SMN基因诊断小儿脊髓性肌萎缩症.pdf

6 8 2。安徽医科大学学报A c t a U n i v e r s i t a t i s Me d i c i n a l i s A n h u i 2 0 0 7 D e c：4 2(6)S MN基 因诊断小儿脊髓性肌萎缩症 金岚。，尹耕心，吴德。，李小燕。，唐久来。摘要 目的 了解儿童期发 作 的进行 性脊髓性 肌萎缩(S M A)患者的运动神经元存活基因(S M N)的缺失，探讨聚 合酶链反应一 限制性片段长度多态性(P C R R F L P)方法用于 S MA疾病的诊断价值。方法应用 P C R R F L P方法对 3例 S M A可疑患儿及其父母 5例的 S MN I基因外显子 7和 8进 行了检测，并对其进行基因测序。结果3例 S M A可疑患 儿中3例均有 S MN I基因缺失，为外显子 7和 8联合缺失。其父母均无 S MN I基因缺失。基因测序支持诊断。结论 用 P C R R F L P法对高度可疑儿童型 S MA的病例进行诊断，具有较高敏感性和特异性，简便易行。主题词肌萎缩，脊髓性 遗传学；运动神经元；基因缺失 中图分 类号R 3 3 8 1；R 7 4 6 4 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 01 4 9 2(2 0 0 7)0 6 0 6 8 2 0 4 脊髓性肌萎缩(s p i n a l m u s c u l u r a t r o p h y，S MA)是 以脊髓前 角 仅运动神经元变 性为主要病变 的常 染色体 隐性 遗 传病，儿 童 型 S MA 的 基 因定 位 于 5 q 1 3 。1 9 9 5年在该 区克隆到的运 动神 经元 生存 基因(s u r v i v al m o t o r n e u r o n g e n e，S MN)被认 为是儿 2 0 0 7一l 1 一l 6接收 作者单位：安徽医科大学第一附属医院,b i d 神经康复中心，合肥 2 3 0 o 2 2 安徽省计划生育研究所，合肥2 3 0 0 1 l 作者简介：金岚，女，硕士研究生；唐久来，男，教授，硕 士 生 导 师，责 任 作 者，E ma i l：t a n 西i u l ai8 8 8 8 2】c n。c o m 童型 S MA的致病基 因。S MN基 因在 1条染 色体 上 具有 2个高度同源的拷 贝，在端粒侧称 S MN 1，是功 能基因；位于着丝粒侧称 S MN 2。S MN1基因缺失是 儿童型 S MA发病 的主要 原因。1 9 9 5年，L e f e b v r e e t 0 终于克 隆到 S MA基 因，研 究表 明 J，S MN 1第 7、8号外显子在 9 8 6 的 S MA患儿 中纯合缺失或 截断。这使得检测 S MN 1 缺失进行本病的基因诊断 成为可能。我们采用错配引物复合聚合酶链 反应一 限制性片段长度多态(P C R R F L P)技术诊 断并进行 基因测序 了 3例 S MA患儿及其父母。报道如下。1 对象和方法 1 1 研究对象儿童型 S MA可疑患者 3例及其父 母 5例，父母 5例表型正常，3例患儿临床表现及辅 助检查结果见表 1。1 2 P C R R F L P方法 1 2 1 模板 D N A制备取患儿及其父母静脉抗凝 血各 1 m l，盐析法提取 D N A，一2 0保存。1 2 2 P C R扩增 引物序列为：S MN 1外显子 7 引物：5 _ A G A C T A T C A A C T I A A T I q C T G A T C A 一 3 和错 配引物 5 一 C C T I C C T F C 1 唧G t I 一 3 。S MN 1 外显子 8引物：5 一 G T A A T A A C C A A A T G C A A T G T G A A 一 3 和 5 一 c T A c A A c A c c c T I T c A c A G 一 3 。(P C R扩 增 反应体 系 为5 0 ，内含 基 因组 D N A 5 01 0 0 n g，Cl i n i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f n o n-s y n d r o mi c o l i g o do n t i a C u i J u a n j u a n，Me i L i n g x u a n，L i Wu l i (C o l l e g e o fS t o m a t o l o g y，A n h u i Me d i c a l U n i v e r s i t y，H e f e i 2 3 0 0 3 2)Ab s t r a c t O b j e c t i v e T o e x p l o r e c l i n i c a l c h a r a c t e ri s t i c s a n d c o n d i t i o n o f c o n g e n i t al o l i g o d o n t i a Me t h o d s T h e p a t i