动脉粥样硬化兔造模的常用方法简介.pdf

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潭来勋,李言,叶心圆,等.急性脑血管患者血尿酸水平的研究J.中国实用内科杂志,2000,20:7402741.作者简介:李海霞,现工作于中国中医科学院广安门医院(邮编:100053);胡元会、冯玲、房玉涛、杜柏、王阶,工作于中国中医科学院广安门医院。(收稿日期:2009205219)(本文编辑 王雅洁)动脉粥样硬化兔造模的常用方法简介1)符 凌,常小荣,岳增辉中图分类号:R543.5R256.2 文献标识码:A 文章编号:167221349(2009)1021203203动脉粥样硬化是一种慢性动脉疾病,可引起冠心病和脑梗死等,是严重危害人类生命健康的疾病之一,其发病率和病死率均居各种疾病前列。有关动脉粥样硬化的确切病因尚不清楚,有多个学说,如脂质浸润学说、血栓形成学说、损伤反应学说、免疫炎症学说等,从不同侧面反映了形成动脉粥样硬化的复杂因素。积极研究并建立可靠的动脉粥样硬化动物模型对于探明动脉粥样硬化的病因、发病机制及防治药物的研究与开发均具有重要的意义。兔为最早用于复制动脉粥样硬化模型的动物。其一:兔在脂蛋白代谢方面与人有一些相似之处,比如兔与人的血浆都具有胆固醇脂转运蛋白活性;载脂蛋白B的编码部位都在肝脏,载脂蛋白B 48都只存在于乳糜微粒中;脂蛋白成分都以低密度脂蛋白为主,而肝脏低密度脂蛋白受体表达都较低。因此,对血脂的清除能力低1。其二:兔对外源性胆固醇吸收率高(75%90%),在进食高脂饲料后,短时间内可形成高胆固醇血症,容易产生动脉粥样硬化斑块;而且不同的饮食结构可产生不同类型的动脉粥样硬化斑块。兔的这些特性使之成为复制动脉粥样硬化模型最广泛的动物。1 单纯高脂饲料喂养法由于兔对外源性胆固醇的高吸收率,再加上喂养法建立的兔动脉粥样硬化模型在一定时间内是稳定的(停喂高脂饲料15周内未恢复正常2),故常采用高脂饲料来建立动脉粥样硬化模型。综合一些学者的建立方法,高脂饲料的基本配伍为:胆固醇+猪油或花生油+正常饲料(有些还添加了蛋黄粉),只是这些原料的配伍比例有所不同。此外,有学者在喂养3周后去除了胆固醇。单纯高脂饲料喂养所建立的动脉粥样硬化模型多以脂质沉积为主要特征,虽然可诱发冠状动脉、脑基底动脉粥样硬化,但不能形成颈动脉粥样硬化;而且与动脉粥样硬化临床发病机制也有一定的距离(有报道指出单纯喂养法所产生的动脉粥样硬化斑块更类似黄瘤病,而不像人的动脉粥样硬化斑块3)。此外兔的抵抗力差,而此法造模周期过长(一般需要8周以上),易导致兔的继发感染死亡从而影响实验的稳定性。更有学者研究发现,高脂饮食在诱发兔动脉粥样硬化的同时,其肝脏呈现明显的脂肪性肝炎样改变,而高脂饮食诱导的肝脏炎症反应是否会促进动脉粥样硬化的发生和发展也有待进一步研究探讨4。2 内膜损伤+高脂饲料喂养内皮损伤和脂质浸润是粥样硬化病变产生的最根本机制,所以在考虑复制动脉粥样硬化动物模型时,一定要考虑这两个基本条件。内皮细胞的功能障碍是粥样硬化形成的起始阶段,人为的内膜受损则可以加快粥样硬化的形成。在这种方法中,高脂喂养造成的动物高脂血症是引起动脉粥样硬化的基础;而各种方法导致内膜损伤,加快了动脉粥样硬化的形成,从而节省了造模所需要的时间。2.1 机械损伤+高脂饲料2.1.1 空气干燥法 LeVeen等5在1982年首次报告隔离的动脉段气体干燥损伤附加高脂饲料喂养复制粥样硬化病变(所选血管是兔的股动脉)。