绿鲍（Haliotis fulgens）线粒体基因组全序列测定及分析.pdf

为高效鉴别鲍属物种和更好地管理和保护鲍种质资源，本研究通过高通量测序获得了养殖绿鲍（Haliotis fulgens）稚贝的线粒体基因组全序列，并对其序列和结构特征进行分析。结果表明，绿鲍线粒体基因组全长 17 041 bp，含有 37 个编码基因，其中蛋白质编码基因 13 个、tRNA 基因 22 个、rRNA 基因 2 个。13 个蛋白质编码基因均以 AUG 为起始密码子，以 UAG 或 UAA 为终止密码子。除 tRNA-Ser(AGN)外的 21 个 tRNA 基因可折叠成典型三叶草结构。分析发现 tRNA-Glu 和 COX3 间存在富含 A+T 的非编码区，其内含有 2 个带回文序列的发卡结构。基于已报道的 10 个鲍属线粒体基因组全序列构建系统发育树，发现绿鲍与皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）、红鲍（Haliotis rufescens）、黑鲍（Haliotiscracherodii）聚为一支。将绿鲍与皱纹盘鲍 13 个线粒体编码蛋白的结构域比较，发现二者 ND2、ND4 的跨膜结构域数量存在差异，这是否与二者的高温耐受性差异有关，有待进一步研究。总之，绿鲍线粒体基因组全序列的首次获取和分析，丰富了鲍类细胞遗传信息，为分类、种质鉴定与种质资源保护提供了基础数据和参考。关键词：绿鲍；线粒体基因组；基因组组成；系统发育；结构域中图分类号：P735；Q959.212 文献标志码：A 文章编号：02534193(2023)05006415 1引言中国是鲍生产与消费大国，2021 年我国鲍养殖产量达 21.78104 t1。然受限于养殖品种与环境，每年培育的大型精品鲍有限，引进、繁育高产优质鲍种对我国鲍养殖产业的振兴与提升国际竞争力具有重要现实意义。依据世界海洋物种目录（World Register ofMarine Species，WoRMS，https:/marinespecies.org/aphia.php?p=taxdetails&id=1052447），鲍 隶 属 软 体 动 物 门（Mollusca）、腹足纲（Gastropoda）、深海白笠目（Lepe-tellida）、鲍总科（Haliotoidea）、鲍科（Haliotidae），是鲍属（Haliotis）物种的统称。鲍广泛分布于世界热带、亚热带和温带海域。因肉质鲜美、营养丰富、符合高蛋低脂的健康饮食需求，被誉为海产八珍之首。目前世界上发现近百种鲍，在已命名的 56 种2中有约20 种是重要的海水养殖经济贝类34，其中大型鲍多分布于温带地区，小型鲍多分布于热带地区3。绿鲍（Haliotis fulgens），原产于美国的南加利福尼亚、墨西 收稿日期:20220719；修订日期:20221021。基金项目:福州海洋研究院项目（2021F12）；福建省科技厅项目（2021S0010）。作者简介:郭睿（1986），男，河北省石家庄市人，高级农艺师，从事水生动物遗传和疫病研究。E-mail：*通信作者:张善霹（1969），男，高级工程师，主要从事水产养殖技术研究。E-mail：第 45 卷 第 5 期海 洋 学 报Vol.45 No.52023 年 5 月Haiyang XuebaoMay 2023 哥的下加利福尼亚半岛（Baja California Sur）西海岸，为大型暖水鲍种，具有耐高温、肉质鲜、价值高等优点，一度引领当地渔业发展，然因过度捕捞、海洋气候变化等因素，其野生种群数量日益减少，2021 年2 月绿鲍被世界自然保护联盟（International Union forConservation of Nature and Natural Resources，IUCN）濒危物种红皮书（Red List of Threatened Species）变更为极危物种（Critically Endangered，https:/www.iucnredlist.org/species/78768961/78772463）。绿鲍自 20 世纪 80 年代引入我国56，之后 20 多年未见继代自繁和成功用于杂交的报道6。直到 2010 年厦门大学柯才焕课题组对美国绿鲍再次引种，经皱纹盘鲍（Haliotis discushannai）与绿鲍的种间杂交实验，成功收获杂交种（H.discus hannai H.fulgens），随后对二者杂交授精关键影响因素和种间杂交制种技术开展系列研究79。线粒体是真核细胞中一种半自主性细胞器，其基质内含有一套自身的遗传体系，即线粒体基因组，其中富含可用于种群遗传和系统分类研究的分子标记。近年来高通量测序技术结合生物信息学注释分析的方法已广泛应用于动物线粒体基因组的测定1012，所获得的线粒体基因组序列信息可用于物种鉴定、群体遗传分化及系统发育等研究领域1314。