顺磁核磁共振技术研究蛋白质遭遇复合物的动态结构.pdf

蛋白质通过与配体蛋白相互作用行使生物学功能。根据蛋白质间互作强度及其复合体存在时间的不同，可将蛋白质间相互作用分为特异性相互作用与瞬时相互作用两种类型1-2 不同的相互作用驱动形成不同的复合物在瞬时相互作用驱动下，配体蛋白质在不同方向上与底物蛋白发生相互作用，由此形成的具有多取向、多作用界面的复合物被称为遭遇复合物（EncounterComplex）3 之后，两种蛋白质发生取向重排形成依靠静电相互作用与范德华相互作用保持稳定的特异性复合物（SpecificComplex）【4-6 .瞬时相互作用的产生伴随着遭遇复合物的形成，遭遇复合物系综结构通过在方向集合中快速交换帮助蛋白质寻找结合位点7 遭遇复合物通过增加相互作用横截面以及减少特异性复合物形成路径上的构象搜索空间来提高结合速率8-13 尽管遭遇复合物在蛋白质结合中起到重要作用，但由于遭遇复合物是由弱相互作用驱动产生14，其在溶液体系中丰度低、停留时间短，因此常规的结构生物方法，如X射线晶体衍射（X-r a y D i f f r a c t i o n b y Cr y s t a l s，X-r a y）、冷冻电镜（Cryo-ElectronMicroscopy，c r y o-EM）等，很难有效地捕获其结构信息核磁共振（NuclearMagneticResonance，NM R）技术可以通过检测蛋白质复合物中主链酰胺键的化学位移变化来解析遭遇复合物的动态结构在遭遇复合物中，蛋白质被溶剂化，酰胺键的化学环境变化小，化学位移扰动很小而在特异性复合物中，溶剂层变化剧烈，酰胺键扰动较大15-17 其中，顺磁弛豫增强（ParamagneticRelaxationEnhancement，PR E）已被证明是一种研究遭遇复合物结构的有效技术，其原理为顺磁中心的未配对电子产生的顺磁效应改变了附近原子核的共振频率及弛豫速率18 ，此外，伪接触位移（Pseudocontact Shifts，PCS）19 和残余偶极耦合（ResidualDipolarCouplings，R D C）2 0,2 1 也可用于表征遭遇复合物动态结构分子动力学（MolecularDynamics，M D）模拟能够在毫秒时间尺度内观察分子运动，并在原子水平上提供动力学运动细节，因而被广泛用于蛋白质结合的动力学及热力学信息计算2 2-2 5.由于模拟数据的不确定性，通常需要在多平行轨道上对蛋白质间相互作用进行长时间模拟2 6-31。目前，遭遇复合物结构及其动力学信息已可以通过MD模拟进行合理预测，并与实验结果进行对比.作为一种常见的磷酸信号网络系统，糖磷酸转移酶系统（SugarPhosphotransferase System，PT S）参与介导碳水化合物的摄取、磷酸化及信号传导过程（图1).PTS主要由酶I（EI)、组氨酸磷酸载体蛋白（HistidinePhosphateCarrierProtein，H Pr）和酶II（EIIA G l e）组成，通过分子间相互作用传递磷酸根32 。HPr与EIIAGlc的晶体结构及其特异性复合物结构已通过X-ray与NMR技术解析出来33-34.此后，PRE与化学交联质谱技术的发展也使得EI/EIAGlc、EI/H Pr 的相互作用及其调控机制依次得以研究1,35-37 但HPr与EIIAGlc的遭遇复合物结构及其作用机制仍不明确本文选用PTS中的EIIAGlc/HPr复合物作为研究模型，结合PRE技术与MD模拟选择性检测EIIAGlc/HPr遭遇复合物中HPr的结构信息，我们发现在EIIAGlc/HPr特异性复合物形成过程中，HPr首先在扩散作用驱动下分布在EIIAGlc周围形成三种不同取向的遭遇复合物，之后不断向特异性复合物结合界面移动，与EIIAGIc形成特异性相互作用.赵昶等：顺磁核磁共振技术研究蛋白质遭遇复合物的动态结构1491实实验部分1.1 仪器与试剂三羟甲基氨基甲烷(Tris）、异丙基-D-硫代半乳糖苷（IPTG)购自广州赛国生物科技有限公司;D-glucose、氯化钠（NaCI）、氯化镁（MgCl2）、磷酸二氢钾（KH2PO4）、十二水合磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）、葡萄糖购自国药集团化学试剂有限公司；酵母粉（Yeastextract）、胰蛋白陈（Tryptone）购自Oxoid公司；二硫苏糖醇（DTT）购自北京博奥拓达科技有限公司；N-15标记的氯化铵（N-15H4CI）购自Sigma-Aldrich；乙二150波谱学杂志第40 卷EIEIHPrPHPrEIIAGICEIAGIeEIIBGIEEIICGIEHPrEIACk/HPrcomplex图1糖磷酸转移酶系统（PTS）及EIAGle/HPr特异性相互作用示意图（PDB:1GGR）38 Fig.1 The scheme of PTS and the specific interaction of EIIAGle/HPr complex(PDB:1GGR)38EIIAGIC胺四乙酸（EDTA，c a t#P9 9 6 2 50）购自多伦多研究化学品公司；二甲基亚矾（DMSO）购自生工生物工程（上海）股份有限公司。