园林生物技术.docx

学院专业报名接收免试统考上线单考破格调剂招生数自费委培1564906041015169+1981043000081303城市规划与设计3171341422000090706园林植物与观赏园艺1104939000560100风景园林硕士17+5563免费考研网园林植物与观赏园艺12010474833免费考研网Biotechnology of Horticultural Plant园艺植物生物技术（理论课教案）华中农业大学园艺林学学院2007-2008-1华中农业大学教案（首页） 授课时间 2007年9-11月 教案编写时间 2007年8月 课程名称园艺植物生物技术课程编号总学时 40讲课： 30 学时实验： 10 学时实习： 学时学 分 数2.5课型必修课（） 选修课（ ）理论课（） 实验课（ ）任课教师郭文武、程运江职称教授、副教授（博士）授课对象2002（班）级 园艺 专业 1、2班基本教材或主要参考书园艺植物生物技术，邓秀新、胡春根主编。高等教育出版社，2005H.S.Chawla 植物生物技术导论(许亦农 麻密 译) 化学工业出版社肖尊安 植物生物技术 化学工业出版社教学目的与要求通过本课程的学习，要求园艺专业学生掌握园艺植物生物技术相关基本理论和方法。教学重点、难点重点：生物技术的概念/应用现状、组织培养技术、病毒病脱除与无病毒繁殖难点：原生质体操作技术、基因分离克隆、转基因技术教学进程第 次课12-56-78-910-1112-1314-15授课章节（30学时） Theory part1) Introduction2) Tissue culture of hortic plant3) Protoplast culture & somatic fusion4) Virus eradication, detection & characterization5) Molecular markers6) Gene isolation & cloning7) Transgenic techniques学 时2844444备 注本课程采用多媒体课件教学3次实验课，分别为实验室布局/大型生物技术仪器介绍、组织培养技术、DNA鉴定技术。华中农业大学教案（课时备课） 第 1 次课 2 学时课目、课题（章节）第一章 绪论主要参考资料l 邓秀新 胡春根主编 园艺植物生物技术 高等教育出版社 2005。l H.S.Chawla 植物生物技术导论(许亦农 麻密 译) 化学工业出版社l 肖尊安 植物生物技术 化学工业出版社教学目的和要求* 掌握生物技术的概念、所包含的技术内容、对园艺科学发展的贡献及可能引起的深刻变化。* 了解园艺植物生物技术的发展历程* 课程要求与安排重 点难 点l 生物技术的内涵l 生物技术与产业的结合教学进程（含教学内容、教学方法、 辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）课程安排l 生物技术的概念l 组织和细胞培养是园艺生物技术的平台 l 基因工程技术是未来园艺生物技术的核心 l 生物技术对园艺科学发展的贡献 l 园艺植物生物技术的展望 l 课程要求与安排一 生物技术的概念* 以现代生物学理论为基础，以基因工程为核心的一系列技术的总称。* 狭义的植物生物技术：在离体条件下，对植物（细胞）进行遗传改良或使其增殖的各种技术的总称，包括细胞水平、分子水平两个大的层面。* 细胞学以及分子生物学是生物技术的基础。“Biotechnology” means any technological application that uses biological systems, living organisms, or derivatives thereof, to make, or modify products or processes for specific use.二 生物技术发展的历史和作用（一）组织和细胞培养是园艺植物生物技术的平台 * 1838-1839年，Schleiden和Schuwann提出植物和动物均由细胞构成，细胞进行分裂而增多，并组建成生物体的“细胞学说”；同时指出，若提供的条件同在活体内一样，每个细胞应该能独立生存和发展。* 1898年德国植物生理学家Haberlandt试图通过实验证明该学说，于1902年发表了植物细胞培养方面的第一篇论文，提出了植物细胞全能性（Totipotency）的概念。这一概念是指植物的每一个细胞在一定条件下，具有发育成一棵完整植株的能力。这一概念直到1971年烟草单细胞培养成功才得到完全证明并成为理论。* 1943年，White出版了植物组织培养手册。* 1958年，Steward从烟草髓细胞培养出完整植株，向证明细胞全能性迈进了一大步。该结果促进了多细胞组织和器官的培养研究与应用。* 1960年Morel培养兰花茎尖获得再生植株，并证明脱除了病毒。该结果催生了兰花工业的发展。直到今天，世界兰花种苗基本上通过组织培养生产。同年，Cocking通过酶解法从植物组织中分离得到去除了细胞壁的原生质体，使组织培养技术又向前迈进了一步。 * 1962年，Murashige和Skoog发表了促进烟草快速生长的培养基配方，即今天十分流行的MS培养基。 * 1964年，Guha和Maheshwari成功地从蔓陀萝花药培养得到再生植株，开创了花药培养获得单倍体的先河。 * 1971年，Takebe等报道了烟草原生质体培养成为完整植株，至此，植物细胞全能性得到完全证明。次年，Carlson获得烟草两个种间的原生质体融合再生的体细胞杂种植株。 植株组织培养的发展得益于两个方面的进展。一是对植物激素(plant hormone)的认识，以及人工合成激素（生长调节剂，plant growth regulator，PGR）的生产和应用，促进了植物组织培养技术的发展。1934年Went发现了植物生长素；1956年Miller发现细胞激动素。正是这些发现带动了植物组织培养技术的发展。今天，组织培养研究多数情况下是在摸索激素配比，也说明了植物激素研究对组织培养的重要性。* 第二是植物营养学科的发展。人们认识了植物生长必须的营养物质，利用该学科的成就，不断改进培养基配方，使得组织培养技术得到迅速普及。 * 植物组织培养技术的发展和成熟，有了一个离体无菌的技术平台，人们才有可能进行今天的转基因研究，才会有“作物分子设计”的概念产生，才会有今天依赖离体培养的诸多技术的产生，如快繁技术，离体保存、茎尖微芽嫁接脱除病毒技术等。可以说，组织培养技术是植物生物技术的基本平台，一个作物组织培养技术的成熟程度可以影响其基因工程的进展。（二）基因工程技术是未来园艺植物生物技术的核心 * 基因工程技术的发展以20世纪70年代DNA重组技术的建立为标志。人们把1953年Watson和Crick提出的DNA双螺旋结构模型，作为分子生物学和基因工程技术的里程碑。与组织培养技术的发展历程类似，基因工程技术的发展得益于生物化学、遗传学、细胞学等多个学科的发展。1983年，世界上首批转基因烟草和马铃薯问世；1986年，首批转基因植物进入田间实验；1993年，转基因番茄在美国面市。尽管转基因番茄没有在美国得到大面积推广应用，但转抗除草剂的大豆、转抗虫基因的玉米在美国等国家大面积推广，产品已销往世界许多国家。（三）生物技术对园艺科学发展的贡献 1. 脱毒与快繁技术广泛用于园艺作物种（苗）的生产 2. 花药培养以及小孢子培养是获得单倍体以及纯合二倍体材料的最佳途径 3. 胚抢救技术克服了果树早熟品种选育的技术难题4. 细胞融合技术创造出200多例柑橘体细胞杂种 5. 分子标记广泛应用于育种和资源研究6. 基因克隆与遗传转化方兴未艾（四）园艺植物生物技术的展望三、课程要求与安排* 总学时40，其中理论课30学时，实验课10学时* 授课教师 郭文武：博士/教授 程运江：博士/副教授 * 要求：认真听讲，做好实验，掌握基本原理和技术* 成绩：平时20%，实验或期中20%，期末考试60%作业布置；l 生物技术包括哪些内容？l 生物技术发展经历了哪几个阶段？l 生物技术对园艺生产可能带来哪些革命性的进步？l 生物技术发展过程中要注意哪些可能产生负面影响的问题？课后自我总结分析绪论应讲得宏观一些，激发同学们对该课程的学习兴趣，同时避免与后面各章节内容的重复。注：板书设计可在授课进程中直接用横线、浪线等标示出。华中农业大学教案（课时备课） 第 2-5 次课 8学时课目、课题（章节）第二章 植物组织与细胞培养技术主要参考资料l 邓秀新 胡春根主编 园艺植物生物技术 高等教育出版社 2005。l H.S.Chawla 植物生物技术导论(许亦农 麻密 译) 化学工业出版社l 肖尊安 植物生物技术 化学工业出版社教学目的和要求掌握植物组织培养的原理与技术了解植物组织培养技术在园艺生产与品种改良中的应用现状与前景重 点难 点l 组织培养技术l 组织培养技术的应用教学进程（含教学内容、教学方法、 辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）第一节 概说 组织培养(Tissue culture)指通过无菌操作分离植物体的一部分，即外植体（explants）接种到人工培养基（medium)，在人工控制的条件下（包括营养、激素、温度、光照等）进行培养，使其产生完整植株的过程。一 植物组织培养类型（一）根据培养方式：（二）根据培养过程分：（三）、根据培养材料分二、组织培养的意义园艺植物组织培养的意义和应用* 加速无性或有性世代的繁殖，缩短育种周期或获得新的基因。* 克服远缘杂交不亲和的障碍，促进幼胚发育。* 获得三倍体。* 快速繁殖苗木具有质量好、体积小、便于携带、运输和交流。* 获得无病毒苗木。* 离体保存（包括超低温）种质资源三、组织培养理论与技术发展简史1.探索阶段1902年，植物生理学家（德），根据细胞理论，提出：高等植物的器官和组织可以不断分割、直至单个细胞的植物细胞全能性（totipotency）的理论。即植物的体细胞在适当条件下，具有不断分裂和繁殖，发展成完全植株的潜在能力。HABERLANDT2. 奠基阶段3. 迅速发展阶段四 技术的发展（一）材料范围的逐步扩大第二节 组织培养原理与技术* 细胞是生物有机体的基本结构单位，特别是植物细胞又是在生理上发育上具有潜在全能性的单位。* 受精卵：可以产生具有完整形态和结构和功能的植株。* 体细胞：也具备遗传信息的传递、转录和翻译的能力。Basis for cell culture细胞分化和形态建成1合子胚的发育，经历生长和分化过程，生长为完整结构的有机体；2体细胞生长（类似），开始是进行生长。从一个分化的有专一功能的细胞，要表现它的全能性，首先要经过去分化（脱分化）的过程，改变细胞原来的结构、功能，而回复到无结构的分生组织状态，即愈伤组织状态。