坛紫菜蛋白的酶法提取及其理化性质_冷檬.pdf

鲍鱼内脏中含有丰富的可分解藻类多糖的水解酶。为实现坛紫菜(Porphyra haitanensis)蛋白的高效提取和产业化制备，采用鲍鱼内脏酶对坛紫菜进行酶法破壁提取紫菜蛋白，并比较冷冻干燥与喷雾干燥对蛋白理化性质的影响。结果显示，鲍鱼内脏酶酶解坛紫菜提取蛋白的最佳条件为：加酶量7.6%、酶解时间2.8 h、酶解温度35、料液比质量体积比为125，在该条件下获得的蛋白得率为(238.652.13)mgg1。观察坛紫菜的外观及细胞形态，发现鲍鱼内脏酶能显著破坏坛紫菜细胞壁。冷冻干燥坛紫菜蛋白(Freeze-dried P.haitanensis protein,FPP)在不同pH下的溶解性和乳化性能均优于喷雾干燥坛紫菜蛋白(Spray-dried P.haitanensis protein,SPP)(P0.01)，而SPP的表面疏水性与接触角均高于FPP(P0.01)。扫描电镜结果显示，FPP为表面光滑的片状结构，而SPP呈大小较为均一、表面有凹槽的球状颗粒。综上，鲍鱼内脏酶能有效破坏坛紫菜细胞壁，使水溶性蛋白溶出。制备得到的蛋白均具有良好的理化特性，其中冷冻干燥所制备蛋白的理化性质更佳。关键词：坛紫菜；鲍鱼内脏酶；响应面；理化性质中图分类号：TS 254.9文献标志码：A 开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Enzymatic extraction and physicochemical properties of Porphyra haitan-ensis proteinLENG Meng1,LIN Duanquan1,2,3,WENG Ling1,2,3,ZHANG Lingjing1,2,3,MIAO Song1,3,4,CAO Minjie1,2,3,SUN Lechang1,2,31.College of Marine Food and Bioengineering,Jimei University,Xiamen 361021,China2.Dalian Polytechnic University/Collaborative Innovation Center of Seafood Deep Processing,Dalian 116034,China3.National&Local Joint Engineering Research Center of Deep Processing Technology for Aquatic Products,Xiamen 361021,China4.Teagasc Food Research Centre,Ministry of Agriculture and Rural Affairs,Cork 999014,IrelandAbstract:Abalone viscera is rich in hydrolytic enzymes that can decompose algal polysaccharides.In order to realize the highlyefficient extraction and industrial production of Porphyra haitanensis protein,we used abalone visceral enzymes to break the cellwall of P.haitanensis to extract porphyra protein,and compared the physicochemical properties in proteins prepared by freezedrying and air drying.The results show that the optimal enzymatic conditions were obtained as follows:enzyme dosage of 7.6%,enzymatic hydrolysis time of 2.8 h,enzymatic hydrolysis temperature of 35,and material-to-liquid ratio of 1:25.The proteinyield under above conditions was(238.652.13)mgg1.The results of appearance morphology and cell morphology of Por-第 19 卷第 3 期南 方 水 产 科 学Vol.19，No.32023 年 6 月South China Fisheries ScienceJun.