近年来在水生动物研究中，应用巨石斑鱼（Epinephelus tauvina）与斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）的线粒体基因组序列信息对二者进行了物种有效性分析15，对龙虾科16、梭子蟹科17、帘蛤科18物种的线粒体基因组全序开展了系统发育研究，陆续测定和分析了黄条鰤（Seriola aureovittata）19、太平洋鳕（Gadus macroceph-alus）20、格氏束腰蟹（Somanniathelphusa grayi）21、洞穴丽蚌（Lamprotula caveata）22、瓜螺（Melo melo）23等的线粒体基因组全序。此外，当前有 9 个鲍属物种线粒体基因组全序列或近全序列报道（表 1），包括黑唇鲍（H.rubra）24、欧洲疣鲍（H.tuberculata）25、杂色鲍（H.diversicolor）26、皱纹盘鲍12,27、绿唇鲍（H.laev-igata）11、黑足鲍（H.iris）28、羊鲍（H.ovina）29等，相关研究集中于线粒体全序列测定和系统发育分析。近年来有关绿鲍的研究主要涉及野生种群遗传多样性与种群基因组学3031、与近源种红鲍（H.rufes-cens）的抗病差异32、摄食变化及饲料优化3334、环境应激下转录组分析及应激响应3536、环境对产卵活动影响37等领域，未见绿鲍线粒体基因组全序列的报道。然而绿鲍属于海洋贝类中的极危物种，是我国引进的优质鲍种，对其开展线粒体基因组全序列测定和分析研究有助于绿鲍的生物资源保护及繁育工作。鉴于此，福州市海洋与渔业技术研究中心的杂交鲍种质研究团队采集引自墨西哥西海岸的养殖绿鲍自繁稚贝样本，利用高通量测序技术开展其线粒体基因组全序列测定与结构特征研究，首次报道了绿鲍线粒体基因组全序列，进一步分析了鲍属贝类系统进化关系，旨在为鲍种分类、种质鉴定、良种选育提供可靠的理论基础和技术支撑。2材料与方法 2.1 实验材料随机采集连江官坞养殖场 2019 年引种于墨西哥西海岸的绿鲍自繁子代稚贝 3 粒，壳长 0.30.5 cm，将整粒去壳经无菌水冲洗后置于无水乙醇中20冻存。使用北京天根海洋动物组织基因组 DNA 提取试剂盒按照说明书提取整粒鲍的 DNA，并用 Nano-Drop ND2000c 超微量核酸分析仪和 0.8%琼脂糖核酸电泳检测 DNA 的浓度、纯度及完整性。2.2 基于细胞色素 B（Cytochrome B，cytB）基因的鲍种验证参考 GenBank 中报道的绿鲍 cytB 基因片段（Gen-Bank 登录号：MH427178.1）及同属红鲍等的线粒体基因组序列（表 1），使用 Primer Premier 5 设计带 M13 接头的兼并引物（下划线标记序列为 M13 接头序列），用于扩增绿鲍 cytB 基因片段，上游引物序列 HfcbF：CAGGAAACAGCTATGACCGCATAAGCCAATTC-GTAARGTG；下游引物序列 HfcbR：TGTAAAACGAC-GGCCAGTCTAATATTCAAGAATATTRTCYCAY-AAC。使用德国 Biometra TRIO PCR 仪扩增目的片段，PCR 体系包含：2GoTaq Master Mix（美国 Promega）表 1 已报道鲍属贝类线粒体基因组Table 1 The complete mitochondrial genomes reportedof Haliotis genus for analysis物种长度/bp GC含量/%GenBank登录号皱纹盘鲍（Haliotis discus hannai）16 88639.6KF724723.1黑足鲍（Haliotis iris）17 13140.2KU310895.1黑唇鲍（Haliotis rubra）16 90740.9AY588938.1绿唇鲍（Haliotis laevigata）16 54542.2KJ472483.1欧洲疣鲍（Haliotis tuberculata）15 93839.5FJ605488.1杂色鲍（Haliotis diversicolor）16 54340.1MZ465525.1羊鲍（Haliotis ovina）16 53140.7NC056350.1红鲍（Haliotis rufescens）16 64639.7NC036928.1黑鲍（Haliotis cracherodii）18 39137.7CM039063.15 期 郭睿等：绿鲍（Haliotis fulgens）线粒体基因组全序列测定及分析65 20 L，绿鲍基因组 DNA 100 ng，HfcbF（10 mol/L）和HfcbR（10 mol/L）各 1 L，加灭菌水补至 40 L。