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摘要：随着生物技术的不断发展与成熟，基因遗传学领域研究的深入，基因治疗这一新的医学手段走进了我们的生活。它可以纠正和补偿因基因缺陷与异常引起的疾病，以人体的靶细胞为工程载体，对其基因进行基因置换或增补，使其在体内表达达到治疗目的。基因治疗可以治疗许多以往医学不能解决的问题，为癌症等绝症的治疗开辟了新天地。
关键字：生物技术；基因治疗；研究；靶细胞；癌症；

一、 什么是基因治疗
1． 基因治疗的定义
狭义的概念：
　指用具有正常功能的基因置换或增补患者体内有缺陷的基因，因而达到治疗疾病的目的。
广义的概念：
指把某些遗传物质转移到患者体内，使其在体内表达，最终达到治疗某种疾病的方法。
基因治疗（gene therapy）是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的。也就是将外源基因通过基因转移技术将其插入病人的适当的受体细胞中，使外源基因制造的产物能治疗某种疾病。从广义说，基因治疗还可包括从DNA水平采取的治疗某些疾病的措施和新技术。
2．遗传病的基因治疗的定义
遗传病的基因治疗(gene therapy)是指应用基因工程技术将正常基因引入患者细胞内，以纠正致病基因的缺陷而根治遗传病。纠正的途径既可以是原位修复有缺陷的基因，也可以是用有功能的正常基因转入细胞基因组的某一部位，以替代缺陷基因来发挥作用。基因是携带生物遗传信息的基本功能单位，是位于染色体上的一段特定序列。将外源的基因导入生物细胞内必须借助一定的技术方法或载体，目前基因转移的方法分为生物学方法、物理方法和化学方法。腺病毒载体是目前基因治疗最为常用的病毒载体之一。基因治疗目前主要是治疗那些对人类健康威胁严重的疾病，包括：遗传病（如血友病、囊性纤维病、家庭性高胆固醇血症等）、恶性肿瘤、心血管疾病、感染性疾病（如艾滋病、类风湿等）。
基因治疗是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞以纠正基因的缺陷或者发挥治疗作用，从而达到治疗疾病目的的生物医学高技术。基因治疗与常规治疗方法不同：一般意义上疾病的治疗针对的是因基因异常而导致的各种症状，而基因治疗针对的是疾病的根源--异常的基因本身。基因治疗有二种形式：一是体细胞基因治疗，正在广泛使用；二是生殖细胞基因治疗，因能引起遗传改变而受到限制。
3．基因治疗的靶细胞
基因治疗的靶细胞主要分为两大类：体细胞和生殖细胞，目前开展的基因治疗只限于体细胞。生殖细胞的基因治疗是将正常基因直接引入生殖细胞，以纠正缺陷基因。这样，不仅可使遗传疾病在当代得到治疗，而且还能将新基因传给患者后代，使遗传病得到根治。但生殖细胞的基因治疗涉及问题较多，技术也较复杂，因此，目前更多地是采用体细胞基因治疗。体细胞应该是在体内能保持相当长的寿命或者具有分裂能力的细胞，这样才能使被转入的基因能有效地长期地发挥“治疗”作用。因此干细胞、前体细胞都是理想的转基因治疗靶细胞。以目前的观点看，骨髓细胞是唯一满足以上标准的靶细胞，而骨髓的抽取，体外培养、再植入等所涉及的技术都已成熟；另一方面，骨髓细胞还构成了许多组织细胞(如单核巨噬细胞)的前体。因此，不仅一些涉及血液系统的疾病如ADA缺乏症、珠蛋白生成障碍性贫血、镰状细胞贫血、CGD等以骨髓细胞作为靶细胞，而且一些非血液系统疾病如苯丙酮尿症、溶酶体储积病等也都以此作为靶细胞。除了骨髓以外，肝细胞、神经细胞、内皮细胞、肌细胞也可作为靶细胞来研究或实施转基因治疗。
二、基因治疗的方法与技术
1、基因治疗的各种方法
(一)基因矫正
　　纠正致病基因中的异常碱基，而正常部分予以保留。
　　(二)基因置换
　　指用正常基因通过同源重组技术，原位替换致病基因，使细胞内的DNA 完全恢复正常状态。
　　(三)基因增补
　　把正常基因导入体细胞，通过基因的非定点整合使其表达，以补偿缺陷基因的功能，或使原有基因的功能得到增强，但致病基因本身并未除去