近年来,大多学者选用兔的颈动脉建立颈动脉粥样硬化,获得了较高的成功率。具体操作方法如下。动物高脂饲料喂养一周后进行手术,术前12 h禁食,不禁水。术前肌肉注射或静脉注射药物麻醉动物,仰卧固定。颈部脱毛消毒,颈部正中纵行切口,钝性分离,暴露两侧颈总动脉,分离右侧颈总动脉,长度约12 mm25 mm,两端以动脉夹阻断血流。用头皮针针头于近心端夹闭外侧刺入管腔,再在远心端刺破颈总动脉;将抽有生理盐水的注射器连接于头皮针针头,用生理盐水灌洗血管腔,然后将医用氮气连接于头皮针针头,向夹闭1)为国家自然科学基金资助项目(No.30873308)3021中西医结合心脑血管病杂志2009年10月第7卷第10期段的颈总动脉行空气干燥术,以气流量为120 mL/min250mL/min进行干燥,时间为5 min10 min;而后以生理盐水置换出管腔内气体,松开动脉夹,恢复右侧颈总动脉的血流,压迫止血,缝合皮肤创口并包扎。术后可根据需要使用抗生素抗感染,并继续高脂饮食喂养。在此值得注意的是,在干燥术的操作中,空气干燥的气流量及干燥的时间的选用上,各个学者有所不同。徐永革等6用的气流量为120 mL/min,历时15 min;张磊等7,8用的气流量为250 mL/min,历时5 min;艾志兵等9用的气流量为120 mL/min,历时10min;沈长银等10用的气流量为150 mL/min,历时15 min;结果都形成了动脉粥样硬化病变。此外,沈长银等10还研究发现在模型中有5只发生完全闭塞,认为与氮气损伤时间较长、氮气流量较高有一定关系(会导致局部血管内皮损伤严重,导致血栓形成而引起血管闭塞)。因此,为了进一步减少血管闭塞率,应当缩短氮气损伤时间和流量,但是时间过短、流量过低则内皮损伤轻,不易形成动脉粥样硬化,故多长时间和多大流量才合适尚需进一步研究。空气干燥法+高脂饲料目前常用来建立兔颈动脉粥样硬化模型,具有成模时间短,狭窄程度重,模型较为稳定,可控性好等优点。具体如下:此法造成的损伤相对轻柔,由于干燥的气流直接风吹血管内膜,只损伤内皮细胞而不造成内弹力板和中膜的破坏;无动脉切口,无须结扎造模血管,从而不影响血流动力学变化;无血栓形成,不影响结果的观察;隔离血管段的长度可以准确掌握,干燥气体的流速可以精确控制,因而损伤程度可保持相对恒定;无需球囊导管等特殊器械,可操作性和实用性强;而且该种模型的病理变化与人的大动脉粥样硬化的病理改变相似,其内皮细胞的修复与内膜的增殖过程接近于颈动脉疾病的生理过程,适合于颈动脉粥样硬化病变的发病机制及预防、治疗方面的进一步研究。更有报道指出在此法基础上进一步尝试球囊损伤或药物诱发斑块破裂可有利于不稳定斑块破裂机制的研究11,12。2.1.2 球囊损伤法 1980年Block等报道了血管成形术后家兔动脉形态学的变化,此法成为复制动脉粥样硬化再狭窄模型的经典方法。具体操作方法如下。动物高脂饲料喂养一周后进行手术,术前12 h禁食,不禁水。一般采用经皮冠状动脉腔内成形术,暴露动物的股动脉或颈动脉,下方穿线后结扎远侧端,近侧端备用,动脉夹夹住近侧端动脉,在靠近远侧端结扎处作一切口并逆行插入球囊导管5cm25 cm;球囊内注入0.25 mL0.9 mL生理盐水,膨至(28)个大气压(1个大气压=760 mmHg);缓慢回拉导管(5 cm/s10cm/s)至动脉切口处,重复此过程3次5次,去除内皮;撤出球囊导管并结扎动脉近侧端,使动脉恢复血流,缝合切口。术后连续3 d每日肌肉注射抗生素抗感染。此方法建立动物模型的主要问题为球囊直径的大小、球囊扩张的程度及反复牵拉球囊的速度。