PCR程序设置为：95 预变性 5 min，95 变性 25 s，58退火 25 s，72 延伸 1 min，充分延伸 5 min，4 10 min静置。使用 1%琼脂糖核酸电泳检测 PCR 产物，使用英国 Sygene G：BOX F3 凝胶成像系统成像，将含有目的片段的 PCR 产物送生物技术公司，使用 M13 测序引物进行一代测序。测序结果校正后进行 BLAST 比对，以深海白笠目裂螺科（Lepetellida：Fissurellidae）的火山裂螺（Fissurella volcano）线粒体基因组全序列（GenBank 登录号：NC016953.1）中提取的 cytB 基因序列为外群，从鲍属线粒体基因组全序列中提取 cytB 基因序列并使用 MEGA X38临接法（Neighbor-Joining，NJ），设置自展检测值（bootstrap tests）1 000，按照默认参数进行 cytB基因片段的系统发育树构建。2.3 线粒体基因组二代测序混合鉴定无误的 3 个绿鲍基因组 DNA 样品建立混合池，委托上海凌恩生物技术公司进行二代高通量测序。流程为：通过 Covaris M220 超声破碎仪将基因组 DNA 随机打断成 300500 bp 片段，采用 IlluminaTruSeq Nano DNA Sample Prep Kit 的方法构建文库，应用Illumina NovaSeq 6000 测序平台进行双端 150 bp 测序。对下机数据原始数据使用Trimmomatic v0.39（http:/www.usadellab.org/cms/index.php?page=trimmomatic）进行低质量读长修剪得到极正数据。2.4 基因组组装及注释以报道的红鲍线粒体基因组序列（GenBank 登录号：NC036928.1）为参考序列，使用 SPAdes v3.14.1（ht-tp:/bioinf.spbau.ru/spades）软件对极正数据进行拼接和组装，使用 MITOS39对线粒体基因组进行蛋白质编码基因（Protein-Coding Gene，PCG）、转运 RNA（tRNA）基因和核糖体 RNA（rRNA）基因的预测和结构分析。使用 Tandem Repeats Finder（TRF）检索线粒体基因组序列中串联重复序列40。对 MITOS 预测的初始基因与参考基因组比对以校正基因的起始、终止密码子位置。使用 OGDRAW41对组装后的基因组序列进行圈图展示。将 13 条蛋白序列在 NCBI 非冗余蛋白质数据库中使用 BLAST 的 blastp（E-value 小于 105）与已报道鲍属线粒体蛋白质基因比对以进行基因的功能注释。2.5 鲍属贝类线粒体基因组序列分析及系统发育树构建使用 DNAMAN 序列分析软件 8 和 MEGA X 进行绿鲍线粒体基因组各部碱基组成特征和密码子偏好性分析。使用 Clustal Omega（https:/www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）对 10 个线粒体基因组全序列的核苷酸相似性比较。以火山裂螺为外群，将新测的绿鲍线粒体全序与表 1 中报道的鲍属线粒体全序通过 MA-FFT 7（https:/mafft.cbrc.jp/alignment/server/index.html）进行多序列比对，比对结果应用 MEGA X 使用同上方法构建 NJ 系统发育树，产生的树图使用 iTOL（https:/itol.embl.de/）展示。使用 DNAMAN 序列分析软件 8 对绿鲍及近缘种皱纹盘鲍（GenBank 登录号：KF724723.1）13 个蛋白质的氨基酸序列进行氨基酸序列相似性计算，并使用 TBtools v1.09876 对二者 13 个蛋白质的氨基酸序列进行结构域检索和可视化分析42。3结果 3.1 鲍种验证稚贝 cytB 基因片段测序后，经校正得 1 086 bp，提交序列到 GenBank（登录号：ON932192.1）。该序列在线 BLAST 比对与绿鲍 cytB 基因片段（GenBank 登录号：MH427178.1）序列相似性达 100%。将该序列与同属近源鲍种 cytB 序列使用 NJ 法构建系统发育树，稚贝cytB 序列与上述绿鲍 cytB 基因聚为一支（图 1，本研究稚贝 cytB 序列号后标），说明所采集稚贝样本为绿鲍。