微生物病理技能训练教程.docx

目 录
第一部分 微生物病理基础知识 1
1－1 鞭毛菌亚门及其所致病害的特点 1
1－2 接合菌亚门及其所致病害的特点 3
1－3 子囊菌亚门及其所致病害的特点 4
1－4 担子菌亚门及其所致病害的特点 7
1－5半知菌亚门及其所致病害的特点 8
第二部分 微生物病理实验基本操作 9
2－1 植物病理徒手制片技术 9
2－2 培养基的配制和灭菌 11
2－3 植物病原菌的分离和培养 15
2－4 真菌孢子的萌发 18
2－5 植物病原物的接种 20
2－6植物病原生物绘图技术 21
第三部分微生物病理技能训练 23
实训一 植物病原细菌观察 23
实训二鞭毛菌亚门真菌及其所致病害症状观察 25
实训三　接合菌亚门真菌及其所致病害症状观察 29
实训四子囊菌亚门真菌及其所致病害症状观 30
实训五 担子菌亚门真菌及其所致病害症状观察 35
实训六 半知菌亚门真菌及其所致病害症状观察 38

微生物病理技能训练教程
第一部分 微生物病理基础知识
1－1 鞭毛菌亚门及其所致病害的特点
1、鞭毛菌亚门的主要特点
(1)鞭毛菌亚门真菌的共同特征是无性产生具1-2根鞭毛的游动孢子，因此通常称作鞭毛菌。
(2)鞭毛菌有性产生休眠孢子囊和卵孢子。
(3)鞭毛菌营养体从原质团到无隔菌丝体，属低等真菌。
(4)鞭毛菌大多具有水生习性，因此只有在高湿、多雨、低洼积水和通风透光不好的条件下，侵染植物导致病害。
(5)鞭毛菌繁殖时，有的整个营养体全部转变为繁殖体，称为整体产果，如壶菌；有的只是营养体的一部分转变为营养体，称为分体产果。
(6)游动孢子囊形态多样，均可释放游动孢子。
(7)游动孢子具1-2根鞭毛。鞭毛有茸鞭和尾鞭两种。每个游动孢子具单鞭或双鞭两种类型。
(8)鞭毛(Flagellum)的结构是9+2型。既鞭杆是由9根纤丝组成一个圆筒型体，圆筒型体中心还有2根纤丝。纤丝之间填充有胶质鞘。共31条亚纤丝。
2、鞭毛菌亚门的致病特点
(1)常见症状：腐烂、斑点、猝倒、流胶。
(2)果实上腐烂使果变褐色、呈软腐状，病部长出白色绵毛状或灰白色霜状霉层。
(3)茎基和根部被害使皮层变褐色腐烂。
(4)叶上斑点，若由疫霉引起，病斑较大，暗褐色圆形水渍病斑；若由霜霉引起，病斑较小，黄色至褐色，边缘不明显，病斑受叶脉限制呈多角形，后期在病斑上长出白色至灰白色霜状霉层。
(5)病菌以卵孢子越冬，由孢子囊和游动孢子引起初侵染和再侵染，借雨水和气流传播。
(6)潜伏期短，可多次再侵染，一般在低温多雨潮湿多雾、昼夜温差大的气候条件下，病害容易发生。
3、与园艺植物有关的鞭毛菌
(1)根肿菌属（Plasmodiophora）
由根肿菌属的病菌引起的，在病组织内这些呈鱼卵状排列的是病菌的休眠孢子囊。休眠孢子囊在寄主细胞内分散呈鱼卵块状，萌发时产生前端有2根鞭毛长短不一的游动孢子。休眠孢子囊对不适宜的环境适应性强，能在土中存活多年，是病菌的初侵染源。
（2）腐霉属（Pythium）
①腐霉是低等的鞭毛菌，无性繁殖在菌丝顶端形成孢子囊，孢子囊近球形或不规则形，成熟后一般不脱落，萌发时产生游动孢子。
②有性繁殖在藏卵器内形成一个卵孢子。
③如引起黄瓜、茄子等幼苗瘁倒病的病菌，都属于腐霉属。
(3)疫霉属（Phytophthora）
①孢子囊在孢囊梗上，孢囊梗无限生长。
②孢子囊卵圆形，成熟时脱落，萌发时产生游动孢子，或直接萌发长出芽管。
③有性生殖在藏卵器内形成一个卵孢子。
(4)霜霉科（Peronosporaaceae）
①高等的鞭毛菌，都是植物体上的活体寄生菌，菌丝蔓延在寄生的细胞间，以吸器伸入寄主的细胞内吸收养分。
②孢囊梗有限生长，呈树枝状分枝。
③孢子囊在孢囊梗上形成，孢子囊卵圆形，顶端乳头状突起，萌发产生游动孢子，或直接长出芽管。
④有性生殖形成卵孢子。
(5)白锈菌属(Albugo)
①活体寄生物，菌丝在寄主细胞间蔓延，以吸器伸入寄主细胞内吸收营养。
②孢囊梗 不分枝，短棍棒状，密集在寄主表下，排列成栅栏状，每一孢囊梗 顶端串生孢子囊。
③孢子囊椭圆形，成熟后寄主表皮散出如白锈粉
④卵孢子壁厚，表面有瘤状突起。