，2023收稿日期：2022-09-13；修回日期：2022-12-23基金项目：国家重点研发计划重点专项(2020YFD0900904-01)作者简介：冷檬(1996)，男，硕士研究生，研究方向为水产品深加工与蛋白质化学。E-mail:通信作者：孙乐常(1985)，男，副教授，博士，研究方向为水产品深加工与蛋白质化学。E-mail:phyra haitanensis indicate that abalone viscera enzymatic digestion could break down the cell wall of P.haitanensis significantly.Freeze-dried P.haitanensis protein(FPP)showed better solubility and emulsification properties than spray-dried P.haitanensisprotein(SPP)at different pHs(P0.01),while the surface hydrophobicity and contact angle of SPP were higher than those ofFPP(P0.01).Scanning electron microscopy shows that FPP had a smooth lamellar surface,while SPP had a more uniformspherical particle size with grooves on the surface.In conclusion,the abalone viscera enzyme was effective in breaking down thecell wall of P.haitanensis and leaching out the water-soluble proteins.All the prepared proteins had good physicochemical proper-ties,while the freeze-dried proteins are better than air-dried proteins.Keywords:Porphyra haitanensis;Abalone viscera enzyme;Response surface;Physicochemical properties坛紫菜(Porphyra haitanensis)为红藻门、红毛菜科植物，是我国特有的传统海水经济藻类。据统计，2021 年福建省紫菜种植量达 5.9104 t，占全国总产量的 34%，是我国重要的紫菜产区1。作为药食两用的海藻，紫菜中含有蛋白质、维生素、矿物质、膳食纤维、多不饱和脂肪酸、类胡萝卜素、糖类等多种营养和生物活性成分，其中蛋白质占紫菜干质量的 25%30%2-3。紫菜蛋白具有抗氧化4、抗炎5、抗肿瘤6和降血压 7等多种生物活性，极具开发利用前景。然而紫菜中的主要蛋白如藻胆蛋白等均为水溶性胞内蛋白，在提取制备过程中，如何有效破坏细胞壁是决定紫菜蛋白得率的关键8。目前，国内外已报道的藻类破壁方法主要有反复冻融法9、溶胀法9、超声破碎法8及生物酶法10等。其中，反复冻融法和溶胀法存在耗时长、破壁效果不理想的缺点；超声破碎法除了耗能及设备要求高外，超声波的能量还会转化为热量，可能会在破壁过程中引起蛋白的热变性；酶法破壁的能耗低，操作简便，但是商品酶的成本较高。此外，由于细胞壁成分复杂，单一酶的破壁效果往往欠佳。鲍鱼为我国传统“八珍”之一，海洋藻类是其重要的食物来源。鲍鱼内脏中含有丰富的纤维素酶11、淀粉酶12、褐藻胶裂解酶13、内切葡聚糖酶与-1,4-甘露聚糖酶14、果胶酶15等能分解藻类多糖的水解酶。此外，它还是鲍鱼加工后的主要副产物，成本低廉。