10010098.759.651.910089.752.4Tree scale:0.1Haliotis rubra AY588938.1Haliotis laevigata KJ472483.1Haliotis ovina NC056350.1Haliotis diversicolor MZ465525.1Haliotis tuberculata FJ605488.1Haliotis rufescens NC036928.1Haliotis cracherodii CM039063.1Haliotis discus hannai KF724723.1Haliotis fulgens MH427178.1Haliotis iris KU310895.1Fissurella volcano NC016953.1Haliotis fulgens ON932192.1图 1 鲍属 cytB 基因 NJ 系统发育树Fig.1 Phylogenetic tree based on the neighbor-joining（NJ）analysis of the cytB genes of Haliotis spp.66海洋学报 45 卷 3.2 绿鲍线粒体基因组的结构组成采用 Illumina 高通量测序技术，测序获得原始数据8.260 Gb，经质量修剪后得极正数据 8.195 Gb，极正数据 Q20 为 96.99%，Q30 为 90.08%，说明测序质量良好。所测数据经拼接组装成单一环状序列，初步表明获得绿鲍线粒体基因组全序列。所测绿鲍线粒体全长 17 041 bp（GenBank 登录号：ON920309.1），包含 13个 PCGs、22 个 tRNA 基因，2 个 rRNA 基因和 1 个推测的非编码控制区（Control Region，CR）（图 2）。PCG 长度为 11 193 nt、tRNA 基因长度为 1 517 bp、rRNA 基因长度为 2 433 bp、CR 长度为 1 010 bp，分别占整个线粒体长度的 65.68%、8.90%、14.28%和 5.93%。绿鲍线粒体各基因大小、位置及排列顺序等注释信息见表 2 和图 3。表 2 绿鲍线粒体基因组注释结果Table 2 The results of the complete mitochondrial genome annotation for Haliotis fulgens基因长度/bp定位间隔区/bp反密码子密码子编码链起始位点终止位点起始密码子终止密码子COX378017800AUGUAAHtrnD7381288431GUCHtrnK728849551UUUHtrnA699511 0195UGCHtrnR661 0211 0861UCGHtrnI701 0991 16812GAUHND33541 1711 5242AUGUAAHtrnN711 5371 60712GUUHtrnS671 6111 6773GCUHND21 0951 6812 7753AUGUAAHCOX11 5422 7954 33619AUGUAAHCOX26964 3755 07038AUGUAGHATP81655 1555 31984AUGUAAHATP66965 3746 06954AUGUAAHtrnF686 1136 18043GAALND51 7406 1957 93414AUGUAALtrnH687 9358 0020GUGLND41 2338 0509 28247AUGUAALND4L3009 4389 737155AUGUAGLtrnT709 7629 83124UGUHtrnS679 8589 92426UGALCYTB1 1409 93711 07612AUGUAGL 16ScytB12StrnDtrnWtrnKtrnNtrnCtrnMtrnItrnTtrnQtrnAtrnEtrnGtrnYtrnL1trnHtrnFtrnPtrnS2trnS1trnVtrnRtrnL2NADH脱氢酶细胞色素B细胞色素 C氧化酶ATP 合成酶转运RNA核糖体RNA控制区绿鲍（Haliotis fulgens）线粒体基因组ON920309.1/(17 041 bp)图 2 绿鲍线粒体基因组结构Fig.2 Mitochondrial genome structure ofHaliotis fulgens5 期 郭睿等：绿鲍（Haliotis fulgens）线粒体基因组全序列测定及分析67 3.3 鲍属贝类线粒体基因组碱基组成比较报道的鲍属贝类线粒体基因组碱基组成（表 3），发现各鲍种线粒体基因组 A+T 含量（57.8%62.3%）均高于 G+C 含量（37.7%42.2%），核苷酸组成具有明显的 AT 偏好性，其中本研究绿鲍的 A+T 含量在全基因组的占比为 60.6%，在 PCG 组为 59.7%，在 tRNA 基因组为 59.1%，在 rRNA 基因组为 61.2%，在 CR 更是高达 67.0%，表现出同样的 AT 偏好性。本研究中绿鲍线粒体全基因组碱基含量由高到低依次为：A（36.2%）、C（26.5%）、T（24.4%）、G（12.9%），AT偏移碱基组成和 GC 偏移碱基组成分别为 0.195 和0.345，其他鲍属贝类线粒体基因组中鸟嘌呤（G）含量较本研究的更高（13.4%27.3%），腺嘌呤（A）含量较本研究的更低（23.9%35.9%），与绿唇鲍和黑鲍不同，绿鲍 GC 偏移碱基中鸟嘌呤（G）含量远低于胞嘧啶（C）含量，而且 GC 偏移达到最小（0.345）。