如果球囊直径过大、扩张较大、牵拉球囊速度过快则可造成内弹力板及中膜严重损伤,内、中膜平滑肌细胞(SMC)大量增生,兔的主动脉容易破裂;而球囊内径过小、球囊扩张不够及牵拉速度较慢则不能充分损伤内膜,仅造成内皮细胞剥脱而内弹力板及中膜相对完整,球囊损伤后血管弹性回缩、血小板沉积、血栓形成、炎症反应、基质沉积、血管重塑等也明显减轻。叶柄华等13通过比较不同大小球囊对建立兔颈动脉粥样硬化模型成功率的影响而得出球囊与血管直径之比,应以略小于1.51为宜。李跃华等14经过多次实验研究后认为球囊内注入0.5 mL生理盐水,牵拉速度为10cm/s较为适合。在球囊导管损伤法复制的动脉粥样硬化再狭窄模型中具备了与人类动脉粥样硬化病变相似的、明显的平滑肌层改变,并具有渗出、增殖、坏死等动脉粥样硬化炎性反应的特征,使之不仅作为经皮冠状动脉腔内成形术后再狭窄的经典模型,而且还可成为研究动脉粥样硬化炎性反应的较为可靠的模型。目前,此法广泛应用于腹主动脉、髂动脉粥样硬化及颈动脉狭窄模型的建立。由于该法可造成较严重的内弹力板及中膜损伤,并存在一定的血管闭塞率15(与腹主动脉、髂动脉相比,颈总动脉内径相对较细,颈外动脉结扎后,颈总、颈内动脉血流显著减慢,容易造成血管闭塞),故能否用于建立颈动脉粥样硬化病变的研究尚有一定争议。蔡宝祥等16认为通过此法建立的模型具有不稳定斑块的特征,提示该模型可用于斑块破裂发生机制和筛选稳定斑块药物的研究。陈文强等17则通过此法建立的动脉粥样硬化斑块的模型基础上应用药物触发,促使斑块破裂及血栓形成,为动脉粥样硬化的研究提供适宜的研究对象。2.1.3 电刺激法 主要是应用血栓形成仪刺激兔动脉外膜,通过电热刺激影响由外膜至内膜,从而造成血管损伤。具体操作如下。动物适应性喂养一周后进行实验。一般采用经皮冠状动脉腔内成形术,剥离动脉,开启电刺激血栓形成仪,稳定电流,将刺激电极上垫一自体脂肪组织放在近心端,温度电极在远心端,两电极托住血管并尽量使血管保持原状和原位置;调整电流为1.2 mA1.5 mA,刺激10 min15 min;电损伤程度以血管壁无明显灼焦痕,管壁电灼处微变黄,局部变细,近心端水肿为度;刺激完毕后缝合肌层和皮肤,术后肌注抗生素3 d抗感染。于术后第2天开始喂养高脂饲料,至4周8周即可成功建立动脉粥样硬化模型。此法与前面介绍的球囊导管法有一定的相似之处,二者都具有定位明确、造模时间短的优点,所建立的动脉粥样硬化斑块模型是研究经皮动脉内成形术的必不可少的内容。但球囊导管进入血管不可避免地要进行动脉切开,结扎切开的血管,因而导致拉伤血管段处于血流的盲端,造成血管血运障碍和营养不良,增加了模型的不确定性,影响了药物的疗效判定和机制分析;而电刺激法建立的模型其增生的血管段血流正常,更好地接近临床实际情况。2.2 免疫法+高脂饲料 动脉粥样硬化斑块内富含各种免疫细胞,尤其是巨噬细胞和T淋巴细胞,其中T淋巴细胞在动脉硬化发展的各个阶段中发挥着同样作用,它所产生的许多细胞激动素如a狭窄因子、免疫因子等对动脉壁有损害作用。因此可以从免疫的角度来建立动脉粥样硬化动物模型。2.2.1 注射牛血清白蛋白法 此法主要是在喂养高脂饲料的同时,于兔的耳静脉注射牛血清白蛋白进行免疫刺激,从而加速动脉粥样硬化的形成。在此法中,牛血清白蛋白的注射剂量和次数有所不同。