1－2 接合菌亚门及其所致病害的特点
1、接合菌亚门的主要特点
（1）菌丝体无隔多核，细胞壁由甲壳质组成。
（2）无性生殖形成孢子囊，产生不能游动的孢囊孢子。
（3）有性生殖形成接合孢子。
2、接合菌亚门的致病特点
其多为腐生菌，广泛分布于土壤和粪肥中，少数为弱寄生菌，可引起果实贮藏期腐烂。已知接合菌亚门分2个纲、7个目、约600个种。与园艺植物病害有关的是接合菌纲、毛霉目、根霉属。
3、与园艺植物有关的接合菌
根霉菌（Rhizopus）
（1）菌丝发达，分布在基物上和基物内，有匍匐丝和假根。
（2）孢囊梗从匍匐丝上长出，顶端形成孢子囊，内生孢囊孢子，孢子囊壁破散出孢囊孢子。
（3）有性生殖形成接合孢子（不常见）。
（4）黑根霉引起贮藏甘薯软腐病。
1－3 子囊菌亚门及其所致病害的特点
1、  子囊菌亚门的主要特点
（1）营养体
全世界发现32,000种，占真菌的1/3，都是高等真菌，寄生，形态千差万别，但共同点是形成子囊。子囊(Ascus)，子囊孢子(Ascospore)。简单的仅为单细胞，但大多数有发达的菌丝体，菌丝有隔，每个细胞有一个、二个、多个核，壁以几丁质为主，营养体可以形成厚垣孢子。有的菌丝可以直接形成粉孢子，芽孢子。很多可以形成营养菌丝的组织体。
（2）子囊菌的无性繁殖
产生分生孢子或孢子器，非常发达，形状多样，圆形，卵形，棒形，丝状，镰刀形(新月形)，蜡肠形，有单孢，双孢，多孢。有的有色，有的无色。
分生孢子梗：可以分枝或不分枝，散生，丛生，束生，(孢梗束Coremium)，有的分生孢子梗着生在简单的分生孢子痤上(Sporodochium)，有的形成在分生孢子盘上(Acervulus)，有的形成分生孢子器上(Pycnidium)。
分生孢子作用：在一个生长季可以反复发生，是再侵染的来源，“可以远距离传播”，有的高等子囊菌在一生中仅发生无性，无有性。
（3）子囊菌的有性繁殖
①子囊：子囊形状有圆形，椭圆形或棒状。子囊壁有的单层壁，有的双层壁,有的囊壁成熟后溶解，有的不溶，有的子囊顶有孔口，有的无孔口。子囊有的单个散生，有的多个并列，有的丛生。子囊之间的有的有侧丝。
②子囊孢子（Ascospore）：形态多种多样，圆形，椭圆形，丝状，单胞，双胞，多胞，无色或有色。在子囊内排列的有散生，单列，双列，并列，螺旋形排列。
③子囊果（Ascocarp）：在子囊外部具一菌组织包被的壳，这种类型的子实体称子囊果。
子囊果的类型
A、 闭囊壳—完全封闭呈球形。
B、子囊壳—球形或瓶状，顶端有孔口。
C、子囊盘—盘状或杯状，顶端开口大。
D、子囊座—子囊着生在子座的空腔内。
2、  与园艺植物有关的子囊菌
(1)外囊菌属（Taphrina）
无子囊果，子囊平行排列在寄主表面呈栅状。无性繁殖是子囊孢子在子囊内芽殖产生芽孢子，芽孢子还可继续芽殖。常见病状：畸形，叶片皱缩、果实膨大等。
(2)白粉菌目 (Eryshiphales)
①  白粉菌目的真菌一般称作白粉菌，引致各种植物白粉病(Powdery mildew)。
②  菌丝白色，大都表生，产生吸器吸取植物营养。
③  主要寄生在叶片上，有的发生在新梢或芽上。在病部形成白粉或小黑点。
④ 无性世代：非常发达，由菌丝形成分生孢子梗和分生孢子。分生孢子链生或单生，不断产生。形成白粉。
⑤ 有性世代：寄生后期在菌丝的上部形成闭囊壳(小黑点)，有附属丝，便于传播。闭囊壳内有一个或多个子囊，子囊内有2-8个子囊孢子，子囊孢子单孢无色。
⑥ 寄生专化性：专性寄生，有生理小种，寄主有8435种。有的白粉菌只有一种寄主，而一种寄主可寄生多种白粉菌。如：桑树有桑表白粉，桑里白粉。柞树有七种白粉病。
⑦白粉病发生的条件：对温度要求不严格，干旱地区、潮湿地区都可发生，白粉菌的孢子在水中反而不易发芽或破裂，在潮湿的空气中易发芽，该孢子渗透压很高，36-68个大气压，因此很易吸收周围的空气中的水分。
⑧白粉菌分属依据：闭囊壳附属丝的形状和壳内子囊的数目。
白粉菌（闭壳菌）：菌丝以吸器吸收营养；子囊着生在闭囊壳内，外部有附着丝；菌丝分化成分生孢子梗，顶端串生分生孢子，呈白粉状故名白粉菌。
(3)核菌
①主要特点