通过以上分析发现，鲍属贝类 37 个编码基因的碱基组成在PCGs、tRNA 和 rRNA 基因中表现出相对较高的胸腺嘧啶（T）含量和相对较少的胞嘧啶（C）含量，且本研究中绿鲍 tRNA 基因的胞嘧啶（C）含量较其他鲍略低，绿鲍控制区含有相对较高的腺嘌呤（A）和胸腺嘧啶或尿嘧啶（T/U）。3.4 绿鲍线粒体蛋白质编码基因和相对同义密码子使用率本研究使用无脊椎动物线粒体密码子表（The In-vertebrate Mitochondrial Code），发现绿鲍 13 个 PCGs均使用 AUG 作为起始密码子，使用 UAA 或 UAG 作为终止密码子，可使用 UGA 编码色氨酸（Tryptophan，Trp，W），可使用 AGA、AGG 编码丝氨酸（Serine，Ser，S）。其中，UAA 为 ATP8、ATP6、COX1、COX3、ND2、ND3、ND4 和 ND5 这 8 个基因的终止密码子，UAG 为cytB、COX2、ND1、ND4L、ND6 这 5 个基因的终止密码子。13 个 PCGs 编码序列中除终止密码子外共有3 718 个密码子。对其分析碱基使用频率，密码子第续表 2基因长度/bp定位间隔区/bp反密码子密码子编码链起始位点终止位点起始密码子终止密码子ND650711 11411 62037AUGUAGLtrnP6711 62111 6870UGGLND194511 71012 65422AUGUAGLtrnL6812 65612 7231UAALtrnL6812 81412 88190UAGL16S1 40012 89814 29716LtrnV6614 39014 45592AACL12S1 03314 46915 50113LtrnM7015 51615 58514CAULtrnY6815 58815 6552GUALtrnC7015 66415 7338GCALtrnW7315 73715 8093UCALtrnQ7015 82015 88910UUGLtrnG6815 89215 9592UCCLtrnE6815 96416 0314UUCL注：trn表示rRNA，后面的大写字母表示该tRNA转运的氨基酸；16S和12S为rRNA基因；代表无密码子。重链轻链COX3ND3ND2COX1COX2ATP8ATP6ND5ND4ND4LDKARITCYTBND6ND116S12SF控制区控制区HSP LVMYCWQGENSL图 3 绿鲍线粒体编码基因及非编码基因排列图Fig.3 The mitochondrial coding and non-coding genes arrangement diagram of Haliotis fulgens68海洋学报 45 卷 表 3 鲍属线粒体基因组碱基组成Table 3 Composition and skewness in the mitochondrial genomes of Haliotis genus species物种碱基组成/%AT偏移GC偏移ATCGA+T线粒体全基因组线粒体全基因组绿鲍 Haliotis fulgens36.224.426.512.960.60.1950.345皱纹盘鲍 Haliotis discus hannai35.425.026.113.560.40.1720.318黑足鲍 Haliotis iris35.923.926.813.459.80.2010.333黑唇鲍 Haliotis rubra34.624.526.714.259.10.1710.306绿唇鲍 Haliotis laevigata23.933.914.927.357.80.1730.294欧洲疣鲍 Haliotis tuberculata34.825.725.813.660.50.1500.310杂色鲍 Haliotis diversicolor35.224.726.413.759.90.1750.317羊鲍 Haliotis ovina34.824.527.413.459.30.1740.343红鲍 Haliotis rufescens35.424.925.913.760.30.1740.308黑鲍 Haliotis cracherodii26.635.713.524.262.30.1460.284蛋白质编码基因蛋白质编码基因绿鲍 Haliotis fulgens23.436.319.121.259.70.2160.052皱纹盘鲍 Haliotis discus hannai23.436.319.221.159.70.2160.047黑足鲍 Haliotis