前期研究发现，鲍鱼内脏酶对紫菜细胞壁也具有较好的破壁效果，可作为现有市售藻类水解酶的潜在替代酶制剂16。制备获得的蛋白通常需进行干燥处理制成粉状产品，喷雾干燥和冷冻干燥为最常见的干燥方法17。Shen 等18研究了干燥方式对藜麦(Chenopodiumquinoa)分离蛋白理化性质的影响，发现冷冻干燥的藜麦分离蛋白具有更好的乳化性、乳化稳定性及持油力。Lin 等19分析了喷雾干燥、冷冻干燥和热风干燥对南极磷虾(Euphausia superba)蛋白结构和理化特性的影响，发现喷雾干燥样品具有更小的粒径，更好的溶解度、发泡性及乳化性能，并且具有最佳的感官性能。由此可见，不同的干燥方式对蛋白质的结构及理化性质有重要影响，决定着蛋白质品质及其应用范围 20。本研究采用响应面实验对鲍鱼内脏酶酶解坛紫菜条件进行优化，通过蛋白得率、还原糖提取率、固形物含量及微观结构等方面评价坛紫菜生物酶解破壁效果，并分析不同干燥方式的紫菜蛋白的溶解度、乳化性、乳化稳定性及微观结构，为坛紫菜蛋白的高效提取和产业化制备提供理论参考。1 材料与方法 1.1 材料与试剂干坛紫菜购于福建省霞浦县沙江镇，研磨成粉后过 100 目筛，干燥保存。新鲜坛紫菜(Z-61)由集美大学水产学院坛紫菜团队培养获得。皱纹盘鲍(Haliotis discus hanai)购于厦门市夏商水产批发市场。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)、8-苯氨基-1-萘磺酸(8-anilino-1-naphthalenesulfonicacid ammonium salt,ANS)购自美国 Sigma 公司；其余试剂均为国产分析纯。1.2 仪器与设备DK-8D 电热恒温水槽(上海一恒科技有限公司)；FP-8200 荧光分光光度计(日本 JASCO 公司)；795S 型紫外可见分光光度计(上海棱光技术有限公司)；Avanti J268XP 高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter 公司)；PMK223ZH/E 电子天平(常州奥豪斯仪器有限公司)；Echo Revolve 荧光倒置显微镜(美国 Tousimis 公司)；CA100C 接触角测量仪(上海盈诺精密仪器有限公司)；D-160 高速均质机(北京 DLAB 公司)；Phenom Pro 台式扫描电子显微镜(荷兰 Phenom 公司)。第 3 期冷 檬等:坛紫菜蛋白的酶法提取及其理化性质141 1.3 方法1.3.1鲍鱼内脏酶的制备根据文嘉欣14的方法，将鲍鱼内脏剁碎后，加入 4 倍体积低温冷藏过的蒸馏水，用组织捣碎机充分捣碎后在 4 下，10 000g 离心 20 min。双层绢布过滤上清液，冷冻干燥即得鲍鱼内脏粗酶粉末。使用 DNS21法测定鲍鱼内脏酶酶活，酶活力定义：在 37 条件下，每小时分解 4%(质量分数)紫菜产生 1 g 还原糖所需要的酶量定义为 1 个酶活力单位。本次实验提取所得鲍鱼内脏酶比活为 2 300 Ug1。1.3.2紫菜蛋白酶法破壁提取取紫菜粉 20 g，按一定的料液比(干质量体积)与蒸馏水混合均匀，加入一定量的鲍鱼内脏酶，水浴酶解一段时间后，通过 100 水浴进行灭酶处理，冷却后离心取上清即为紫菜蛋白提取液。1.3.3单因素实验设计依次以加酶量(4%、5%、6%、7%、8%)、酶解时间(0、1、2、3、4 h)、酶解温度(30、35、40、45、50)和料液质量体积比(120、125、130、135、140)为单一变量，考察不同酶解条件对紫菜蛋白得率的影响，并确定各条件的最佳范围，用于响应面分析。1.3.4响应面优化设计根据单因素实验的结果，选择加酶量、酶解温度、酶解时间为自变量，蛋白得率为响应值，设计三因素三水平 Box-Benhnken 响应面实验，实验的因素水平见表 1。1.3.5酶解指标测定参考 Shen 等22的方法，将紫菜蛋白提取液稀释适量倍数后吸取 100 L 于离心管，再依次吸取500 L Folin 甲液和 100 L Folin 乙液混匀，37 孵育 15 min，测定 680 nm 处的吸光值。以牛血清蛋白为标准计算提取的紫菜蛋白浓度。参考李云嵌等23的方法，按以下公式计算蛋白得率：yp=m/M(1)式中：yp为蛋白得率(mgg1)；m 为紫菜蛋白提取液中的蛋白总量(mg)；M 为紫菜干质量(g)。