1.2质粒构建、蛋白表达和纯化将编码HPr、EIIA G l c 的基因克隆到pET1la表达载体中，采用QuikChange39方法对HPr基因进行E5C和E66C半胱氨酸突变大肠杆菌（BL21star）细胞用于蛋白质表达，在LB和M9培养基中分别制备未标记的野生型HPr、H Pr E5C、H Pr E6 6 C蛋白和N-15同位素标记的 EIIAGlc蛋白.用阴离子交换柱和 SephacrylS100色谱柱（GEHealthcare）对这4种蛋白进行纯化纯化后的蛋白用变性胶电泳和电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪（Agilent6530）进行分子量鉴定，并在Tris缓冲液（2 0 mmol/LTris，150 mmo l/L Na Cl，p H 7.4）中保存.用EDTA-Mn2+探针连接未标记的HPrE5C、H Pr E6 6 C蛋白，以制备EDTA-Mn2+HPrE5C、ED T A-M n 2+HPrE66C：首先在DMSO体系中将EDTA与两倍浓度的氯化锰混合制备EDTA-Mn+探针；然后将制备好的探针分别与HPrE5C、H Pr E6 6 C 蛋白以4:1摩尔比例混合，室温反应4h得到EDTA-Mn2+HPrE5C、EDTA-Mn2+HPrE66C蛋白；最后使用阴离子交换柱提纯连接成功的EDTA-Mn2+HPrE5C、ED T A-M n 2+H PrE66C蛋白，采用Amicon管浓缩并置换至最终实验缓冲液（2 0 mmol/LTris，150 mmo l/L Na Cl，p H 7.4）中，此时溶液体系中的Mn2+离子已被去除.使用电喷雾-四极杆-飞行时间质谱仪（Agilent6530）进行分子量鉴定，将浓度为30 0 umol/L的N-15同位素标记的EIAGlc蛋白与等浓度的未标记野生型HPr、H Pr E5C、H PrE66C蛋白分别混合，制备野生型EIIAGlc/HPr、EIIA G l e/H Pr E5C和EIAGlc/HPrE66C复合物抗磁样品用于HSQC及PRE实验样品缓冲液体系含2 0 mmol/LTris、150 mmo l/L Na Cl、5%D 2 0，p H 7.4.将浓度为30 0 mol/L的N-15同位素标记的EIAGlc蛋白与等浓度的未标记EDTA-Mn2+HPrE5C、EDTA-Mn2+HPrE66C蛋白分别混合，制备EIAGlc/EDTA-Mn2+HPrE5C和EIIAGlc/EDTA-Mn2+HPrE66C复合物顺磁样品用于PRE实验样品缓冲液体系含2 0 mmol/LTris、150 m m o l/L Na Cl、5%D 2 0，p H 7.4.1.3NMR实验及数据处理为确定半胱氨酸的引入不会干扰EIIAGle/HPr的天然结构，对EIAGle/HPrE5C和EIAGlc/HPrE66C分第2 期别采集H-15NHSQC图谱，并与野生型EIIAGlc/HPr的谱图进行比较H-15NHSQC谱图由配备QCI超低温探头的Bruker600MHzNMR谱仪在2 98 K采集，F2维谱宽为16 ppm，Fi 维谱宽为30 ppm，采样点数t2ti=2048256，所得H-15NHSQC数据用NMRPipe（v e r s i o n 2 0 10.16 0.15.0 1）处理.基于IH-15NHSQC改进的氢核横向弛豫测定序列1hr2_hsqc_wgfb.ct，对EIIAGle/HPrE5C、EIIA G l e/H PrE66C采集抗磁PRE图谱，对EIAGlc/EDTA-Mn2+HPrE5C和EIAGlc/EDTA-Mn2+HPrE66C采集顺磁PRE图谱将同种突变的抗磁PRE结果与顺磁PRE结果进行对比获得蛋白质复合物的弛豫增强速率：PRE实验在配备QCI超低温探头的Bruker600MHzNMR谱仪上，2 9 8 K下采用两点法进行，两个时间点间的时间延迟为10 mS，所得实验数据用NMRPipe进行处理.1.4复合物建模与分子模拟以HPr结构（PDB：1PO H）为结构模型生成顺磁标记的HPr.