e n t s o f n o s y n d r o mi c o l i g o d o n t i a we r e s e l e c t e d a nd e x a mi ne d wi t h o r al c a v i t y a n d s y s t e m，t he n we r e t a ke n b y p a n o r a mi c r a di o g r a ph a n d a n a l y z e d s t a t i s t i c all yRe s ul t s Th e p a t i e n t s h a d all k i n d s o f c l i ni c al ma n i f e s t a t i o nS o me o f t h e m h a d f a mi l y h i s t o r y，w h i l e o t h e r s d i d n t h a v e A t t h e s a me t i me，s o me a g e n e s i s p a t i e n t s h a d o b v i o u s a b n o r mi t y c o n f o r ma t i o n o f t h e i r t e e t hTh e c o n d i t i o n c a n b e i n h e rit e d a s a n a u t o s o me d o mi n a n t ma i n l y a n d a a n c e s t ry wi t h a n t o s o me r e c e s s i v e Co nc l us i on Th e c o n g e ni t a l t e e t h a g e n e s i s ma i l y i s a ut o s o mal d o mi na n t i n he r i t a n t d i s e a s e Th e i n h e r i t a n t a p p e a r a n c e s i n c l ud e t h e d e l e t e d t o o t h n u mb e r a n d c r o wn s ha p eCo n g e n i t al t e e t h a g e n e s i s i n flu e n c e s o r al h e a J t h a n d o c c l us i o n M e SH t o o t h l o s s l o n g e n i t a l；t oo t h l o s s g e n e t i c s；p e d i gre e 维普资讯 http:/ 安 徽医科大学学报ActaUniver sitatLMedicin alisAnhui2007 Dec；4 2(6)683+：有；一：尤；C P K为磷酸肌 酸激酶d NT Ps200Im oLL，引物25pmol L，10buffer5Ixl，Taq酶25 u。置P CR扩增仪上，94预变性5min，9515S，57oC30S，72oC30S，循环4 0个周期。最后72保温8min。123酶切酶切体系30斗l，取每例PC R产物15ul，分别加入DraI和DdeI酶6U及相应的buf fer，置37水浴消化3h15min，反应终I卜。124电泳 分析取20“l，住4 琼脂糖凝胶(已混匀适量 的溴化乙锭)中电泳2h15rain，紫外透射仪下 观察结果。，125基因测序送上海生工公司进行基L 大 J 测序。2结果5例父母在SMN l7号外显子P C R酶切产物均同时具有18 8bp和164bp片段；3例儿 童型S MA患者均缺失18 8 bp片段。住8号外显子，正常可看到18 8 bp片段，164bp片段和120bp片段；3例儿童型SMA患者均缺失18 8bp片段。见图l、2。对3家系进行SMN基因测序示：父母为TC杂合，说明无SMN l缺失，而患儿只有T，说明有SMNI缺失，考虑为儿童型SMA患者。见图3。父母子10S MA图1SMNI7号外显子PCR酶切 结 果1f-、2女、3f：均缺火r代表SNMI的188bp的条带，考虑为S MA患荇；1、2、3分别代表3个家系Marker1父1埘1f2J42女3父3母3f-图2SMN l8号外显子PC R-酶 切结果If-、2女、3于均 缺 失r代表S N MI的188bp的条带，学虑为S MA患 并120130140150CCtTjCj000TTTT、6。CTCn、“，GiG611013014 01T。，57c、k、2、1c150AAjlAGGAA图3家系S MN基因测序箭头所指 为SMNl、SMN2碱基差 异处，父 母均 为TC杂合，说 明尢S MN l缺失，子只有T，说明S MNl缺 失?维普资讯 http:/ 6 8 4 安徽医科大学学报A e t a U n i v e r s i t a t i s Me d i c i n a l i s A n h u i 2 0 0 7 D e c；4 2(6)3 讨 论 3 1 临床特点 儿童型 S MA是一种较常见常染 色体隐性遗传疾病，由脊髓前 角运动神经元变性所 致。