参考郑惠彬等24的方法，将破壁后的紫菜液在 20 下，12 000g 离心 10 min，收集紫菜蛋白提取液后，将离心后的不溶性沉淀置于 105 烘干至恒质量后称量，按下式计算固形物得率：ys=(M m)/M100%(2)式中：ys为固形物得率(%)；M 为紫菜干质量(g)；m 为不溶性沉淀干质量(g)。1.3.6破壁方法比较为了对比生物酶解法破壁和物理法破壁对紫菜蛋白的提取效率，取 20 g 紫菜粉与 500 mL 蒸馏水混匀，分别利用鲍鱼内脏酶解法、超声破碎法25、反复冻融法25、溶胀法25和复合酶解法24对紫菜进行破壁处理，而后按 1.3.2 的方法进行离心取上清，灭酶冷却后得到紫菜蛋白提取液。通过测定蛋白得率以及固形物得率对不同处理方法的破壁效率进行比较分析。为了更直观观察不同方式处理的破壁效果，选取表面光滑、披针形、无破损的新鲜紫菜藻叶(约5 g)，分别置于 4 个 200 mL 烧杯中，参考上述处理方式进行破壁处理后，取适量藻叶及溶液置于培养皿中观察外观形态，将藻叶置于载玻片使用显微镜观察细胞形态。1.3.7紫菜蛋白粉末的制备将紫菜以加酶量 7.6%、酶解时间 2.8 h、酶解温度 35、料液比 125 的条件进行酶解后，以12 000g 离心 10 min，上清液冷冻干燥得冻干坛紫菜蛋白(Freeze-dried P.haitanensis protein,FPP)，上清液喷雾干燥得喷干坛紫菜蛋白(Spray-dried P.haitanensis protein,SPP)。1.3.8溶解度参考 Latorres 等 26的方法，准确称取 SPP 和FPP 粉末 1 g，溶于 100 mL 不同 pH 的磷酸盐缓冲液(20 mmolL1)，放磁力搅拌器上匀速搅拌 30 min后 2 400g 离心 20 min，Lowry 法测定上清液中可溶性蛋白的质量浓度。微量凯氏定氮法测定未离心前溶液的蛋白浓度，即得总蛋白质量浓度。S=Cps/Cpt100%(3)式中：S 为溶解度(%)；Cps为上清液蛋白质量浓度(mgmL1)；Cpt为总蛋白质量浓度(mgmL1)。1.3.9表面疏水性采用 ANS 荧光探针法27测定不同 pH 下 FPP和 SPP 表面疏水性。将样品稀释至 1 mgmL1后表1 Box-Behnken Design 设计方案Table 1 Box-Behnken Design solution因素 Factor水平 Level101A 加酶量 Enzyme dosage/%678B 酶解时间 Enzymolysis time/h123C 酶解温度 Enzymolysis temperature/303540142南 方 水 产 科 学第 19 卷取 2 mL，加入 10 L 8 mmolL1 ANS，室温下避光20 min。使用荧光分光光度计测定表面疏水性指数，以 374 nm 为激发波长，485 nm 为发射波长，测得荧光强度既为表面疏水性指数 S0。1.3.10接触角使用 pH 7 的磷酸盐缓冲液(10 mmolL1)将样品配置为 10 mgmL1的溶液，准确吸取 50 L 滴在特制的硅化玻璃表面，室温下自然干燥 20 h 后，使用接触角测量仪测定接触角。1.3.11乳化性和乳化稳定性采用浊度法28测定乳化性和乳化稳定性。准确称取 200 mg 样品，加入 15 mL 不同 pH 的缓冲液和 5 mL 玉米油，均质机 15 000 rmin1搅拌1 min 制得乳液。从底部吸取 50 L 乳液至 5 mL0.1%SDS 中，震摇 10 s 后测定 500 nm 处的吸光度值。紫菜蛋白的乳化性(EAI)用以下公式计算：EAI=(2TA0)DF/c10 000(4)式中：EAI 为紫菜蛋白的乳化性(m2g1)；T 为浊度，值为 2.303；A0为样品在 500 nm 处的吸光度值；DF为稀释倍数；c 为溶液蛋白质量浓度(gmL1)；为乳液体系中油所占的比例。上述乳液在室温下静置 10 min 后，再吸取50 L 并用同样的方法测 500 nm 吸光度。并用以下公式计算乳化稳定性(ESI)：ESI=(A0t)/(A0 At)(5)式中：ESI 为乳化稳定性(min)；A0为第 0 分钟时500 nm 处吸光度值；t 为静置的时间差；At为静置一段时间后 500 nm 处的吸光度值。