王园园等18选用牛血清白蛋白免疫剂量为25mg/kg,3 d 1次,注射3次,同时用卵清白蛋白进行皮下免疫(2.5 mg/kg,共5次,2 d 1次);注射完成后饲养4周发现兔三4021CHINESE JOURNAL OF INTEGRATIVE MEDICINE ON CARDIO2/CEREBROVASCULAR DISEASEOctober2009Vo1.7No.10酰甘油(TC)、低密度脂蛋白(LDL)明显升高,呈高胆固醇血症特征;8周后模型肉眼及光镜下均可见典型动脉粥样斑块。刘俊等19则在实验开始时一次性注射牛血清白蛋白250 mg/kg,高脂饲料喂养4周后可导致家兔产生严重的动脉粥样硬化。傅晓东等20则分别于兔去势后的1周、5周、9周静脉注射小牛血清白蛋白0.25 g/kg,至12周后成功建立了兔绝经后动脉粥样硬化模型;其研究发现该模型与中医的肾虚有密切的联系,为应用中医药防治绝经后动脉粥样硬化症提供了有益的启示。用静脉注射血清白蛋白诱发免疫性炎性损伤建立动脉粥样硬化模型的方法,具有建模时间短、成活率高、操作简便、损伤条件可控性好的优点,但所形成的单纯的免疫性炎性并不能涵盖动脉粥样硬化炎性反应过程,所引起的炎性改变特征也有待进一步观察和比较。2.2.2 感染肺炎衣原体(Cpn)法 有报道指出Cpn感染后可引起一些炎性因子分泌,介导炎症反应而导致血管损伤。王卫群等21在高脂喂养的同时,于实验的第1周、3周经鼻腔感染Cpn,12周后成功地建立了动脉粥样硬化模型。用免疫法+高脂饲料建立的动物模型为我们提供了新的思路,使我们可以从免疫学角度研究动脉粥样硬化的形成与治疗,并且在临床上可检测患者血清相应抗原的抗体滴度来确定病因。以上介绍了建立动脉粥样硬化兔模型的几种常见方法,此外还有颈总动脉套环致动脉狭窄法、辐射损伤法、转基因法及人工培育的自然缺陷免(如Watanabe遗传性高脂血症兔和STH兔)等。3 结 语动脉粥样硬化是在多种遗传及环境因素参与下发病,是由多个重要功能基因异常、血脂代谢异常及炎症免疫因子作用下的一个缓慢复杂的过程。从动脉粥样硬化的发病机制出发,建立各种动脉粥样硬化动物模型可获得成功,根据模型形成的方法和特征不同,可分别用于不同的研究目的。喂养法建立模型比较符合人类饮食的特点;机械损伤法建立模型快速并且动脉粥样硬化的部位明确;免疫学方法建立的模型可考虑开发疫苗用于预防和治疗此疾病。但由于动物与人的种属差异,这些模型在血脂水平、病变形态、药物反应等方面与人类动脉粥样硬化发生、发展过程及病变形态依然存在一定的差别。随着人们对动脉粥样硬化疾病发病机制认识的不断加深,动脉粥样硬化动物模型的建立方法也在不断改进。应在此基础上更加努力,克服存在的缺陷,摸索出更接近动脉粥样硬化本质,有较好的可靠性、代表性和重复性的动物模型。参考文献:1Fan JW.Transgenic rabbits expressing human apolipoprotein(a)J.J Atheroscler Thromb,2000,7:8213.2 李贵才,刘占军,徐德锌,等.家兔动脉粥样硬化模型稳定性的观察J.中国比较医学杂志,2004,14(5):2942297.3 赵瑾,迟路湘,诸兴明.兔颈动脉粥样硬化斑块形成过程中血管平滑肌细胞功能变化的动态观察J.微循环杂志,2007,17(3):35238.4 魏国华,刘兰,蔡晓波,等.高脂饮食所致动脉粥样硬化家兔肝组织学损伤评估J.中国动脉硬化杂志,2008,16(5):3732375.5LeVeen RF,Wolf GL,Villanueva TG.New rabbit atherosclerosismodel for 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