A、这类真菌种类多，形态变化大，子囊着生在具有孔口的子囊壳内。
B、子囊壳散生或聚生在寄主的组织中，子囊内具8个子囊孢子。
C、病害流行是分生孢子多次再侵染。
D、病害症状：引起树皮腐烂、溃疡、瘤肿和枝枯；侵害果实引起腐烂和轮纹等症状。
②主要种类
A、小丛壳属 Glomerella
子囊壳小，球形，半埋生在子座内；子囊棍棒状，无侧丝；子囊孢子单孢无色，长椭圆形，稍弯曲。有性世代在自然界很少发生，无性世代为炭疽菌属(Colletotrichum)。如棉花炭疽病G.gossypii，苹果梨炭疽病G.cingulata。
B、黑腐皮壳属 （Valsa）
子囊壳埋生子座基部，有长颈伸出子座；子囊孢子腊肠状，单胞无色或暗色。无性世代是壳囊孢属(Cytospora)。只能为害树皮，不能为害绿色部分。苹果树腐烂病。
C、囊孢壳属（Physalospora）
无子座。子囊壳黑色，埋生于寄主组织内。子囊较大，棍棒状，子囊孢子单胞，无色，长度一般大于20um.引起园艺病害如梨轮纹病等。
D、间座壳属（Diaporthe）
子囊壳埋生在子座基部，梨形或球形，黑色，顶端有短喙状突起。子囊圆柱形，有顶环。子囊孢子线形多胞。无性世代不发生。如引起茄褐纹病。
（4）腔菌
①主要特点
A、子囊着生在子座的空腔内，子囊间无侧丝，子囊具双层壁 。
B、无性生殖发达，可形成各种形态的分生孢子，对植物危害主要是分生孢子侵染。
C、病害症状：斑点、疮痂和腐烂。
②主要种类
A、痂囊腔菌属 Elsinoe
子囊在子囊腔中不规则散生，每个子囊腔只有一个球形子囊，子囊孢子长圆筒形，3隔4胞、无色。为害植物主要是无性世代，在分生孢子盘上产生分生孢子。(痂圆孢属Sphaceloma)我国有性世代未发现，主要无性。代表：葡萄黑痘病。球座菌属Guignardia
B、球座菌属Guignardia
本属与上属形态基本一致，本属子囊孢子单胞（假双孢）。无性世代很发达，包括在叶点菌属和茎点菌属。葡萄黑腐病菌G.biwellii，葡萄房枯病菌G.baccae。
C、球腔菌属 Mycosphaerella
子囊座着生在寄主叶片表皮层下；假囊壳为埋生、球形，或扁圆形，孔口扁平或呈乳头状突起。子囊孢子椭圆形、无色，双胞大小相等。无性世代包括许多属，如叶点菌属Phyllosticta，茎点菌属Phoma，尾孢属Cercospora。代表：禾本科植物黑霉病
D、黑星菌属Venturia
假子囊壳很小，表面生有刚毛，埋生或表生。子囊孢子椭圆形，双胞大小不等，淡色，个别褐色，可为害植物叶片和果实。无性黑星孢Fusicladium
代表病害：梨黑星病V.pirina 苹果黑星病V.inaequelis
（5）盘菌
①子囊果呈盘状或杯状，内生子囊。②子囊盘有些从菌核或假根菌核上长出，
③盘菌一般很多不产生分生孢子。④盘菌引起植物病害大多腐生，少数寄生。
核盘菌属 Sclerotinia
菌丝体可以形成菌核（真菌核和假菌核），菌核萌发后可形成长柄子囊盘，子囊棍棒状，平行排列，有拟侧丝。子囊孢子椭圆形或仿缍形，单胞无色。无性世代不发生。
寄主范围很广，可侵染32科160多种植物。代表：油菜、向日葵菌核病
1－4 担子菌亚门及其所致病害的特点
1 锈菌
①胶锈菌属（Gymnosporangium）
冬孢子双细胞，有可以胶化的长柄。没有夏孢子阶段。梨锈病（G. haraeanum ）冬孢子阶段在桧柏上，性孢子和锈孢子在梨树上引起梨锈病。
②柄锈菌属(Puccinia)
孢子双细胞、有柄，夏孢子单细胞，小麦锈病：小麦秆锈病( P. graminis )；小麦条锈病(P. striiformis )；小麦叶锈病( P. recondite f.sp tritici)。
③层锈菌属（Phakopsora）
冬孢子单细胞，无柄，不整齐地排列成数层；夏孢子表面有刺。[枣层锈菌（P. ziziphi-vulgaris ）引起枣树锈病]。
④多胞锈菌属（Phragmidium ）
冬孢子3至多细胞，壁厚，表面光滑或有瘤状突起，柄的基部膨大。[玫瑰多胞锈菌（P. rosae-multiflorae ）引起玫瑰锈病]。
⑤单胞锈菌属（Uromyces ）