iris22.536.019.621.958.50.2310.055黑唇鲍 Haliotis rubra22.335.119.922.657.40.2230.064绿唇鲍 Haliotis laevigata22.234.520.422.856.70.2170.056欧洲疣鲍 Haliotis tuberculata23.736.118.921.359.80.2070.060杂色鲍 Haliotis diversicolor23.235.919.121.859.10.2150.066羊鲍 Haliotis ovina22.635.819.322.258.40.2260.070红鲍 Haliotis rufescens23.536.019.321.259.50.2100.047黑鲍 Haliotis cracherodii23.235.919.421.659.10.2150.054tRNA基因基因绿鲍 Haliotis fulgens28.131.016.924.059.10.0500.174皱纹盘鲍 Haliotis discus hannai28.230.517.324.058.70.0390.162黑足鲍 Haliotis iris27.630.617.524.358.20.0520.163黑唇鲍 Haliotis rubra27.530.417.424.857.90.0500.175绿唇鲍 Haliotis laevigata27.330.717.124.958.00.0590.186欧洲疣鲍 Haliotis tuberculata28.731.017.023.359.70.0390.156杂色鲍 Haliotis diversicolor27.230.817.224.958.00.0620.183羊鲍 Haliotis ovina27.531.217.024.458.70.0630.179红鲍 Haliotis rufescens28.330.517.423.858.80.0370.155黑鲍 Haliotis cracherodii28.030.817.124.158.80.0480.170rRNA基因基因5 期 郭睿等：绿鲍（Haliotis fulgens）线粒体基因组全序列测定及分析69 一位点以 U 为主（30.7%），G 次之（26.9%）；第二位点以 U 为主（43.5%），C 次之（21.3%）；第三位点以 U 为主（34.7%），A 次之（27.4%），3 个位点均存在明显尿嘧啶碱基偏好性。对密码子进行相对同义密码子使用率（RelativeSynonymous Codon Usage，RSCU）分析的结果表明，绿鲍 13 个 PCGs 中存在 31 个偏好密码子（RSCU1），所编码的 20 种氨基酸均由至少 2 种密码子编码，除密码子 AUG（编码 Methionine，Met，M）和 GAC（编码 As-partic acid，Asp，D）外，其余 18 种氨基酸的不同偏好密码子中第 3 位为 U、A 碱基的密码子占比达 80.6%（25/31），而且 18 种氨基酸中每一种氨基酸对应 RSCU值最高的密码子第三位点均为 U 或 A（表 4）。3.5 绿鲍线粒体基因组 rRNA 基因和 tRNA 基因绿鲍 16S rRNA 基因和 12S rRNA 的序列长度分别为 1 400 bp 和 1 033 bp，均位于 L 链。两个 rRNA 基因位于 tRNA-Leu（CUN）和 tRNA-Met 之间并以 tRNA-Val间隔开，与其他鲍属贝类一致。通过对绿鲍的 22 个tRNA 基因进行定位及二级结构预测分析，发现 22 个tRNA 基因分布于13 个PCGs 之间，大小从66 bp 到73 bp不等。其中，包括 2 个 tRNA-Ser，在重链（H）和轻链（L）各1 个；2 个tRNA-Leu，均位于L 链上且连续分布（图3）。此外，发现绿鲍两对相邻的 tRNA（tRNA-Asp 与 tRNA-Lys、tRNA-Lys 与 tRNA-Ala）间存在 1 个或 5 个核苷酸的基因重叠的现象。22 个 tRNA 基因中的 8 个由H 链编码，14 个由 L 链编码（表 2，图 3），除 tRNA-Ser（AGN）外均可折叠成典型三叶草结构，但其中 tRNA-Asp、tRNA-Lys、tRNA-Ala、tRNA-Gln、tRNA-Cys、tRNA-Trp 的氨基酸臂、反密码子茎或 TC 茎上分别存在1 对由非互补碱基形成的错配或凸环，而 tRNA-Ser（AGN）因缺失二氢尿嘧啶茎不能形成三叶草结构（图 4）。3.6 绿鲍线粒体基因组非编码区在绿鲍线粒体非编码区共识别出 5 处基因序列重复区，均位于 tRNA-Glu 和 COX3 之间，重复序列总长为 256 bp，最大碱基重叠数为 49 bp，最小碱基重叠数为 2 bp。