　　(四)基因失活
　　将特定的反义核酸(反义RNA、反义DNA)和核酶导入细胞，在转录和翻译水平阻断某些基因的异常表达，而实现治疗的目的。
　　(五)“自杀基因”的应用
　　在某些病毒或细菌中的某基因可产生一种酶，它可将原无细胞毒或低毒药物前体转化为细胞毒物质，将细胞本身杀死，此种基因称为“自杀基因”
　　(六)免疫基因治疗
　　免疫基因治疗是把产生抗病毒或肿瘤免疫力的对应与抗原决定族基因导入机体细胞，以达到治疗目的。如细胞因子(cytokine)基因的导入和表达等。
　　(七)耐药基因治疗
　　耐药基因治疗是在肿瘤治疗时，为提高机体耐受化疗药物的能力，把产生抗药物毒性的基因导入人体细胞，以使机体耐受更大剂量的化疗。如向骨髓干细胞导入多药抗性基因中的mdr-1
2、基因治疗的总体策略

基因治疗按基因操作方式分为两类，一类为基因修正（gene correction）和基因置换（gene replacement），即将缺陷基因的异常序列进行矫正，对缺陷基因精确地原位修复，不涉及基因组的其他任何改变。通过同源重组（homologous recombination）即基因打靶（gene targetting）技术将外源正常的基因在特定的部位进行重组，从而使缺陷基因在原位特异性修复。另一类为基因增强（gene augmentation）和基因失活（gene inactivation），是不去除异常基因，而通过导入外源基因使其表达正常产物，从而补偿缺陷基因等的功能；或特异封闭某些基因的翻译或转录，以达到抑制某些异常基因表达。
按靶细胞类型又可分为生殖细胞（germ-line cell）基因治疗和体细胞（somatic cell）基因治疗。广义的生殖细胞基因治疗以精子，卵子和早期胚胎细胞作为治疗对象。由于当前基因治疗技术还不成熟，以及涉及一系列伦理学问题，生殖细胞基因治疗仍属禁区。在现有的条件下，基因治疗仅限于体细胞。
3、基因治疗的基本程序
基因治疗的实施主要包括以下步骤：一、选择用于治疗疾病的目的基因；二、基因载体的选择,目前应用于基因治疗的载体主要有病毒载体和非病毒载体两种；三、靶细胞的选择,目前应用于基因治疗的细胞仅限于人的体细胞.用于基因治疗的靶细胞必须取材方便，易于在体外人工培养，而且细胞的寿命足够长；四、基因转移,在基因治疗中迄今所应用的基因转移方法可分为两大类：病毒方法和非病毒方法，非病毒载体主要有直接注射、磷酸钙共沉淀法、脂质体法和生物化学法等；五、外源基因的筛检,可以利用基因表达产物的筛检方法,也可以利用分子生物学方法筛检外源基因；六、将目的基因导入体内,直接转导入人体的靶器官的靶细胞中,取出患者体细胞进行体外培养，将治疗性基因通过病毒载体或非病毒载体转染后，再移植到患者的特定部位和导入体内。
（一）目的基因的选择和制备
基因治疗的首要问题是选择用于治疗疾病的目的基因。对遗传病而言只要已经研究清楚某种疾病的发生是由于某个基因的异常所引起的，其野生型基因就可被用于基因治疗，如用ADA基因治疗ADA缺陷病。但在现在的条件下，仅此是不够的。可用于基因治疗的基因需满足以下几点：在体内仅有少量的表达就可显著改善症状；该基因的过高表达不会对机体造成危害。很显然某些激素类基因如与血糖浓度相关的胰岛素基因目前尚不能用于糖尿病的基因治疗。在抗病毒和病原体的基因治疗中。所选择的靶基因应在病毒和病原体的生活史和起重要的作用并且该序列是特异的，如针对HBV的HBeAg或X基因等。肿瘤病人多有免疫缺陷，可选用免疫因子基因转入人体，肿瘤细胞内往往存在多种基因异常形式，可采用反义技术封闭细胞内活化的癌基因或向细胞内转入野生型抑癌基因，抑制肿瘤生簪，所针对的癌基因或抑癌基因应下该肿瘤的发生和发展有明确的相关性。
在确定欲选目的基因后，就在制备目的基因。正向表达的基因可以是cDNA（complementary DNA），也可是基因组DNA(genomic DNA)片段。可用传统的方法获取，也可采用多聚酶链式反应(polymerase chain reaction PCR)等新技术进行体外扩增。部分反义基因也可采用此法获得，但多数情况下采用人工合成的方式制备。