愈伤组织分生细胞团再分化，进行形态建成，而产生完整植株。（体细胞胚胎发生）最常见的再分化是根的形成：3 种方式（1）先形成根的，往往抑制芽的形成；（2）先形成芽的，较易产生根；（3）同时产生芽和根。* 一般而言，芽和茎叶原基起源于组织培养中比较表层的细胞（外起源）* 根原基则发生在组织较深处（内起源）* 在组织培养中再生植株还可通过与合子胚相似的胚胎发生过程，即形成胚状体，而成为完整的植株。* 有分化胚状体能力的种子植物已有117种（分属于34科，75属）。胚状体可从以下几种培养物中产生：1直接从器官上发生；2从愈伤组织上发生；3从游离的单细胞发生；4从小孢子发生。 诱导胚状体与诱导芽相比，有3个显著优点：1 数量多、速度快、结构完整；2 胚状体以单细胞直接分化成小植株，比经过愈伤组织再分化要快；3 胚状体一旦形成即可再生小植株，成苗率高。第二 节 实验室设计及基本设备一 实 验 室 设 置（一）基 本 实 验 室 准备室 准备室的功能就是进行一切与实验有关的准备工作。要求宽敞明亮，通风条件好。 接种室 接种室的功能是进行无菌操作。要求封闭性好，干燥清洁，能较长时间保持无菌。为了保持清洁，接种室应防止空气对流。 培养室 培养室的功能是对离体材料进行控制培养。其首要要求是要能控制光照和温度，其次为防止微生物感染，培养室应保持干燥和清洁。（二）辅 助 实 验 室细胞学实验室 其功能是对培养材料进行细胞学鉴定和研究。要求清洁、明亮、干燥，使各种光学仪器不受潮湿和灰尘污染。摄影室及暗室 其功能是进行培养材料的摄影记录和胶片冲印。在有条件的情况下可建立此实验室。生化分析室 在以培养细胞产物为主要目的的实验室中，应建立相应的分析化验实验室，以便于对培养物的有效成分随时进行取样检查。 二 培养容器与用具* 玻璃容器* 塑料容器* 金属用具* 塑料用具第三节 组织培养基一培养基的种类和成分（一）培养基的种类1培养基是组织培养最重要的基质。2培养基的名称多数以发表人的名字命名，再加上年号。3国际上常用的五种培养基：MS：Murashige 和Skoog (1962)ER：Eriksson（1965）B5：Gamborg等（1968）SH：Shenk和Hildebrandt（1972）HE：Heller（1953）* MS（Murashige和Skoog 1962）* M6（朱至清1975）：用于禾本科植物花药组织培养* Miller（1963）：一般组织培养* H（Bowgin和Nitsch）：一般组织培养* T（一般组织培养）* White（1963）：一般组织培养* B5（Gamborg et al 1968）一般组织培养* C17（王培等1986）：小麦花药培养* W14（欧阳俊闻等1988）：小麦花药培养* KM8P（Kao et al 1975）：原生质体培养* Lloyd and Mccoun（Lloyd 1980）：木本植物培养* RM（Reinent et al 1967）：兰花4各培养基特点* MS：用于烟草细胞，硝酸盐、钾和铵的含量比其它培养基高。* ER：与MS相似，磷酸盐的含量比MS高一倍，微量元素含量低得多。* B5：为培养大豆的细胞组织设计，铵的含量低。* SH：与B5相似，无机盐的含量稍高。* HE：无机盐浓度稍低，水稻愈伤组织培养上使用。(二) 培养基成分主要为五大类：（一）水（二）无机盐 大量元素 微量元素（三）有机化合物1碳水化合物2植物激素3. 维生素：维生素C、B1、B6、烟酸、叶酸、一般0.10.5 mg/L。4肌醇：一般用量100 mg/L5氨基酸（四）天然复合物1椰乳 coconut milk2香蕉3胳朊加水分解物（1）主要成分为氨基酸，浓度100200 mg/L。（2）受酶和酸的作用易分解。4马铃薯（1）去皮和芽，煮30分钟，过滤，一般150200 mg/L。（2）对pH缓冲作用大。5其它（1）酵母提取液、麦芽提取物、苹果汁、番茄汁、黄瓜果实、未熟玉米的胚乳。（2）遇热较稳定，大多在培养困难时使用，有时有效。（五）培养材料的支持物1琼脂（agar)（1）凝固剂，一般0.61%.（2）为防止有害物质毒害，可加110 g/L的活性炭。2其它：玻璃纤维、滤纸桥等。（六）抗生物质防止内生菌，可加抗生物质。二 培养基的制备（一）母液配制和保存（二）配制过程（三）pH值的调节（四）培养基分注：趁热分注（五）灭菌和洗涤三 生长调节物质的应用（一）生长素1吲哚乙酸（IAA）：有天然，也可合成，活力低。遇高温高压、遇酶、受光易分解，对器官形成副作用小。2萘乙酸（NAA）：可人工大量生产，高温高压下稳定，功能比IAA高3.7倍。32,4-D：可促进愈伤组织形成。不同器官对生长素的反应根：对生长素最敏感，低浓度下105103PPM，可促进生长；浓度高时，抑制生长。芽：浓度略高时，促进芽的生长。愈伤组织：高浓度的生长素可诱导产生，而且对愈伤组织的再分化也有诱导作用。其它：可促进细胞伸长、分裂、分化；还可促进新成代谢。（二）赤霉素（GA3）1GA3对整个植株的作用比离体器官或组织作用显著，这与生长素不同。2GA3有刺激器官生长的作用，但抑制器官的发生。3GA3可刺激植物体内生长素的生物合成。（三）细胞分裂素1.对细胞分裂与分化，以及细胞的增大有促进。2.可解除顶端优势，促进侧芽生长。3.可减少叶绿素分解、延缓叶片衰老。