭锐,张晶晶,杜春贵,等温敏性抗菌水凝胶的制备与控释技术研究进展J化学通报,():X I EX,S UNT,XU EJ,e t a l A gn a n o p a r t i c l e s c l u s t e rw i t hp H t r i g g e r e dr e a s s e m b l yi nt a r g e t i n ga n t i m i c r o b i a la p p l i c a t i o n sJA d v a n c e d F u n c t i o n a l M a t e r i a l s,():TAN GR,J IW,WAN GC S y n t h e s i sa n dc h a r a c t e r i z a t i o no fn e wp o l y(o r t h oe s t e ra m i d i n e)c o p o l y m e r s f o rn o n v i r a lg e n ed e l i v e r yJ P o l y m e r,():GU E D E S G,WAN G S,F ON T ANA F,e t a l D u a l c r o s s l i n k e dd y n a m i ch y d r o g e l i n c o r p o r a t i n gM o w i t hp Ha n dN I Rr e s p o n s i v e n e s s f o r c h e m o p h o t o t h e r m a l t h e r a p yJ A d v a n c e dM a t e r i a l s,():(责任编辑闫杏丽)信息与动态 合肥工业大学学报(自然科学版)欢迎投稿 合肥工业大学学报(自然科学版)是以基础理论、应用科学和工程技术为主的综合性学术刊物,主要刊登机械与汽车工程、仪器科学与光电工程、材料科学与工程、电气与自动化工程、计算机与信息工程、电子科学与工程、土木与水利工程、资源与环境工程、交通工程、化学工程、生物与食品工程、医药工程、管理科学与工程、数理科学以及新兴科学技术等领域的研究论文、科研成果、学术讨论、专题综述及动态报道,将优先刊发基金资助项目的论文.本刊自 年期改为彩色印刷,欢迎高等院校师生、科研院所和企事业单位的广大科技工作者向本刊投稿,在线投稿网址:h t t p:/x b z z s h f