1.3.12扫描电镜将干燥的样品粘贴在导电胶上，使用离子溅射仪喷金 75 s 后，放于扫描电镜内观察并拍照。1.3.13数据处理XSE实验数据均采用 SPSS 26.0 软件的单因素 ANO-VA 检验进行显著性分析，结果以“平均值标准误()”表示，N=3。2 结果 2.1 单因素实验结果分别考察加酶量、反应温度、酶解时间以及料液比对蛋白得率的影响(图 1)。随着鲍鱼内脏酶添ccbcaba15017019021023045678酶添加量Enzyme addition amount/%ababbb3035404550baabbb(a)(c)(d)(b)cbaaa01234蛋白得率Protein extraction rate/(mgg1)170210190230250270170210190230250270蛋白得率Protein extraction rate/(mgg1)100140180220260蛋白得率Protein extraction rate/(mgg1)时间t/h温度Temperature/120125130135140料液比Material to liquid ratio蛋白得率Protein extraction rate/(mgg1)图1 加酶量、温度、时间和料液比对鲍鱼内脏酶酶解紫菜的影响注：同一序列中不同小写字母表示显著差异(P0.05)；图 6、图 7 同此。Fig.1 Effects of enzyme addition,temperature,time and material-to-liquid ratio on enzymatic digestion ofP.haitanensis by abalone viscera enzymeNote:Different lowercase letters in the same series indicate significant differences(P0.05).The same case in Fig.6 and Fig.7.第 3 期冷 檬等:坛紫菜蛋白的酶法提取及其理化性质143加量的增加(4%8%)，紫菜蛋白得率逐渐上升，添加量高于 7%时，蛋白得率曲线趋于平缓(图 1-a)。在一定的酶添加量下，02 h 蛋白得率增长迅速，2 h 后增长较为缓慢，并在 3 h 后达到饱和(图 1-b)。从效率和成本考虑，选择酶解紫菜的适宜时间为 2 h。在不同温度进行保温酶解，发现35 时蛋白得率最高，当温度低于或超过 35，蛋白得率都会有一定程度的下降(图 1-c)。在料液比为(120)(140)时，蛋白得率呈现先升高后下降的趋势，且在 125 时达到最大值(238.76mgmL1，图 1-d)。2.2 响应面实验结果及分析实验选取蛋白得率(Y)为响应值，通过 Box-Behnken 中心设计原理，选择加酶量(A)、酶解时间(B)、酶解温度(C)3 个响应变量，实验设计及结果如表 2 所示。通过 Design Expert 16 软件对表 2 结果进行多元回归拟合，获得蛋白得率(Y)对加酶量(A)、酶解时间(B)和酶解温度(C)的多元二次回归方程：Y=229.77+21.36A+18.82B2.81C+7.02AB+0.098AC+1.22BC22.30A214.20B215.27C2方差分析结果如表 3 所示，模型 P0.001，表明该模型极其显著。失拟差 P=0.616 3 远大于0.05，表明该回归方程的拟合度高，同时 F 值为244.51，进一步证明了该模型的合理性。以上条件都表明模型建立成功，因此可以用该模型来预测和分析反应体系的蛋白得率。由表 3 可知，A、B、C 均 PB(酶解时间)C(酶解温度)。根据响应面图的曲面陡峭程度，以及等高线是否密集成椭圆形，可以直观地表示两个因素之间交互作用的关系29。响应面陡峭且映射的等高线图呈椭圆形(图 2-a)，结合表 3 中 AB 交互项 P0.001，可知加酶量和酶解时间的交互作用极显著。根据 Design Expert 拟和的结果，得出最佳酶解条件为加酶量 7.607%、酶解时间 2.811 h、酶解温度 34.713，理论蛋白得率为 243.944 mgg1。根据实际的生产操作，取加酶量 7.6%、酶解时间2.8 h、酶解温度 35 进行验证，得到酶解液的蛋白得率为(238.62.1)mgg1，相对误差为 2.2%，与预测结果基本一致。