使用Xplor-NIH401将顺磁探针EDTA-Mn2+的3种构象添加到每个作用位点（HPr的E5C和E66C）上计算分子间酰胺质子PRE理论值并平均顺磁中心和蛋白质主链之间的可旋转键的二面角是随机生成的选取6 个能量最低的HPr结构，利用ZDOCK41（3.0.2）和快速傅里叶变换（FastFourierTransform，FFT）采样各自生成36 0 0 个EIIAGlc/HPr复合物结构计算由顺磁中心构象引起的分子间酰胺质子PRE平均理论值，以其作为参照值计算获得系综结构.根据EIIAGle/HPrE5C和EIAGle/HPrE66C遭遇复合物的PRE计算结构对HPr的空间分布进行方向簇分类，每个方向簇取一个代表性结构，将探针删除并还原后得到野生型EIAGlc/HPr遭遇复合物结构对EIIAGlc/HPr遭遇复合物及EIIAGle/HPr特异性复合物结构（PDB：1G G R），在Amber14中在ff14SB力场下进行MD模拟整个模拟过程的温度为2 5，EIIAGlc/HPr复合物溶解在一个含有TIP3P水分子的周期盒中，每个方向与周期盒边界的距离至少为10 A（1A=0.1n m）模拟时间为2 0 0 ns，以10 0 ps为间隔捕捉2000顿结构每个实验对象以不同的随机数种子运行3条独立的MD轨道最后使用AMBER14中的CPPTRAJ模块计算每顿中遭遇复合物的1 2 35号残基的C均方根偏差（RootMeanSquareDeviation，RMSD）及质心间距离值.赵昶等：顺磁核磁共振技术研究蛋白质遭遇复合物的动态结构1512结果与讨论2.1 EIAGle/HPr 复合物系统中存在多种瞬时结构PRE实验通常以主链酰胺键的氢核为观察核，向蛋白质复合物体系中引入顺磁性探针以引起自旋核的弛豫速率增强由于主链酰胺键氢核的横向弛豫增强速率（）较纵向弛豫增强速率（）高一个数量级，故主链酰胺键氢核的,能够更好的反映溶液体系中蛋白质的结构变化42 .公式(1)与(2)分别定义了,和2:(1)55（4元）22Yiglis(s+1)Js(a)/2024元ig*Mis(s+1)4J s(0)+3J sp()Jsb(a)=r,1+(atc)其中，u为真空磁导率；为观察核磁旋比；g为电子的g因子；up为自由电子磁矩；r为顺磁中心与原子核间距；/2 元为观察核拉莫尔频率；s为电子自旋量子数；Tc为相关时间；JsB()为广义谱密度函数；(2)Tc(3)152Jss(O)为磁场场强为0 时的广义谱密度函数；Js()为观察核在磁场中以拉莫尔频率进动时的广义谱密度函数.由(2)、(3)式可知，,与r-成正比，即观测核离探针中心的距离越近，其横向弛豫增强速率越大.由于PRE效应对蛋白质结构中的距离信息变化十分敏感，能够捕获到溶液体系中低丰度的瞬时构象.因此本文选用PRE实验技术对EIIAGle/HPr的遭遇复合物结构进行捕捉.关于PRE实验探针的选择，需要考虑两方面因素：一是理想的探针应具有足够的刚性并尽量保持蛋白表面氨基酸侧链的特性；二是探针引入后应尽量避免对蛋白质天然结构及其活性的影响，一般选择在蛋白结构中较为刚性的位点引入顺磁探针本文选择在HPr的5号和6 6 号氨基酸引入EDTA-Mn2+顺磁探针图2(e)，从不同方向位点对遭遇复合物构象进行捕获，对比野生EIIAGle/HPr复合物与EIAGlc/HPrE5C和EIAGle/HPrE66C复合物的 H-15NHSQC谱图图2(a)和(b)，我们发现半胱氨酸突变的引入并不会干扰EIIAGlc/HPr复合物的天然结构.(a)EIIACIl/HPrESCEIIAGIl/HPr10(c)30(-s)INH20-10波谱学杂志(b)10511011512012513098observed PREEIAGIe/HPrE5C第40 卷(e)ElIAGle/HPrE66C105EIIAGIc/HPr110115120125F130710Residue66HPrResidue598calculated PRE7()EIIAGIC20(d)4030(-s)INH2010020图2 2 5下，EIAGlc/HPr溶液体系（黑色）与EIIAGle/HPrE5C(a)、EIIA G l c/H Pr E6 6 C(b)溶液体系（红色）的 H-15NHSQC谱图比较；EIIAGlc与HPrE5C(c)、EIIA G l c 