4.对根的生长起拟制作用。生长调节物质的使用溶剂1水中直接溶解困难。IAA、NAA、IBA、2,4-D、GA3可先用少量95%酒精溶解，再加水；KT、BA等则可用0.11 N的HCl溶解，再加水。2也可配制母液，低温贮存使用，用量极微，一般用mg/L表示。* 使用量* 1一般生长为0.0510 mg/l。细胞分裂素0.0520 mg/l 。* 2生长素和细胞分裂素的比例决定着发育的细胞类型，愈伤组织再分化是长根或长芽。* 生长素/细胞分裂素 低 促进芽形成* 生长素/细胞分裂素 高 促进根形成第四节 组织培养技术一 Steps of Micropropagation* Stage 0 Selection & preparation of the mother plant* sterilization of the plant tissue takes place* Stage I - Initiation of culture* explant placed into growth media* Stage II - Multiplication* explant transferred to shoot media; shoots can be constantly divided* Stage III - Rooting* explant transferred to root media* Stage IV - Transfer to soil* explant returned to soil; hardened off二 外植体灭菌1. 过程2. 材料与前处理3. 灭菌强度 药剂种类与消毒处理时间三、组织培养过程中的变异现象（一） 现象Somaclonal Variation: variability in plants regenerated from tissue culture that is either induced or uncovered by a tissue culture process. Most somaclonal variation is negative, but if enough plants are examined, positive changes can usually be recovered.* The source for most breeding material begins with mutations, whether the mutation occurs in a modern cultivar, a landrace, a plant accession, a wild related species, or in an unrelated organism* Total sources of variation: * Mutation, Hybridization, Polyploidy* Somaclonal variation is a general phenomenon of all plant regeneration systems that involve a callus phase* There are two general types of Somaclonal Variation:* Heritable, genetic changes (alter the DNA)* Stable, but non-heritable changes (alter gene expression, AKA epigenetic)* Since utilizing somaclonal variation is a form of mutation breeding, we need to consider mutation breeding in more detail Inducing Mutations* Physical Mutagens (irradiation)* Neutrons, Alpha rays* Densely ionizing (“Cannon balls”), mostly chromosome aberrations* Gamma, Beta, X-rays* Sparsely ionizing (“Bullets”), chromosome aberrations & point mutations* UV radiation* Non-ionizing, cause point mutations (if any), low penetrating* Chemical Mutagens (carcinogens)* Many different chemicals* Most are highly toxic, usually result in point mutations（二） 组织培养过程变异的利弊与利用* Advantages* Screen very high populations (cell based)* Can apply selection to single cells* Disadvantages* Many mutations are non-heritable* Requires dominant mutation (or