冬孢子单细胞，有柄，顶壁较厚；夏孢子单细胞，有刺或瘤状突起。[瘤顶单胞锈菌（U.appendiculatus）引起菜豆锈病]。
⑥栅锈菌属（Melampsora）
冬孢子单细胞，无柄，排列成整齐的一层；夏孢子表面有疣或刺。[亚麻栅锈菌（M.lini）引起亚麻锈菌病]。
（2）黑粉菌目（Ustilaginales）
以双核菌丝在寄主的细胞间寄生，有吸器伸入寄主细胞内。典型特征是形成黑色粉状的冬孢子。黑粉菌分类主要以冬孢子的形状、大小、有无不孕细胞、萌发的方式及冬孢子球的形态等。引起园艺植物的病害有：茭白黑粉病、慈。
3）层菌
病原菌特征：具较发达的担子果，大多腐生，少数是植物病原菌。担子果如膏药状、马蹄状、伞状。层菌常产生有性孢子，很少产生无性孢子。病害主要通过土壤中的菌核、菌丝或菌索进行传播和蔓延。层菌是弱寄生菌，经伤口侵入到果树的根部或枝干的维管束，主要破坏木质部，造成根腐或木腐。
1－5半知菌亚门及其所致病害的特点
1、半知菌亚门的主要特点
常见的有4种：
（1）分生孢子梗束（synnema）：呈束状，基部聚生在一起，顶部分散，着生孢子。
（2）分生孢子座（sporodochium）：很短的分生孢子梗聚集而成，垫状或瘤状，其上产生分生孢子。
（3）分生孢子器（pycnidium）：分生孢子器（pycnidium）：球形、近球形、瓶状或不规则形的子实体，具孔口，孢子梗聚生其内。
（4）分生孢子盘（acervulus）：菌丝纠结形成盘状的子实体，有的分生孢子盘中央或四周具深褐色的刚毛。
3、  与园艺植物有关的半知菌
(1)丛梗孢菌
①粉孢属(Oidium)
分生孢子梗直立。顶部产生菌键型的分生节孢子(粉孢子)。分生孢子串生，单胞无色。引起白粉病，为白粉菌的无性阶段 [橡胶粉孢(O.heveae )引起三叶橡胶树的白粉病]。
②轮枝孢属(Verticillium)
分生孢子梗轮状分枝，产孢细胞基部略膨大；分生孢子为内生芽殖型，单细胞，卵圆形至椭圆形，单生或聚生。〔黄萎轮枝孢(棉黄萎病菌V.albo-atrum )引起棉花黄萎病〕。
③青霉属(Penicillium )
分生孢子梗直立，顶端一至多次分枝，形成扫帚状。分枝顶端产生瓶状小梗，小梗顶端产生成串的分生孢子，分生孢子球形、单孢。[指状青霉病菌（P.digitatum ）引起柑桔绿霉病]。
④葡萄孢属(Botrytis )
分生孢子梗无色，顶端细胞膨大成球形，上面有许多小梗；分生孢子单胞，无色，椭圆形，着生小梗上聚集成葡萄穗状。[灰葡萄孢(B.cinerea)引起多种植物灰霉病。]
⑤褐孢属(Fulvia )
分生孢子梗黑色，顶端或中部形成分枝，分生孢子黑褐色，卵圆形、圆筒形或不规则形引起的病害如番茄叶霉病、黄瓜黑星病等。
⑥尾孢属（Cercospora）
分生孢子梗屈膝状，青褐色至黑褐色，分生孢子多细胞，线形、鞭形至蠕虫形。如花生褐斑病、菜豆红斑病、豇豆煤霉病等。
⑦链格孢属(Alternaria )
分生孢子梗深色，顶端单生或串生淡褐色至深褐色、砖隔状的分生孢子。分生孢子倒棍棒形、椭圆形或卵圆形，顶端有喙状细胞。[大孢链格孢(A. macrospora )引起棉花轮纹斑病]。
⑧镰孢霉属(Fusarium )
大型分生孢子多细胞，镰刀型；小型分生孢子单细胞，椭圆形至卵圆形。麦类赤霉病，瓜类枯萎病。
（2）黑盘孢菌
黑盘孢目真菌的分生孢子梗产生在分生孢子盘上。有的分生孢子盘四周或分生孢子梗之间具有黑色的刚毛。黑盘孢目真菌引起的病害如苹果褐斑病、苹果、辣椒、茄子、黄瓜棉花等的炭疽病等。
（3）球壳孢菌
分生孢子器球形，暗褐色，分生孢子单胞，无色，圆柱形至纺锤形。分生孢子着生在分生孢子器内。引起的病害如苹果树腐烂病、梨干腐病、苹果及梨轮纹病、棉花褐斑病、芹菜斑枯病、茄子褐纹病等。
（4）无孢菌:除产生厚垣孢子外，不产生任何其它孢子。只有菌丝体，有时可形成菌核。
第二部分 微生物病理实验基本操作
2－1 植物病理徒手制片技术
一、实验目的