2.3 酶解效果2.3.1蛋白得率和固形物得率紫菜中的藻胆蛋白是胞内蛋白，细胞壁破坏程度从另一方面也可以反映紫菜蛋白提取效率。将鲍鱼内脏酶酶解法与超声破碎法、冻融法及溶胀法进行比较，以紫菜蛋白得率和固形物得率为评价指标，结果如图 3 所示。酶解组的蛋白得率与固形物得率分别为 238.6 mgg1 和 58.5%，极显著高于超声法、冻融法与溶胀法(P0.01)。2.3.2细胞显微特征和形态观察不同处理方式的紫菜外观形态变化如图 4 所示。图 4-a 为未经处理的紫菜，此时的紫菜为褐绿色，呈完整厚实的条状，水溶液呈无色透明。溶胀(图 4-b)、冻融(图 4-c)、超声处理(图 4-d)的紫菜由未处理的褐绿色变为红褐色，并出现部分细碎藻叶。鲍鱼内脏酶酶解处理的紫菜藻叶出现明显的崩解现象，溶液颜色也呈现浑浊不透明的砖红色表2 鲍鱼内脏酶酶解紫菜响应面实验设计及结果Table 2 Response surface experimental design andresults of enzymatic digestion of P.haitanensis byabalone viscera enzyme序号No.A：加酶量Enzymedosage/%B：时间t/hC：温度Temperature/Y：蛋白得率Protein yield/(mgg1)16135158.4628135189.0436335183.4748335242.1356230174.9668230215.5676240168.6688240209.6597130185.99107330219.76117140178.40127340217.07137235229.99147235232.14157235231.90167235226.36177235228.45144南 方 水 产 科 学第 19 卷(图 4-e)。不同处理方式的紫菜细胞在 1040 的光学显微镜图片如图 4-f4-j 所示。未经过任何处理的紫菜细胞具有完整的形态，呈较为规则的多边形结构，排列整齐致密。溶胀与冻融与对照组相比无明显区别。超声与酶解组细胞失去原有规则且紧密排列的形态，呈现出颜色更深、分布更分散的黑点，其中酶解组更明显。2.4 外观色差和微观结构破壁后的藻蛋白提取液经冷冻干燥或喷雾干燥均可得到紫色粉末，其中冷冻干燥的藻蛋白粉末呈现碎片状，且颜色较深，而喷雾干燥的粉末则呈现细粉状，且颜色较浅(图 5)。冻干坛紫菜蛋白FPP 呈形状不一、表面较为光滑的片状结构，喷干坛紫菜蛋白 SPP 呈大小较为均一的球形颗粒，其中大部分颗粒表面有凹槽，与宏观图结果一致。2.5 溶解度和表面疏水性由图 6-a 可知，在溶液 pH 311 范围，冻干坛紫菜蛋白 FPP 与喷干坛紫菜蛋白 SPP 的蛋白溶解度均呈现缓慢上升的趋势，在 pH 11 时，溶解度分别为 99.5%与 71.1%，且 FPP 的溶解度均高于SPP。由图 6-b 可知，FPP 与 SPP 的表面疏水性随pH 的升高呈先上升后下降的趋势，且在 pH 5 时达到最高值。当 pH 7 时，FPP 与 SPP 的接触角分别为 35.02与 51.16，SPP 显著大于 FPP(P0.01)。2.6 乳化性和乳化稳定性由图 7-a 可知，在 pH 介于 311 范围时，冻干坛紫菜蛋白 FPP 和喷干坛紫菜蛋白 SPP 的乳化性均呈现随 pH 的上升逐渐增大的趋势，pH 3 时最低，分别为 7.93 和 3.00 m2g1；pH 11 时最高，分别为 23.34 和 21.78 m2g1。在相同 pH 环境下，FPP 的乳化性均显著高于 SPP。由图 7-b 可知，在 pH 311 范围，冻干坛紫菜蛋白 FPP 和喷干坛紫菜蛋白 SPP 的乳化稳定性均呈现先下降后上升的趋势，pH 5 时最低，分别为17.98 和 10.02 min；pH 3 时最高，分别为 24.60 和18.52 min。在相同 pH 环境下，FPP的乳化稳定性均显著高于 SPP。3 讨论鲍鱼以海洋藻类为食，内脏消化腺中含有丰富的海藻多糖水解酶，在藻类破壁与藻类细胞质体制备中具有天然优势。酶法破壁的效果与藻类细胞壁组成以及所使用酶制剂的底物专一性有关。紫菜细胞壁主要由纤维素组成的内层与果胶组成的外层构表3 回归模型方差分析Table 3 Regression model analysis of variance来源Source平方和SS自由度df均方MSFP显著性Sig.