与HPrE66C(d)的分子间PRE实验观测值（红色圆点）和理论计算值（黑色实线)；(e)HPr 探针连接位点结构图；(f)EIAGlc的结构示意图，其中PRE实验值与理论计算值差异较大的区域用红色表示Fig.2H-15N HSQC spectra of EIIAGle/HPr solution(black)and EIIAGle/HPr E5C(a)or EIIAGle/HPr E66C(b)(red)werecompared under 25 C.Experimental observations(red dots)and theoretical calculations(black solid lines)of intermolecular PREof EIIAGlc and HPr E5C(c)or HPr E66C(d);(e)Structure diagram of HPr probe connection site;(f)Schematic diagram of EIIAGlcstructure,where areas with large differences between PRE experimental values and theoretical calculated values are shown in red40observedPREEIIAGlc/HPrE66C40606080ResidueNumber80100ResidueNumber100120calculatedPRE120140140160160第2 期然而，我们发现EIIAGl/HPrE5C、EIA G l c/H Pr E6 6 C两种复合物中均有一些残基的PRE实验观测值与理论计算值相差较大图2(c)，(d)，(f)，如EIIAGle/HPrE5C复合物中EIIAGlc的6 3 8 5、140 145号残基，EIIAGle/HPrE66C复合物中EIIAGlc的8 0 8 5、110 12 0、140 145号残基.这说明EIIAGlc/HPrE5C、EIIA G l c/H PrE66C蛋白质复合体不是以单一的特异性复合物形式存在于溶液中，EIAGlc与HPr突变体蛋白之间还存在瞬时相互作用因为各个EIIAGle/HPr复合物的动态结构各不相同，而图2 中的PRE理论计算基于单个特异性复合物的结构信息进行，PRE图谱反映的则是溶液体系中蛋白质复合物所有平衡状态的平均值，复合物体系中不同构象之间的交换通常比NMR的时间尺度快，故实验值与数据值之间的数值偏差可以证明溶液体系中蛋白质系综结构的存在.2.2EIIAGle/HPr复合物系综结构的理论计算我们通过分子对接方法生成含有36 0 0 个EIAGlc/HPr复合物的结构库，对构象库中每一个EIAGlc/HPr复合物结构进行PRE理论值计算后与其实验值进行比较由图3(a)知，EIIAGlc/HPrE5C和EIAGlc/HPrE66C复合物系综结构中HPr的空间分布大体相同对于两种复合物系综结构的PRE理论计算值与实验值的相关性，本文使用皮尔逊相关系数（Pearsoncorrelationcoefficient）进行度量皮尔逊相关系数（r）为两个变量之间的协方差与标准差的商，表示为：赵昶等：顺磁核磁共振技术研究蛋白质遭遇复合物的动态结构Z(X,-X)(Y,-Y)1153i=2(X,-X)/2(Y,-Y)2=其中，X,为第i个EIAGle/HPrE5C或EIAGle/HPrE66C复合物结构的PRE理论计算值，X为EIIAGle/HPrE5C或EIAGle/HPrE66C复合物结构的PRE理论计算值的平均值，Y,为第i个EIIAGle/HPrE5C或EIAGle/HPrE66C复合物结构的PRE实验值，Y为EIAGle/HPrE5C或EIIAGlc/HPrE66C复合物结构的PRE实验值的平均值.(a)EILAGle/HPrE5CEIIAGIe/HPrE66C图3(a)EIIAGlc/HPrE5C和EIIAGle/HPrE66C复合物系综结构中HPr的空间分布；(b)PRE实验值与理论值的相关性（Co r r e l a t i o n）随系综大小（Ensemblesize）变化图Fig.3(a)The spatial distributions of HPr in EIIAGle/HPr E5C,EIIAGle/HPr E66C complex ensemble structures;(b)The plot ofensemble size against the correlation between the