观察植物病害病原物的形态，进行病原物的分类鉴定，研究受病组织的组织结构病变，受病植物组织与病原物的解剖学关系以及对于难得一见病原物的保存备用等，都需将材料制成适当的显微玻片标本。因此，徒手制片技术也是植物病理学研究的重要手段之一。通过本次实验系统学习实践常用的徒手制片技术，为普通植物病理学和农业植物病理学的深入学习以及以后开展病理学的有关研究工作奠定坚实的制片技术基础。
二、内容、材料和方法
徒手制片的方法有整体封藏法、徒手切片法、组织透明制片法和涂抹制片法等多种。限于时间本实验实践最为常用的整体封藏法和徒手切片法两种。
(一)整体封藏法
对于生长在植物病部表面或培基上的菌丝体、分生孢子、分生孢子梗和其他孢子器官以及线虫等，可直接择取少许封藏在适当的浮载剂中，在显微镜下观察，根据材料的特点和观察的目的可采用不同的方法封藏制片。常用的方法的概括为挑、刮、拨、撕四种。
1挑：对于在植物受病部位或基质表面生长繁茂的霉状病原体(如霜霉菌)粉状病原体(如锈菌、白粉菌)以及培养基上的许多培养菌，可用尖细的解剖针等直接挑取封埋制片，挑取病原体的量，在保证选材典型的前提下，越少越好，以免互相重叠，分辩不清。
取黄瓜霜霉病叶，小麦白粉病叶分别挑取霉状物和粉状物镜检病原菌的形态特点。
2刮：对病部病原体稀少，或用放大镜也难辩认霉层的病害标本，可采用两侧具刀的三角刮针(或可用刀片代替)刮取病原物制片。刮的方法是，用刮针的一刃，蘸浮载剂少许，在病部顺同一个方向刮取2—3次，将刮得的病原蘸在载玻片的浮载剂中封片镜检。浮载剂在保证浮载质量的前提下要尽量少，否则少量的病原体在大滴的浮载剂中极易分散漂流，在显微镜下难以寻找。取玉米小斑病叶，在病斑背面刮制片，镜检分生孢子梗和分生孢子的形态。
3拨：对于产生在植物表皮下或半埋生于基物内的病原体孢子器官。如子囊壳、分生孢子器、闭囊壳等，可将病原体连同寄主组织一同拨下，放入浮载剂中，用两支解剖针，一支稳定材料，另一支拨出植物组织，使病原体外露制片。取小麦全蚀病或白粉病标本，拨小黑点制片，镜检子囊果的形态。
4撕：对于寄生在植物表皮细胞上的病原真菌，也可以将此有病原物的表皮撕下来制片镜检，这种方法不仅能看到病原物形态，而且可以观察病原物与寄主的解剖学关系。
在毛毛雨天自田间取回感染白粉病的麦苗(或在保温箱中取接种染病的麦苗)。用刀片割破叶背表皮再用小镊子轻轻撕下，放在浮载剂中制片镜检白粉病菌分生孢子梗、分生孢子和吸器形态。
(二)徒手切片法
欲观察受病组织病变，病菌侵入和寄主体内扩展过程，以及埋生在基物内真菌子实体的形态结构等，都需将有关材料切成薄片，进行镜检，徒手切片是最常用的简便易行的方法，不需要特殊的设备，而且节省时间，切成的片子不仅可作临时观察，也可进一步制成永久性玻片标本。
徒手切片的基本用具是剃刀或刀片。切片时先选取材料并作适当的修整，以左手的食指和姆指捏住材料，中指顶住材料下端，使材料上端突出于手指以上2—3毫米。右手握稳刀，从左向右后方斜向切割。注意刀口必须以材料面垂直。否则所得切面不正。同时双手不应紧靠身体，而是要活动自如。用臂力均匀地沿刀口后部起拉向前方，连续切割4—5片后，用毛笔蘸水轻轻沿刀口取下，放入盛有水的浅玻皿中，在此过程中左手握着的材料不要放下，否则再切时难按原位置拿材料，此外，在切片过程中，必须常用毛笔蘸水湿润材料，以免材料干涸不便切割。
对于过于柔软或较薄的材料，可以夹在“夹持物”中，进行切片更为方便。新鲜胡鲜卜和马铃薯块都可作“夹持物”用。实验室中通常将通草、接骨木或向日葵的茎髓，剪成适当大小，浸于70%酒精中备用。
切割一定数量的薄片后，用移置环在浅玻皿中选取合用的材料薄片，放在载玻片的水滴中，镜检合格者即酒精灯上将水烘干并摆正材料，然后加一滴乳酚油或其浮载剂；放在展片台上略加热，镜检如无气泡，即可小心加盖片，用吸水纸吸除多余的浮载剂，最后贴好标签，平放于切片板上，待干燥适宜时封固。
徒手切片的缺点是对于微小或过大，柔软、多汁、肉质及坚硬的材料不易切取，也难制成连续切片，此外切片的厚薄也难一致。切片机切片即可克服这些缺点。
三、作业和思考题
1每人交两片符合质量要求的玻片标本。
2整体封藏法和徒手切片法两种基本徒手制片技术都在什么情况下使用? 徒手切法制片有什么优缺点? 怎样解决这种方法本身存在的问题?