临床主要表现为进行性、对称性肢体近端肌无 力及萎缩。下肢重于上肢，肌张力低下，腱反射减弱 或消失，但智力多不受影响，感觉正常，无面肌及眼 肌受累。血清 C P K及 A S T基本正常，肌 电图、肌活 检示神经源性损害。根据起病年龄和临床表现可将 S MA分为 4型。其 中 l 8岁前 起 病者 称作 儿 童 型 S MA，包括 I 型。I型 S MA即 We r d n i g Ho ff-ma n n病，为婴儿期最常见 的致死性遗传病。型为 中间型，常于出生后 l 8个月内起病。型 S MA为 少儿型(K a g e l b e r g We l a n d e r 病)，出生 1 8个 月后起 病，病情进展缓慢，多能存 活至青年。型 S MA为 成人型，常于 2 0岁后起病。本病诊断过去以临床表 现及肌电图、肌活检综合判断，此 3例 S MA患儿临 床分别诊断为、型。3 2 S MN缺失基因诊断 目前众多遗传学证据 已 表明 S MN是儿童型 S MA的决定基因，大多数 S MA 患者可检出 S MN 1缺失-5 。1 9 9 7年起王 阳 等 J 对我国 S MA患儿 S MN基 因进行研究，认 为 S MN 1 基 因缺失也是我国 S MA患儿的 主要致病原 因。聚 合酶 链 反 应 一单 链 构 象 多态 性(P C R S S C P)法、P C R R F L P法等均在国内 S MA基 因诊断采用较多。P C R R F L P法诊断儿童型 S MA由 v a n d e r S t e e g e e t 口 Z L 4 j 于 1 9 9 5年 首次建 立，即 S MN 基因 缺失分 析。其主要原理为：S M N 2的 8号外显子上有 D e l I酶切 位点，酶切后得 1 2 0 b p和 6 8 b p 2个条带，而 S M N1 的 8号外显 子上无 此酶切 位点，酶切后 可得 1 8 8，1 2 0和6 8 b p 3个条带，若 S MN 1基因 8号外显子缺 失，则仅见 1 2 0 b p和 6 8 b p 2个条带。7号外显子虽 然没有此酶切位点，但 S MN 2的 7号外显子可通过 设计一个 错 配 引物 构 建 一 个 D r a I酶 切 位 点 而 S MN 1上无，经 D r a I酶切后，S MN 2可得 1 6 4 b p和 2 4 b p 2个条带，S MNI 可得 1 8 8，1 64 和 2 4 b p 3个条 带。若 S MN 1基因 7号外显子缺失，则仅见 1 64 b p 条带(2 4 b p片段较短，已走出胶)。对 比 P C R S S C P 法和 P C R R F L P法，由于两者对 S MN 1基因外显子 7 和 8的缺失检测结果是一致 的，都可 以应用 于 S MA 的直接基因检测 中。前 几年 多数实 验室采用 P C R S S C P法进行检测，其实验要求高，电泳时温度变化 等可通过影响单链 D N A的折叠而易造成假 阳性或 假阴性结果，使其在临床实验室应用受到限制。P C R R F L P法 较 P C R-S S C P法 简便、省 时，而 P C R S S C P法可以筛选 出被扩增片段 的微小点突变，故两 者可相互补充和互相验证。3 3 S MN缺失分析与临床分型有学者认为：S MN 1基因缺失有 2种形式，其一是完全缺失，此时 病情程度重，S MN 2基因拷贝数无相应增加；其二是 S MN 1基因转化为 S MN 2，此时随着 S MN1基因的缺 失，S MN 2基因拷贝数相应增加，由于在 S M N1缺失 的情况下 S MN 2可部分代偿 S MN1的功能，临床症 状相 对较轻。S M A病情 的严 重程 度与 S MN 2的拷 贝数有关 J。王旭 等 认为，S MN缺失检测不能 协助临床分 型。文献普遍认为 S MN进行定量分 析 以及编码神经元凋亡抑制蛋白外显子 5、6缺失分 析对确定 S MA对应临床表型有重要意义。3 4 基 因诊 断 S MA 儿 童型 和成 人 型 的 区别 1 9 9 5年 后，国 内外 均 有 人 发现 S MA1 V型 患 者有 S MN 1缺失，但众 多研究均 显示 尚缺乏 足够证据 支 持 S MAIV型与 S M N1 缺失有关 。3 5 不足之处本研究 的样本量较少，可导致结果 的偏倚，且未进行 S MN定量分 析，故不能通过检测 S MN基因缺失帮助 临床分 型。本研究还 将继续进 行，扩大样本量，并对 S M N进行定量分析。