double recessive mutation); most mutations are recessive* Can avoid this constraint by not applying selection pressure in culture, but you loose the advantage of high through-put screening have to grow out all regenerated plants, produce seed, and evaluate the M2* Alternative: perform on haploid cell linesDisease Resistant Success using Somaclonal Variation第五节 几种组织培养技术在园艺中应用一 胚培养（Embryo Culture）（一） Embryo Culture as a Source of Genetic Variation* Rescue F1 hybrid from a wide cross* Overcome seed dormancy, usually with addition of hormone to media (GA)* To overcome immaturity in seed* To speed generations in a breeding program* To rescue a cross or self (valuable genotype) from dead or dying plant* Hybridization* Can transfer mutant alleles between species* Can introduce new genetic combinations through interspecific crosses* Polyploidy* Can combine embryo culture with chromosome doubling to create new polyploid species (allopolyploidy)* Embryo culture developed from the need to rescue embryos (embryo rescue) from wide crosses where fertilization occurred, but embryo development did not occur;* These techniques have been further developed for the production of plants from embryos developed by non-sexual methods (haploid production discussed later)（二）胚抢救 （Embryo Rescue Process）* Make cross between two species* Dissect embryo (usually immature)* The younger the embryo, the more difficult to culture* Grow on culture medium using basic tissue culture techniques, use for breeding if fertile* Many times, resulting plants will be haploid because of lack of pairing between the chromosomes of the different species* This can be overcome by doubling the chromosomes, creating allotetraploids* Polyploids are another source of genetic variation （三）幼胚离体培养的生长发育方式1.胚性发育(embryonal development)：2.早熟萌发(early mature sprouting)（四） 胚抢救应注意的几个因素1 培养时期 l 自养（autotrophy）l 异养（heterotrophy）活体内胚带胎座的胚珠胚珠退化或败育胚 2. 培养基和培养条件 3. 碳水化合物4. 激素种类和水平 5. 温度 两步培养法二 胚乳培养 （Endosperm culture）（一） 概况：胚乳培养始于1933年，进行玉米胚乳培养。胚乳培养研究主要集中探讨以下问题：1、胚乳细胞全能性：在离体培养条件下，胚乳细胞是否与其它体细胞和花粉一样，具有全能性而再生植株。2、多数被子植物胚乳是三倍体，能否通过胚乳培养获得三倍体植株而得到无籽结实；通过胚乳培养，探索改良农林、园艺植物三倍体育种技术的可能性。3、研究离体培养条件下胚和胚乳的关系。迄今已有40多种植物进行胚乳培养。苹果、柚、甜橙、檀香、枸杞、猕猴桃、玉米、大麦、小黑麦、水稻、马铃薯、梨、核桃等胚乳培养再生了植株。