2－2 培养基的配制和灭菌
一、 实验目的
微生物的生长发育都有一定的营养需要，培养基即人工培养微生物、为其生长发育提供所需营养的基质。培养基配好后必须经过灭菌方能用于分离培养微生物试验，因此培养基的配制和灭菌是植物病理实验室中最基本的工作，通过本次实验学习植病实验室中常用培养基的配制方法和高压灭菌锅的使用方法。
二、内容、材料和方法
(一)培养基的配制
培养基按组成成分及对这些成分了解的程度分为天然培养基、半组合培养基和组合培养基三类从物理性质上又分为液体培养基和固体培养基两类，培养基的种类不同，配制方法也有差异，限于时间，本次实验仅配制马铃薯琼脂培养基和牛肉膏蛋白胨培养基。
1马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）
这是植病实验室最常用的培养基(简称PSA)，主要用于植物病原真菌的分离和培养，有时也用于植物病原细菌。
成分：马铃薯200克 蔗 糖 10克
琼 脂 20克 加水至1000毫升
方法：将马铃薯洗净去皮切块，加水煮沸半小时，用双层纱布滤去薯块，补足水量，加入琼脂，加热熔化，再加糖，待完全化后，乘热用双层纱布过滤分装，塞好棉塞高压灭菌。
马铃薯蔗糖琼脂培养基略带酸性，培养真菌无需调节pH，培养细菌则调节pH至中性，此培养基留作下次实验分离培养病原真菌用，故不必调节pH。
5人分作一组，1、2组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约10毫升，灭菌后摆成斜面；其余300毫升，分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善保存，留待下次实验使用。
2牛肉膏蛋白胨培养基（NA）
这种培养基主要用于细菌的分离和培养
成分：牛肉浸膏 3克 蛋白胨 10克 蔗糖 10克
酵母浸膏 1克 琼脂 20克 加水至 1000毫升
方法：先将琼脂加热熔化于大部水中，再将其它各成分用少量水化开加入，调节pH至7，趁热用双层纱布过滤，分装，塞棉塞高压灭菌。
牛肉浸膏和酵母浸膏十分粘稠，不易称重，称重时用小烧杯盛装，以玻璃棒沾取，故要先称好杯和棒的重量后，再开始沾取浸膏称重，称后将杯和棒上粘着的浸膏洗净于锅中。
调节培养基pH至中性的方法如下：配成1N的HCl和NaOH，并另分别稀释配成1/20 N的HCl和NaOH。取培养基2毫升，加蒸馏水7.5毫升，加指示剂溴百里酚蓝指示剂5滴，这时如培养基的测样呈黄色则用有刻度吸管加入1/20 N的NaOH若呈蓝色则加入1/2O N的HCl，使培养基最后呈草绿色即调节到中性，此刻所加酸或碱的毫升数的25倍即等于在1000毫升培养基中所需要加入lN 的NaOH或HCl的毫升数(注意这次是作500毫升培养基)，加
蒸馏水稀释的目的防止调节过程中培养基凝固。
调节pH至中性的简便方法是用石蕊示纸。也可以用多孔白色瓷板，在孔中加少量培养基和溴百里酚蓝或其它指示剂1—2滴，根据颜色反应，在所配的培养液中加入少量lN的NaOH或HCl，然后再取样测定，如此反复多次，达到所需求的反应为止。
5人分为一组，3、4两组各作此培养基500毫升，其中200毫升分装试管，每管约100毫升，灭菌后摆成斜面，其余300毫升分装在3个250—300毫升的三角瓶中，每瓶装100毫升左右，灭菌后妥善存放，留待下次实验使用。

图： 培养基的分装装置与棉塞。
A. 培养基的分装 1.正确 2.管内太短，外部太松
B. 棉塞的做法 3.整个棉塞太松 4.管内太紧，外部太短松
此外，1、2、3、4各组均制备15管试管装和2瓶三角瓶装的无菌水。
(二)培养基的灭菌
为了得到某种病原物的纯培养，配好的培养基必须经过灭菌才能使用，灭菌是指用物理或化学方法完全杀死器物表面及其内部的所有微生物，灭菌与消毒的概念不同，消毒则是指消灭器物或植物组织表面的某些微生物(能常称杂菌)，而不是消灭所有的微生物。
灭菌的方法很多，植病实验室常用的有干热灭菌和高压蒸汽灭菌两种方法，一般培养皿、吸管等玻璃仪器用干热灭菌法进行灭菌。而培养基和实验用的土壤，则用高压蒸汽灭菌法进行灭菌，具体灭菌方法和步骤如下：
1干热灭菌法
(1)将培养皿、吸管等玻璃器皿洗净干燥后，用旧报纸包好，或装入特制的铁筒中(每个吸管用纸包好后装入铁筒)，包纸时应将吸取的一端放在取时先折开的一端，以便取用时手勿触及要求灭菌的一端。