（二）基因的转运
目前已有多种基因转运的方式，其基本原则是将外源基因运到细胞内。已使用的有病毒载体和非病毒载体两大类。
病毒载体：病毒具有一些独特的性质如多数病毒可感染特异的细胞，在细胞内不易降解；RNA病毒能整合到染色体以及基因水平较高等。因此病毒载体是良好的基因转运载体。目前已被用作载体的病毒有逆转录病毒、腺病毒、腺相关的病毒。疱疹病毒和肝炎病毒等。逆转录病毒用作载体时需进行几步改造：（1）将天然的野生型RNA前病毒转变成DNA载体，并插入欲转移的相关外源基因。其基本原则是用标记基因和外源基因替代病毒的编码基因，如图23-2所示。（2）制备辅助细胞为载体DNA提供其丧失的功能（3）将载体DNA导入辅助以产生病毒载体。（4）病毒载体感染靶细胞，外源基因在细胞内得以表达
（三）靶细胞的选择
理论上讲，无论何种细胞均具有接受外源DNA的能力，目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞，用于转基因的体细胞必须取材方便，含量丰富，容易培养，寿命较长。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、上皮细胞、角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。在实际上应用中应具体根据目的条件选择。
（四）细胞转染（tansfection）
将目的基因导入靶细胞的方法很多，大致可分为物理学方法、化学方法、融合法和病毒感染法四类。病毒法已在本节的“基因的转运”中有基因介绍。目前较多使用的是脂质体法。
在目前的技术状态下，一般而言其基因转染效率很难达到100%。故必须首先将转导细胞和未转导细胞加以区分。这方面的新技术发展很快，常用的转导细胞筛选方法有：
利用基因表达产物筛选法：（1）标记基因筛选法：在载体上引入一个标记基因，或同时导入标记基因，在转染后的适当时间选用合适剂量的选择培养基，筛选标记基因表型，那些已导入外源基因的细胞将存活下来，而未转录的细胞则死于选择性细胞培养基。如在较多的载体中都有neor标记基因存在，若向培养基中加入G418进行选择，最后只有转导细胞存活下来。（2）基因缺陷型受体细胞的选择性：以基因缺陷型细胞作为靶细胞，将正常基因导入基因缺陷型靶细胞后，使用选择性培养基进行筛选。例如将TK基因导入TK-的靶细胞，转录细胞可在HAT培养基中生长，未转导的细胞则不能在HAT培养基中生长。（3）基因共转染技术：将目的基因表达载体DNA和标记基因表达载体DNA混合后共同转移到靶细胞中，分别使用标记基因和目的基因对应的选择剂进行两次筛选，最后得到复合转导的转化子。
分子生物学方法：外源基因是否真的转入靶细胞必须用分子杂交方法进行证实。常用的方法有原位杂效，Southern杂交和打点杂交。其中主要问题是探针的选择。若靶细胞内原来不存在所转入的目的基因，可选用目的基因作为探针；靶细胞内一般无标记基因存在，故标记基因是良好的探针。探针大小可以是较大的DNA片段，亦可是人工合成的DNA单链探针分子。PCR方法目前也已用于转导细胞的鉴定，且该法相对简单易行。
（五）外源基因的表达及检测
在筛选出转化分子后还需要鉴定转导细胞中外源基因的表达状况。其中包括对目的基因和标记基因表达的鉴定。常用方法有原位杂交，Northrn杂交，NRA打点杂交，免疫组织化学染色等，前几项是检测外源基因转录出的mRNA，后者则是检测外源基因翻译出的蛋白质。流式细胞仪是一种较为客观准确的仪器，可定量分析外源基因的表达状况。
选择并制备好治疗性基因、恰当的载体、合适的基因转移方法及筛选方法后，就应该选择合适的将目的基因导入体内的方式。将治疗性基因导入体内的途径有两种：in vivo和ex vivo途径。
（六）将目的基因导入体内
n vivo途径