参考文献【1 L a i A H，T a n E S，L a w H Y，e t a 1 S MN1 d e l e t i o n s a mo n g s i n g a p o r e a n p a t ie n t s w i t h s p i n a l m u s c u l a r a t r o p h y J A n n A c a d Me d S i n g a p o r e 2 0 0 5，3 4(1)：7 37 2 L e f e b v r e S，B u r g l e n L，R e b o u ll e t S，e t a 1 I d e n t i fi c a t i o n a n d c h a r a c t e r i z a t i o n o f a s p i n a l mu s c u l ar a t r o p h y d e t e r mi n i n g g e n e J C e l l，1 9 9 5，8 O(1)：1 5 5 6 5 3 左启华小儿神经系统疾病 M 北京：人民卫生出版社，2 0 02：8 6 02 4 v a n d e r S t e e g e G，G r o o t s e h o h e n P M，v a n d e r V l i e s P，e t a 1 P CR b a s e d DNA t e s t t o c o n fi rm c l i n i c a l di a g n o s i s o f a u t o s o mal r e c e s s i v e s p i n a l mu s c u l a r a t r o p h y J Lan c e t，1 9 9 5(8 9 5 5)，3 4 5：9 8 56 5 L e f e b v r e S，B u r g l e n L，F r e z a l J，e t a 1 T h e r o l e o f t h e S MN g e n e i n p rox i ma l s p i n al m u s c u l ar a t r c p h y j H u m Mo l G e n e t，1 9 9 8，7 (1 0)：1 5 3 l一6 6 Wa n g X，Ma H W，B i Z，e t a 1 A s i mp l e a n d c o n v e n i e n t g e n e d i a g n o s i s m e t h o d o f s p i n a l mu u l a r a t r o p h yJ C l i n J Me d G e n e n t，1 9 9 7，1 4(6)：3 8 56 7 梁国安，周 柏林，余钟 声儿 童脊 髓性 肌 萎缩 症 的基 因诊 断 J 实用儿科临床杂志 2 0 0 5，2 0(1 0)：1 0 1 l一 2 8 陈万金，吴志英，王柠，等 脊髓性 肌萎缩症 运动神经 元生存 基因 2拷 贝数 与临床 表型的关 系 J 中华神经科杂 志，2 0 0 5，3 8(1 1)：6 7 3 6 9 F e ld k o t t e r M，S c h w a r a e r V，Wi r t h R，e t a 1 Q u a n t i t a t i v e a n aly s i s 维普资讯 http:/ 安徽 医科大学学报A c t a U n i v e r s i t a t i s Me d i c i n a l i s A n h u i 2 0 0 7 D e c；4 2(6)6 8 5 硝酸甘油、尼卡地平控制性降压 对颅脑手术患者脑氧代谢的影响 郑建武，张健，侯炯 摘要 目的观察硝酸甘油和尼卡地平在颅脑手术控制性 降压应用时对脑氧代谢的影响。方法2 4例颅脑肿瘤手术 患者，随机均分为两组，I 组为硝酸甘油组，组为尼卡地平 组。降压幅度与诱导前基础血压相 比较，控制在 MA P下降 2 5 3 0，维持6 0 m i n。分别于降压前、中、后同步行桡动 脉和颈内静脉球部血气分析，计算 D a-j O：和C E O：等。结果 两组降压效果差异无显著性(P 0 0 5)，降压期间心率均 增快，高于降压前(P 0 0 5)；降压期间S j O：I I 组比 I 组升高更显著(P 0 0 5，P 0 0 1)，而 D j O：、C E O I I 组低于 I组，差异有显著性(P0 0 5)。2 0 0 7一l l l 5接收 作者单位：安徽 医科大学第一附属医院麻醉科，合肥2 3 0 0 2 2 解放 军第 5 3 2医院麻醉科，黄山2 4 5 0 4 1 第 二军 医大学 长海 医院麻醉科，上海2 0 0 4 3 3 作者简介：郑建武，男，硕士研究生，主治医师；张健，男，主任 医师，教授，硕 士 生导 师，责 任作 者，E ma i l：z h a n g j i a n 5 2 5 h o t m a i l c o rn 结论颅脑手术中尼卡地平控制性降压降低脑氧代谢的作 用要优于硝酸甘油。主题词 硝酸甘油 治疗作用；尼卡地平 治疗作用；降压，控 制性；脑 代谢 中图分类号R 9 7 2 4：R 3 3 8 2 文献标识码 A 文章编号 1 0 0 01 4 9 2(2 0 0 7)0 6 0 6 8 5 0 4 控制性降压技 术在颅脑手术 中应用广泛，在减 少术中出血的同时可使颅内压下 降，利于手术操作 和术后恢 复。本研究旨在对两种不同降压药物硝酸 甘油和尼卡地平在颅脑手术控制性降压中应用时循 环的变化和对脑氧代谢的影响进行临床评价。1 材料与方法 1 1 病例资 料 择期 颅脑 肿瘤手 术患 者 2 4例，A S A I级，男 1 4例，女 1 0例，年龄 2 0 6 0岁，体重 4 3 6 2 k g，HC t 3 5 ，Hb1 1 0 g L。