模型 Model11 105.4091 233.91244.510.000 1*A3 648.8313 648.83723.040.000 1*B2 832.7612 832.76561.330.000 1*C63.27163.2712.540.009 5*AB197.041197.0439.040.000 4*AC0.03810.0380.007 5540.933 2BC5.9915.991.190.312 1A22 092.9312 092.93414.930.000 1*B2849.051849.05168.240.000 1*C2981.241981.24194.440.000 1*残差 Residual35.3375.05失拟差 Lack of fit11.7533.920.660.616 3不显著纯误差 Pure error23.5845.90总和 Total11 140.7216注：*.差异显著(P0.05)；*.差异极显著(P0.01)。Note:*.Significant differences(P0.05);*.Extremely significant differences(P0.01).第 3 期冷 檬等:坛紫菜蛋白的酶法提取及其理化性质145成30-31。鲍鱼内脏中已证实含有纤维素酶32与果胶酶15，因此能有效水解破坏紫菜细胞壁。本实验中，酶添加量高于 7%时，由于紫菜被鲍鱼内脏酶完全水解，整个反应体系达到饱和状态，酶解 2 h 后得率也无显著性增加，这可能是随着时间的延长，酶与紫菜反应达到了饱和。酶有特定的反应温度，温度过高或过低，酶活力均会有不同程度的损失。在本实验中，鲍鱼内脏酶在 35 20022024052602402202001801601403.02.52.01.51.06.06.57.07.58.0蛋白得率 Protein yield/(mgg1)酶解时间Enzymolysis time/h 加酶量Enzyme dosage/%(a)2602402202001801601404038363432306.06.57.07.58.0蛋白得率 Protein yield/(mgg1)酶解温度Temperature of enzymatic hydrolysis/加酶量Enzyme dosage/%(b)2602402202001801601404038363432301.01.52.02.53.0蛋白得率 Protein yield/(mgg1)酶解温度Temperature of enzymatic hydrolysis/酶解时间Enzymolysis time/h(c)6.06.57.07.58.03.02.52.01.51.0蛋白得率 Protein yield/(mgg1)酶解时间Enzymolysis time/h 加酶量Enzyme dosage/%6.06.57.07.58.0403836343032蛋白得率 Protein yield/(mgg1)酶解温度Temperature of enzymatic hydrolysis/加酶量Enzyme dosage/%1.01.52.02.53.0403836343032蛋白得率 Protein yield/(mgg1)酶解温度Temperature of enzymatic hydrolysis/酶解时间Enzymolysis time/h 18018018020022022051901905图2 加酶量、时间和温度交互作用响应面图和等高线图Fig.2 Response surface and contour plots of enzyme addition,time and temperature interactions146南 方 水 产 科 学第 19 卷时所得紫菜蛋白的得率最高，表明该温度为鲍鱼内脏酶酶解紫菜的最适温度。在料液质量体积比为125 时蛋白得率最高，说明紫菜在此浓度下被酶解的最充分，因此选择 125 为最佳料液比。对酶解工艺条件进行响应面优化后，蛋白得率(提取蛋白/紫菜干质量)为(238.62.1)mgg1，显著高于物理破壁法(超声破碎法、冻融法及溶胀法)24，表明酶法破壁比物理法破壁的效率更高。