(2)将包装好的玻璃仪器摆入电热烘箱中，彼此间留有一定的空隙以便流通空气。
(3)关紧箱门，打开排气孔接上电源。
(4)待箱内空气排出到一定程度时，闭上排气孔，继续加热至一定温度后，用定温固定温度，灭菌温度一般165℃—175℃保持1小时即可。
(5)待自然降温冷却后(60℃以下)才能开门取出玻璃器皿，避免由于温度突然下降而引起玻璃器皿碎裂。
2高压蒸汽灭菌法
高压蒸汽灭菌法又称湿热灭菌，它的原理是利用高压来提高蒸汽的温度，达到灭菌的目的，其操作步骤如下：
(1)关好排水阀门放入清水至标度为止，注意水量一定要加足，否则容易造成事故。
(2)将要灭菌的培养基、灭菌水等装入铁丝笼中，并用牛皮纸盖好后放入灭菌锅中，关上器盖，旋紧螺旋时，先将每个螺旋旋转到一定程度(不要太紧)，然后再旋紧相对的两个螺旋，以达到平衡旋紧，否则易造成漏气，达不到彻底灭菌的目的。
(3)通电加温，同时打开排气活门，排尽锅内的空气，即活门冲出的全部是蒸气时则表示彻底，此时可关闭排气活门，如果过早关闭活门，排气不彻底，也达不到彻底灭菌的目的。通常当压力表指针升至5磅时，打开排气活门放气，降至零点，再关闭活门。
(4)压力表的指针上升时，锅内温度也逐渐升高，当压力表指针升至15磅时，蒸气温度相当于120℃—121℃(等于一个大气压)，此时开始计算灭菌时间，控制热源，使处于15磅压力保持30分钟，即能达到完全灭菌的目的，然后停止加温。
(5)稍微打开一点排气活门，使锅内蒸气缓慢排除，然后逐渐开大活门，气压徐徐下降，注意勿使排气过快，否则会使锅内的培养基沸腾而冲脱或沾湿棉花塞，但排气太慢又使培养基在锅内，受高温处理时间过长，这样对培养基也是不利的。一般从排气到打开锅盖以10分钟左右为好。
(6)当压力表指针降到零、锅内蒸气完全排尽时，打开锅盖取出培养基，如需制备固体斜面培养基时，则应趁热将试管斜放在桌上，上面盖上报纸以免落灰尘，冷却后便可收起。 (7)最后将高压灭菌器内的剩余水排出。
(8)抽取上述灭菌的培养基，放入25℃温箱中，48小时后不见杂菌生出，便证明培养基已达到灭菌目的，可以使用。
此外，有些培养基在经高压灭菌后，其营养成分容易分解而失去使用价值，此时可采用间歇蒸气灭菌法，即将培养基放入高压灭菌器内，加热至100℃，保持1小时，每天灭菌一次，连续进行三次，即可达到灭菌的目的，又不至使营养物质分解。
三、思考题
1培养基有哪几种类别? 各有什么特点和用途?
2干热灭菌和高压蒸汽法适用范围如何? 电热烘箱和高压锅如何操作? 各有哪些使用注意事项?
3怎样检查培养基灭菌是否彻底?

2－3 植物病原菌的分离和培养
一、实验目的
在研究病原菌的形态、生理生态以及病原菌对寄主植物的致病性等多种试验中，常常需要病原菌的纯培养物。然而，在自然情况下，病原菌通常是与其他杂菌混生在一起的，从受病组织或其他基物中将病原菌单独分选出来，叫作分离。分离和培养是植病实验室最基本的操作技术之一。通过本次实验学习植物病原菌分离培养的原理和常用的方法。
二、内容、材料和方法
(一)分离材料的选择
分离材料的选择对分离培养的成败有着决定的影响，因为在感病植物受害部位的内外，要有多种腐生菌，为减少腐生菌的污染，分离所用的病害材料应尽可能新鲜，并且最好在病、健交接处选材取样。病、健交接处，除材料新鲜，污染的可能性小外，病原菌的生活力强、比较活跃，容易分离成功。
(二)分离方法
病原菌分离的方法因材料不同而异，植病实验室最常见的方法有组织分离法和稀释分离法两种。
1.组织分离法：这种方法适用于大部分病菌的分离，此法又分为小块组织分离和大块组织分离两种方法。分别以玉米大斑病、小麦根腐病和梨褐腐病为试材进行。
(1)叶斑病类病原菌的分离（玉米大斑病病菌的分离）
取玉米大斑病病叶，在病、健交界处剪取2—3毫米长的病组织。用10%漂白粉（次氯酸钙）溶液消毒（漂白粉溶液现用现配）3-5min，时间长短依病组织不同而异，然后直接移至PSA平板培养基上(为防止细菌污染，可在培养基中加入1000ppm链霉素10毫升)，倒置于20—25℃室温下，待菌落长出后挑取前缘菌丝，回接于PSA斜面培养基上，在25℃温箱中培养，待菌落颜色变深后，在无菌条件下镜检是否是玉米大斑病菌，弱仅有玉米大斑病菌的孢子，则说明已获得了纯培养，否则，则需要继续转至斜面培养基上进行纯化，直至获得纯培养。