该途径就是指治疗性基因通过一定的载体携带，在体情况下，直接转导入人体的靶器官的靶细胞中。通常可以使用病毒载体携带和脂质体包裹等方式将治疗性基因导入人体中。这种方法导入的基因在体内稳定表达的时间通常较短暂，运用病毒载体时，可能引起患者产生不良反应，甚至发生病毒感染，因此比较危险。但是对靶细胞不易体外培养的情况，这种方法很有效。而且，对病毒载体减毒的研究越来越多，病毒载体的危险性也会越来越低。
ex vivo途径
该途径就是指取出患者体细胞进行体外培养，将治疗性基因通过病毒载体或非病毒载体转染后，筛选成功转导的细胞，体外扩大培养，再移植到患者的特定部位，通常是重新移植到细胞来源的器官和组织中。理论上讲，ex vivo途径的安全性更高，但是，该途径的运用范围较受限制，只有治疗用的靶细胞容易取材，容易体外培养、扩增、传代的情况下，才能使用。
三、 治疗癌症的策略与应用
二十世纪八十年代基因治疗技术兴起以来，基因治疗的研究一直在坎坷中发展，由于在理论和技术上存在许多不完善之处，因此它曾经倍受争议，并被认为与传统的伦理道德相悖，有时甚至由于一些偶然事件而被政府和权威人士明令禁止和抵制。但是，基因治疗作为一种全新的疾病治疗方法，有着顽强的生命力，相关的研究一直十分活跃，并不断取得可喜的成绩。
最早进行基因治疗研究的疾病是单基因遗传病，这同时也是基因治疗应用最为成功的疾病之一。随后，基因治疗研究逐步扩展到严重威胁人类健康的恶性肿瘤、心血管疾病、病毒感染及代谢类疾病等，其中，肿瘤以及艾滋病等病毒性疾病的基因治疗研究成为目前研究的热点。上述研究已经出台了一批在体外实验或动物实验中有显著疗效的治疗方案，其中许多方案有望在临床上获准实施。
通过以上讲解，我们对基因治疗有了一定的了解，目前比较热点的的癌症方式正是用基因治疗的方法。
（一）癌症的定义
癌症（cancer），医学术语亦称恶性肿瘤（malignant neoplasm），中医学中称岩，由各种致癌物质、致癌因素的作用下导致身体正常细胞发生癌变的结果。
癌细胞的特点是：无限制、无止境地增生，使患者体内的营养物质被大量消耗；癌细胞释放出多种毒素，使人体产生一系列症状。
（二）癌症基因的相关研究
早在20世纪50年代人们已知道是各类基因控制细胞增生，80～90年代癌症基因研究更进入高潮。学家自1970年找到第一个癌基因，至今已发现20种不同的癌基因，10余种癌抑制基因。癌基因诱发细胞增生，而癌抑制基因恰恰相反，但是当癌抑制基因受到某些因素影响发生突变，它就失去了这一抑制作用，其结果必然是癌基因失去控制，细胞增殖加快。1994年又发现了细胞凋亡基因，它不仅能使细胞停止分裂，更能使细胞死亡。同样，当凋亡基因受到某些因素影响发生突变时，也会失去其凋亡作用。因此，当癌基因在遗传、免疫、内分泌、精神等内在因素，及生物、物理、化学、营养等外在因素（统称致癌八大因素）触发后开始启动，而癌抑制基因及凋亡基因又发生突变，失去抑制癌基因的作用的时候，癌症就发生了。癌症基因调控旨在了解哪些基因发生变异后，采取各种手段，包括药物来“纠正”变异基因，达到治疗目的。
（三）癌症基因治疗存在的关键问题
1、基因导入的载体系统问题
目前所采用的载体主要分为两大类，即转染性和转导性苦载体。转染性载体是利用化学或物理方法增加细胞膜的通透性而将DNA转染入细胞内，这种方法包括脂质体和基因枪等。转导性载体则是利用病毒对细胞的天然亲和力把遗传物质引入宿主细胞。
2、治疗的“靶细胞”或“靶组织”
带有目的基因的载体如何到达“靶细胞”是肿瘤基因治疗的关键。只有提高基因转导的靶向性，才能实现治疗的针对性和安全性。目前国际上解决基因的靶向转移及表达有三种策略：
（1）基因工程手段改造基因载体。
（2）在体内基因传递系统中共价连接抗瘤抗体和肿瘤细胞特异受体的配基，使基因在类似“生物导弹”作用下被送到肿瘤细胞表面。
（3）应用肿瘤细胞特异蛋白“管家基因”的基因表面调控元件，在转录水平调控目的基因在靶细胞中特异表达。
3、于外源抗癌基因在体内表达的可控性问题