experimental and the theoretical PRE value of the calculated ensemble将两种复合物系综结构的PRE理论计算值与实验值的相关性Correlation，图3(b)进行对比发现，整个系综结构体系所包含的结构数量（Ensemble size）越多，PRE理论计算值与实验值的吻合性越好，在系综结(b)1.00.80.60.4-0.2-0EIIAGic/HPrE5CEIIAGl/HPrE66C1020Ensemblesize304050154构总数达到30 组以上时，理论计算值与实验值的相关性保持在0.8 左右，且不再发生明显改变为避免对PRE实验数据的过拟合，我们选择包含30 个构象的系综结构体系对其在溶液体系中的动态结构进行研究.图4为EIIAGle/HPr复合物在溶液体系中的动态分布，结果表明在EIIAGle/HPr形成遭遇性复合物的过程中，HPr分布在EIIAGlc的特异性结合位点周围，其空间位置可大致划分为3个团簇其中，团簇I位于EIIAGlc与HPr的特异性界面上方，相较于其他团簇更靠近于特异性结合界面，簇中的HPr与EIIAGlc的空间取向也与特异性复合物相似。而团簇II和团簇II中HPr的位置离EIIAGIc特异性活性位点相对较远，需在溶剂空间环境中经过旋转后才能与EIIAGIc的特异性位点对齐并发生蛋白质结合：遭遇复合物系综结构中各团簇空间位置的差异导致单个HPr蛋白分子与单个EIIAGIc蛋白分子间距离分布的不同，这进一步解释了图2 中PRE实验值与理论计算值之间的差异EIIAGlc/HPr团簇I靠近EIAGIc的8 0 8 5残基，团簇I靠近EIIAGIc的110 12 0 残基，团簇II靠近EIIAGIc的140 150 残基，与EIIAGIcPRE实验值与理论计算值之间存在差异的区域大致吻合图2(f).波谱学杂志第40 卷(a)ClusterIlEIIAGIl/HPrE5C(b)ClusterIlClusterIEIIAGl/HPrE66C8ClusterIClusterIllCluster Ill9090ClusterIlClusterIl9ClusterIClusterI&ClusterIllClusterIllO图4EIAGle/HPrE5C(a)和EIIAGle/HPrE66C(b)在缓冲液中的系综计算结构其中包括EIIAGic（黄色）和HPr（蓝色）的特异性复合物，EIIAGle/HPrE5C和EIIAGlc/HPrE66C复合物中的HPr分子的质心以灰色圆圈表示。根据HPr在EIIAGlc表面的位置可将其分布方向分为三个簇，用虚线圆圈表示Fig.4 Calculated ensemble structures of EIIAGle/HPr E5C(a)and EIIAGle/HPr E66C(b)complexes in dilute buffer.The specificcomplex of EIIAGlc(yellow)and HPr(blue)are shown as cartoon,and the mass center of HPr molecules of the calculatedEIIAGic/HPr E5C and EIIAGle/HPr E66C complexes are shown as gray dots.According to the location on the EIIAGlc surface,HPrmolecules are divided into three clusters marked using dashed cycles第2 期2.3MD模拟与PRE实验结果的交叉验证为进一步验证PRE的实验结果，我们对EIAGlc/HPr的三种遭遇复合物结构进行了MD模拟为了保证模拟采样的充分性，我们分别针对不同的初始结构独立模拟了三条不同的轨道（不同的随机数作为起始），从模拟的结果来看，虽然不同的模拟轨道之间有涨落，但是总体的趋势是比较一致的三条轨道总体来说都比较收敛，没有出现RMSD值或者距离一直在增大或一直在变化的情况.