(2)种子内部病原菌的分离（小麦根腐病菌的分离）
选择典型的小麦黑胚粒3—4个，在70%的酒精中浸2—3秒钟后，以镊子夹住投入0.1%升汞溶液中表面消毒2—3分钟（处理时间可自30秒至30分钟不等），然后取出小麦粒，以灭菌水冲洗3次，再移至已倒好的马铃薯琼脂平板培养基上，注意要以小麦的黑胚部位着靠在培养基上，倒置在25℃温箱中培养，待菌落长出后，挑取前缘菌丝于马铃薯斜面培养基上培养，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
(3)病组织内部病原菌的分离（梨褐腐病菌的分离）
取梨褐腐病病果沾取95%酒精，用酒精火焰三次消毒后，以在灯焰灭过菌的解剖刀在果面病、健交界处切开，挑取豆粒大小的病组织放到马铃薯琼脂平板培养基上，每皿放3—4块，倒置于25℃温箱中培养2—3天。菌丝长出后转至马铃薯琼脂斜面培养基上，培养3-4天后，无菌条件下镜检是否获得纯培养。
2.稀释分离法：稀释分离法适用于细菌、土壤菌及产生孢子多的真菌等病原菌的分离，本次实验以白菜软腐病作为材料进行分类离。
白菜软腐病最易伴生腐生细菌，分离时需以病组织接种健康菜帮上，经数次转种予以纯化，其纯化方法是将菜帮经多次换水冲洗后，再用无菌水洗三次，切成适当大小，放在15厘米直径的培养皿中，菜帮下衬以吸水纸保温。用无菌解剖刀挑取病组织少许抹在菜帮的人为伤口上，培养在20—25℃下，经1天左右呈现腐烂，如此反复转种几次，至病斑纯净为止。
分离时，在新的水烂斑边缘挑取少量病组织在无菌水试管中配成菌悬液，取灭菌培养皿3付，标好次序，其内各置无菌水1毫升，用移置环移取菌悬液一环，放在第1皿水中混合均匀，从中挑取一环稀释液至第2皿，再以同法稀释成第3皿，取熔化后冷至45℃左右的(一般将化好的培养基瓶靠近鼻尖，以不烫为度)牛肉膏蛋白胨培养基，每皿倒约15毫升，沿着桌面轻轻摇匀，凝固后倒置于26—28℃的温箱中培养，1—2日后可见白色，圆形或近圆形直径为1—2毫米的菌落，从中选典型菌落用移植环（划线法）移入牛肉膏蛋白胨斜面培养基上培养，每组转4—5管，注意过早出现的大型菌落多为腐生细菌。
以上分离实验也可以划线法进行，方法是先取两付灭菌培养皿，每皿倒入约15毫升熔化的牛肉膏蛋白胨培养基，沿桌面轻轻摇匀，制成平板，然后用移置环沾取一环稀释好的菌悬液，在第一个培养皿平面培养基的左方长方形区内划平行线5—7条，再以此移置环继续向右(和左方小区内的几条平行线成一定角度)划5—7条平行线，依此法划两皿，倒置于26—28℃温箱中培养，1—2日后挑单个典型菌落移到斜面培养基上，培养待用。
如果因季节关系难得白菜软腐病试材，则可用黄瓜细菌性角斑病、棉花角斑病、水稻白叶枯病病叶作试材进行分离培养实验。方法是取新鲜病叶，在病、健交接处取几小块病组织，以无菌水经多次换洗表面消毒后，放在比色板或凹玻片的凹窝内(凹窝要经两次酒精火焰消毒)，以吸管吸取无菌水滴入窝，并以灭菌的玻璃棒捣碎病组织，静置几分钟可得菌悬液，之后以上述划线法进行分离，注意葡萄糖对稻白叶枯病菌有抑制作用，故分离稻白叶枯病菌不能用葡萄糖配制牛肉膏蛋白胨培养基。

平板划线操作示意图
三、实验准备
(一)清洁环境：分离工作严格说应在无菌条下进行，无菌室或无菌箱是分离不可缺少的设施。若限于条件实验只能在普通房间进行时，必须对房间进行彻底扫除，清洁环境、搞好卫生。地上多洒些水，以消除室内尘埃，分离开始前准备好一切用品，避免工作过程中频繁走动，以破坏环境带来杂菌，工作台上铺好湿毛巾，点燃酒精灯。
(二)实验材料及用品准备
本次实验3-5人一组，请认真检查好下试材和用品是否齐备。
1病组织材料
小麦根腐病黑胚粒5粒。
玉米大斑病病叶1片。
白菜软腐病病帮 3块(相邻两组共用)；
梨褐腐病病果 1个(相邻两组共用)。
2用品准备
0.1%升汞溶液(广口瓶盛装)；
95%酒精(广口瓶盛装)；
1000ppm链霉素；
瓶装牛肉膏蛋白胨培养基；
瓶装马铃薯琼脂培养基；
此外，还有以下备品，无菌水1瓶，灭菌培养皿6付，灭菌1毫升吸管2支，解剖剪、解剖刀和镊子各1把，移植环，移植钩、酒精灯、珐琅盘和试管架各1个，毛巾1条，玻璃铅笔1支及火柴等。
四、思考题
1分离植物病原菌常用的方法有几种? 这些方法适用于分离哪类病原菌? 怎样分离?
2分离植物病原物时，为什么要选择新鲜病材料，并且在病健交界处取样? 没有新鲜病材料怎么办?