外源基因导入后，在体人的表达若能人为调控，将对恶性肿瘤及诸多疾病的基因治疗有所突破。目前已经发现了和第一个可诱导的调控系统---TAXI/UAS系统。该系统应用一个酵母GAL4的顺式元件作为外源基因的上游，另组建一个激素受体(孕酮)及一段GAL4的反调控基因子的载体，将两个载体共转染靶细胞后，只有当诱导物(孕酮)或其拮抗物(RU486)存在时，目的基因才能表达。这是迄今唯一可诱导的调控系统，值得重视。
四、 基因治疗的发展前景展望
一、基因治疗发展面临的挑战
基因治疗的诞生和发展，为人类彻底战胜疾病带来了新的希望，但是它的进一步发展也面临前所未有的挑战。
 （一）理论和技术上的挑战
1.缺乏更多更好的治疗基因
目前用于基因治疗的基因还有相当大的局限性，尤其是对大多数多基因疾病，如恶性肿瘤、糖尿病、高血压、神经退行性疾病的致病基因还有待阐明，这将依赖于未来功能基因组学的发展。
2.缺乏高效特异的基因导入系统
基因转移的效率和特异性是相互矛盾又相互统一的，载体的基因转移效率很高时，往往特异性就较差。但如果基因转移的特异性较高，则有助于提高目的基因在靶组织中的转移和治疗效率。目前采用的病毒和非病毒载体普遍存在转移效率低，特异性不强等缺点。将现有的病毒载体进行重组改造，获得病变组织靶向的病毒载体，或开发受体介导的靶向性非病毒载体，可望建立符合体内基因转移要求的高效特异的目的基因导入系统。
3.治疗基因表达缺乏可调控性
治疗基因在导入靶细胞后，如果不能得到有效调控，将带来严重后果。治疗基因的可调控性包括空间上的可调控性和时间上的可调控性。前者指目的基因只在特定组织细胞或病变细胞中表达，而在其它组织中不表达，这可以通过将目的基因置于组织特异性基因调控元件下表达来实现；为了使目的基因表达在时间上具有可调控性，可以在基因上游加上该基因的部分调控系列，并加入诱导剂诱导表达。目前有关基因非编码序列和调控序列的信息还很有限，因此选择的余地不大。实现治疗基因表达可调控性的最理想方式是模拟人体内基因本身的调控形式，这需要克隆目的基因包含内含子在内的全序列以及上下游的调控区，因此难度较大，是基因治疗的远期目标。
（二）社会伦理学上的挑战
基因治疗的伦理学争议主要源于治疗的安全性问题和基因治疗模式与现有伦理道德的冲突。由于理论和技术上的不成熟，人们还无法确知基因治疗可能产生的后果。首先，由于导入靶细胞的目的基因可以随机地整合到细胞基因组中，因此可能导致细胞正常基因失活或表达失调，并可能激活癌基因，使细胞的表型和正常功能发生改变，甚至发生癌变未来人类基因组学和基因定点重组技术的发展为合理解决这一危机提供了可能。其次，用于基因转移的具有一次感染能力的病毒有可能发生重组成为具有复制能力的病毒，造成持续感染。将现有病毒进一步改造，增加病毒复制复活所需要进行重组的次数，将可以大大降低产生具有持续感染能力的病毒的几率。
另外，由基因治疗引发的其它社会和伦理道德问题也倍受关注，例如，患者在接受治疗前的完全知情同意问题，那些以改善个人的某些品性为目的的增强性基因“治疗”是否应该被允许，以及何时开始或在何种情况下实施生殖细胞基因治疗等。
二、基因治疗的发展前景
基因治疗研究目前还处于起步阶段，因此现在对它期望过高是不现实的。基因治疗的进一步发展必须借鉴分子病理学、分子遗传学和功能基因组学等领域的最新研究成果。随着相关理论和技术的进一步完善，以及人们思想观念的更新，基因治疗将迎来突破性的进展，第一个基因治疗产品将在未来2-3年内问世，随后将有一批产品进入商品化生产，并迅速形成巨大的市场。基因治疗在临床上将成为一种常规的治疗方法，对某些疾病甚至成为主要的治疗方法，疗效更加彻底的生殖细胞基因治疗将获准实施。为人类带来了福音，使癌症、艾滋病患者看到了生的希望。随着一些关键技术的突破，21世纪基因治疗将使人类彻底告别癌症、艾滋病，用新的医学理念和手段，从基因水平杜绝、根治一切人类疾病隐患，战胜新的疾病，除此之外，还会给 人类带来新的理念新的科学。

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基础生物学论文

基因治疗研究进展

姓名：杨颢鹏

学号：09043117

学院：生物工程

专业：生物化工