三 花药和花粉培养（一） 图示流程（二） Anther/Microspore Culture Factors* Genotype* As with all tissue culture techniques* Growth of mother plant* Usually requires optimum growing conditions* Correct stage of pollen development* Need to be able to switch pollen development from gametogenesis to embryogenesis大多数园艺作物花粉培养适宜的时期为盛花期、处于单核中期至晚期的花粉（单核靠边期）* Pretreatment of anthers* Cold or heat have both been effective* Culture media* Additives, Agar vs. Floating（三） 花粉培养方法有二种方法，* 一种是将接种的花药在培养基上预培养数天，然后将花粉分离出来进行悬浮培养，小孢子便可以启动发育；* 另一种 取出经消毒处理的花蕾中的花药，放在加有45ml的液体培养基的小烧杯中。用玻棒或镊子挤压花药，使花粉从花药中释放出来。再根据不同植物花粉粒的大小，选用孔径大小合适的尼龙网（孔径2060m）过滤，除去药壁组织。过滤后的花粉液再经低速离心（100160r/min）3min，将沉淀用新鲜培养期稀释，重复两次，可得到较纯净的花粉群体。然后将花粉进行悬滴培养和液体浅层培养。 （四）花粉培养的培养基* 基本培养基 MS、Nitsch、White和N6、NLN、B5等，其中花粉培养以MS、Nitsch或White最为常用* 碳源 以蔗糖效果较好，一般花药培养蔗糖浓度为6%10%，花粉培养则要求13%左右，不同植物种类品种所需蔗糖浓度有些差异。* 生长素和细胞分裂素比较常用，一般低浓度的生长素类物质可提高胚状体的诱导率而高浓度则易使胚状体发生愈伤组织化和使单细胞倍性复杂化。 作业布置；* 概念：组织培养、体细胞无性系变异、外植体、愈伤组织、胚状体、细胞全能性、离体保存等* 简答题：* 简述组织培养室的基本设施；* 简述培养基配制的基本流程、应注意哪些方面？* 简述组织培养技术主要有哪些应用？课后自我总结分析该章是本课程的重点，是同学们毕业后可以应用的最基础技术；除技术外，同学们对基本建立起一个组培实验室也很有兴趣。注：板书设计可在授课进程中直接用横线、浪线等标示出。华中农业大学教案（课时备课） 第 6-7 次课 4 学时课目、课题（章节）第三章 原生质体培养与体细胞融合主要参考资料l 邓秀新 胡春根主编 园艺植物生物技术 高等教育出版社 2005。l H.S.Chawla 植物生物技术导论(许亦农 麻密 译) 化学工业出版社l 肖尊安 植物生物技术 化学工业出版社教学目的和要求通过本次学习，要求同学们掌握原生质体操作的意义、基本步骤及应用，体细胞杂交的概念、融合方法方式、在育种中的应用。重 点难 点原生质体分离培养步骤、主要应用；原生质体培养方法。原生质体融合方法/方式、主要应用；体细胞杂种的遗传鉴定。教学进程（含教学内容、教学方法、 辅助手段、师生互动、学时分配、板书设计）第一节 原生质体培养一、原生质体研究概况（一）原生质体的概念* Protoplast (原生质体): a naked cell without cell wall* Sub-protoplast (亚原生质体):incomplete protoplast with or without nucleus* Nucleo-plast (核质体): nuclear protoplast with little cytoplasm (由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体，即小原生质体) (Miniprotoplast)* Micro-protoplast: protoplast with one or a few chromosomes* Cytoplast (胞质体): enucleated protoplast (不含细胞核而仅含部分胞质的原生质体) (二) 原生质体研究进展Key achievements in plant PP research1880, protoplast was first used by Hanstein1960, PP isolation from tomato root by enzyme incubation by Cocking1971, mesophyll PP plant regeneration in tobacco by Takebe1981, embryogenic PP plant regenration by Vardi in Isreal1985, First Rice PP plant regeneration by Fujimura1986, single PP culture & plant regeneration in Rapeseed by SpangenbergFact sheet in plant PP researchIn Horticultural crops, citrus ranks first in PP research.PP plant regeneration succ