值得一提的是，郑惠彬等25使用纤维素酶和木瓜蛋白酶复合酶解紫菜时，发现蛋白得率和固形物得率均高于单一酶，其最高蛋白提取率(提取蛋白/总蛋白)约为32%。本实验中，紫菜中总蛋白含量(提取蛋白/紫菜干质量)为干质量的 0.362 gg1，由此可推算本实验中 238.6 mgg1的蛋白得率转换为蛋白提取率约为 65.9%，高于纤维素酶与木瓜蛋白酶复合酶解法，这可能是由于鲍鱼内脏除了含有多种可水解细胞壁的酶外，还含有可以破坏细胞膜的蛋白酶与脂肪酶等，因此能更有效地破坏紫菜细胞壁与细胞膜，使胞内蛋白更容易溶出。通过表观与显微镜观察发现，经鲍鱼内脏酶酶解的紫菜不论在宏观还是微观上，对藻体的破坏程度均明显强于其他物理方法，这与蛋白得率的结果一致。市售蛋白的流通形式主要以粉状为主，喷雾干燥与冷冻干燥是目前制备蛋白粉常用的干燥方式。蛋白的理化性质是决定其应用价值的重要指标，喷雾干燥与冷冻干燥因干燥原理不同，其对蛋白的结构与理化特性会产生不同的影响。本实验中紫菜蛋白经冷冻干燥与喷雾干燥后，均呈现典型的紫色，表明提取制备的蛋白中主要为藻胆蛋白。其中，冻干紫菜蛋白的颜色较暗，这与片状形态及其对光线的折射有关。冻干紫菜蛋白呈形状不一、表面较为光滑的片状结构，可能是因为在干燥过程中，蛋白分子间的静电相互作用、共价键及疏水相互作用由于冷冻干燥而增强，使原本处于絮凝聚集状态的蛋白形成片状结构33。喷干坛紫菜蛋白呈大小较为均一的球形颗粒，这可能是因为在喷雾干燥的过程中，雾化的液滴遇到热空气，水分迅速蒸发而使液滴迅速收缩成球状。其中大部分颗粒表面都具有凹图3 不同破壁方式紫菜蛋白得率和固形物得率对比注：不同大、小写字母表示显著差异(P0.05)。Fig.3 Comparison of protein yield and solids yield ofP.haitanensis by different cell wall breaking methodsNote:Different uppercase and lowercase letters in the same series indi-cate significant differences(P0.05).90 m(a)(d)(c)(e)(b)(f)(i)(h)(j)(g)90 m90 m90 m90 m图4 不同破壁方式紫菜外观形态及光学显微镜图片(1040)注：从左到右依次为未处理、溶胀、冻融、超声、鲍鱼内脏酶酶解；ae 为外观形态，fj 为光学显微镜图片。Fig.4 Appearance morphologies and optical microscope images of P.haitanensis by different cell wall breaking methods(1040)Note:From left to right:untreated,lysed,freeze-thawed,sonicated and abalone visceral enzymatic digestion;ae.appearance morphologies,fj.optical microscope images.第 3 期冷 檬等:坛紫菜蛋白的酶法提取及其理化性质147acdebABBCA酶解Enzymolysis超声Sonicated冻融Freeze-thawed溶胀Lysed复合酶Complex enzyme破壁方式 Cell wall breaking methods0306090120150180210240270蛋白得率 Protein yield/(mgg1)010203040506070固形物得率 Solids yield/%槽，这是因为干燥过程中液滴雾化后产生不均匀收缩，同时不同的颗粒堆积在一起相互挤压所导致34。蛋白质的溶解度是评价蛋白质理化性质最重要的特征之一。本实验中，两组紫菜蛋白均在 pH 3 时溶解度最低，而随着 pH 的升高，蛋白溶解度也逐渐增大。徐海菊等35利用超声波破碎提取紫菜蛋白，发现其在 pH 4.5 时溶解度最低，与本实验所制备的紫菜蛋白的溶解性存在差异。这可能是因为鲍鱼内脏中的复合酶不仅能提高紫菜蛋白的提取率，其所含蛋白酶还能对紫菜蛋白进行一定的酶解改性，进而提高了整体的溶解性。与喷干坛紫菜蛋白相比，冻干坛紫菜蛋白的溶解性更佳。接触角是衡量蛋白膜疏水性的重要指标，接触角越大，说明蛋白膜具有更强的疏水性。在喷雾干燥过程中，高