其中脑 o f S MNI a n d S MN2 b a s e d o n r e a l t i me l i g h t c y c l e r PC R：f a s t a n d h i g h l y r e l i a b l e c a r r i e r t e s t i n g a n d p r e di c t i o n o f s e v e r i t y o f s pi n a l mu$c l l l a l a t r o p h y J A m J H u m G e n e t，2 0 0 2，7 0(2)：3 5 8 6 8 1 O 王旭，邹 丽萍，方方，等 运 动神经元存 活基因与儿童 期脊 肌萎缩症临床特征研究 J 临床儿科杂志，2 0 0 5，2 3(5)：2 7 5 9 1 1 卢丽萍，麻宏伟脊髓性 肌萎缩 临床分型的分子遗传学研究进 展 J 国外医学 遗传学分册，2 0 0 4，2 7(4)：2 1 6 4 2 f l 2 丁华新，杨晓苏，肖 波，等脊髓性 肌萎缩症 S MN基 因拷 贝 数定量分析 J 中华医学遗传学杂志 2 0 0 4，2 1(2)：1 5 35 S M N g e n e d i a g n o s i s o f s p i n a l m u s c u l a r a t r o p h y i n c h i l d r e n J i n L a n，Yi n G e n g x i n，Wu De，e t a l (C e n t e r o fN e u r o l o g y a n d R e h a b i l i t a t i o n f o r C h i l d r e n，T h e F i r s t A f fi l i a t e d H o s p i t a l of A n h u i Me d i c a l U n i v e r s i t y，H e f e i 2 3 0 0 2 2)A b s t r a c t O b j e c t i v e T o i n v e s t i g a t t h e d e l e t i o n i n t h e s u r v i v a l m o t o r n e u r o n(S MN)g e n e w i t h c h i l d h o o d o n s e t p r o g r e s s i v e s p i n a l m u s c u l a r a t r o p h y(S MA)，e x p l o r e t h e v a l u e o f d i a g n o s i s i n S MA d i s e a s e b y u s i n g p o l y me r a s e c h a i n r e a c t i o n r e s t r i c t i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y mo r p h i s m(P C R R F L P)m e t h o d Me t h o d s S M N1 g e n e o f e x o n 7 a n d e x o n 8 i n 3 s u s p e c t e d S MA c h i l d r e n，a n d t h e i r 5 p a r e n t s we r e d e t e c t e d b y P C R RF L P me t h o d Al s o，P C R p r o d u c t s w e r e s e q u e n c e d Re s u l t s G e n e d e l e t i o n o f S MN1 w a s f 0 u n d i n 3 o f 3 s u s p e c t e d S MA c h i l d r e nd e l e t i o n i n b o t h e x o n 7 a n d e x o n 8 No d e l e t i o n o f S MN1 g e n e wa s f 0 u n d f r o m t h e i r p a r e n t s Di a g n o s i s wa s s u p p o ae d b y g e n e s e q u e n c i n g C o n c l u s i o n P C R RF L P i s mo r e s e n s i t i v e，s p e c i f i c a n d s i mp l e t o d i a g n o s e c h i l d r e n wh o a r e h i g h l y s u s p e c t e d c h i l d h o o d t y p e S MA M e SH mu s c ul a 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