由RMSD结果图5(a)(c)可知：因为ClusterI蛋白质空间位置分布与特异性复合物相似，所以在ClusterI区域形成的遭遇复合物结构基本保持稳定；由于ClusterII与Cluster II离EIIAGle/HPr特异性相互作用界面较远，在此区域形成的遭遇复合物的RMSD均出现较大涨落，说明在计算过程中它们偏离了模拟的初始结构然而，在ClusterI与ClusterII模拟结果中，EIAGlc和HPr之间的距离并没有随着模拟时间一直增大图5(d)(f)，说明在模拟时间内，这两种遭遇复合物并没有发生蛋白质解离，我们猜测可能是HPr绕着EIAGIc进行旋转模拟结构图图5(g)(i)表示，HPr从起始位置（模拟时间0 ns）开始逐渐向特异性结合界面方向运动（模拟时间2 0 ns，6 0 n s）这证实了我们之前的猜想，即EIAGle/HPr遭遇复合物从起始位置开始，绕着EIIAGlc逐渐向EIIAGle/HPr特异性复合物结合界面旋转，最终形成特异性复合物目前的MD模拟描述了部分遭遇复合物动态过程，在ClusterII与ClusterIII类遭遇复合物体系中，HPr由遭遇复合物起始位置开始，逐渐向特异性相互作用界面移动.(a)20 Trajectory!Trajectory215Trajctory310500(d)4540赵昶等：顺磁核磁共振技术研究蛋白质遭遇复合物的动态结构(b)20ClusterI151004080Time(ns)155(c)20ClusterIl15105120160ClusterICluster Il2000(e)45404080Time(ns)120160ClusterIl200040(f)45403580Time(ns)120160ClusterI200NYM25200(g)EIIAGIC图5(a)(c)三种遭遇复合物 RMSD值随时间的变化；(d)(f)三种遭遇复合物 EIIAGlc与HPr质心间距离随时间的变化；(g)(i)三种遭遇复合物的分子动力学模拟6 0 ns内结构变化示意图，其中 Ec 代表遭遇复合物（Encounter Complex，EC),Sc代表特异性复合物（SpecificComplex，Sc)Fig.5 (a)(c)The RMSD plots of three encounter complexes in three parallel trajectories;(d)-(f)The distance plots of threeencounter complexes in three parallel trajectories;(g)(i)The structure change schemes of three different encounter complexesduring 60 ns under MD simulations,Ec represents encounter complex(Ec),Sc represents specific complex(Sc)25204080Time(ns)2520120160Ee-HPrOnsEc-HPr20nsEc-HPr60nsSc-HPrClusterI2000(h)EIIAGCSe-HPr4080Time(ns)Ec-HPrOnsClusterIl120160Ec-HPr20nsEe-HPr60tns2000(i)Ee-HPrOnsElIAGlcSe-HPr40Time(ns)Ec-HPr20 nsEc-HPr60nsClusterIl801201602001563结论本研究通过PRE技术及MD模拟对EIAGlc/HPr遭遇复合物动态结构进行解析，PRE实验表明，单一的特异性复合体的构象并不能符合PRE的测量曲线，这提示EIAGlc/HPr在溶液中存在多种构象状态，这些不同的构象状态应该是蛋白质的遭遇复合物.通过分子对接采样，以及对PRE实验数据的拟合，我们可以获得遭遇复合物的分布位置，并通过聚类分析能把遭遇复合物分为3类由MD模拟结果我们发现，虽然HPr远离特异性结合界面位置形成的遭遇复合物不稳定，但是复合物并未发生解离，故HPr很可能首先与EIIAGIc形成遭遇复合物，之后绕着EIIAGIc旋转到达特异性结合界面，形成特异性复合物此分析方法不仅适用于研究蛋白质的相互作用机理，还有望应用于揭示蛋白质在生物体内的动力学行为。致谢感谢国家自然科学基金面上项目（3197 1155）的支持.利益冲突无波谱学杂志第40 卷参考文献：1 2 3 4 5 6 7 8 910 VIJAYAKUMAR M,WONG KY,SCHREIBER G,et al.Electrostatic enhancement of diffusion-controlled protein-protein association:comparison of theory and experiment on barnase and 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