有 33 个间隔序列分布在各编码基因间，长度大小在 11 010 bp 之间。在最长的 1 010 bp 间隔序列中 A+T 含量达 67.0%，从中检测到串联重复序列，比如（AT）15，（ATAC）3等，以及一段多聚胞嘧啶（C）17序列。使用 MITOS 从中发现 2 段存在回文序列的发卡结构，一段位于基因组 16 38516 579 之间，从上述第3 个ATAC 开始，包含（AT）15，长度为195 nt，最小自由能（Minimum Free Energy，MFE）为70.3；一段位于基因组 17 00317 041 之间，长度为 39 nt，MFE 为1.5（图 5）。推测该 1 010 bp 长链非编码序列为控制区，与线粒体基因组 H 链复制起始有关。3.7 鲍属系统发育分析及绿鲍和皱纹盘鲍线粒体编码蛋白结构域比较将绿鲍线粒体基因组全序列与已报道鲍属的线粒体全序列进行基因组水平的核苷酸序列相似性分析，发现绿鲍与皱纹盘鲍、红鲍、黑鲍具有较高的核酸序列相似性（87.90%89.15%，表 5）。依据线粒体续表 3 物种碱基组成/%AT偏移GC偏移ATCGA+T绿鲍 Haliotis fulgens26.135.113.425.461.20.1470.309皱纹盘鲍 Haliotis discus hannai27.235.213.124.562.40.1280.303黑足鲍 Haliotis iris25.835.712.925.661.50.1610.330黑唇鲍 Haliotis rubra26.234.913.625.361.10.1420.301绿唇鲍 Haliotis laevigata26.333.914.325.660.20.1260.283欧洲疣鲍 Haliotis tuberculata28.034.413.224.462.40.1030.298杂色鲍 Haliotis diversicolor27.135.113.224.562.20.1290.300羊鲍 Haliotis ovina25.834.613.526.160.40.1460.318红鲍 Haliotis rufescens27.334.913.324.562.20.1220.296黑鲍 Haliotis cracherodii27.135.013.324.662.10.1270.298假定控制区假定控制区绿鲍 Haliotis fulgens37.629.424.68.467.00.1220.49170海洋学报 45 卷 表 4 绿鲍 13 个蛋白质编码基因密码子平均使用频率Table 4 Total codon average usage in the thirteen protein coding genes for Haliotis fulgens密码子数量使用率密码子数量使用率密码子数量使用率密码子数量使用率UCU（S）952.11GUU（V）1271.60ACU（T）671.48CAA（Q）441.19UCC（S）581.29GUA（V）750.94ACA（T）661.46CAG（Q）300.81UCA（S）521.15GUG（V）740.93ACC（T）360.80CAU（H）461.15AGU（S）501.11GUC（V）420.53ACG（T）120.27CAC（H）340.85AGG（S）380.84UUA（L）1511.56UUU（T）2161.38AAA（K）461.12AGA（S）340.75UUG（L）1481.53UUC（T）980.62AAG（K）360.88AGC（S）180.40CUA（L）1151.19UAU（Y）861.33UGA（W）601.10UCG（S）160.35CUU（L）740.77UAC（Y）430.67UGG（W）490.90CGA（R）291.81CUC（L）590.61GGA（G）921.31GAA（E）501.10CGU（R）191.19CUG（L）330.34GGG（G）921.31GAG（E）410.90CGG（R）90.56GCU（A）941.55GGU（G）690.99GAC（D）401.08CGC（R）70.44GCC（A）631.04GGC（G）270.39GAU（D）340.92CCA（P）611.64GCA（A）580.96AAU（N）771.29AUG（M）881.05CCU（P）521.40GCG（A）270.45AAC（N）420.71AUA（M）800.95CCG（P）200.54UGU（C）451.50AUU（I）1451.19UAA81.23CCC（P）160.43UGC（C）150.50AUC（I）980.81UAG50.77注：黑体表示偏好密码子。GGCACUAUACUUUAAACU AAAAGACUUGACUUGCAAUUAAGCAUUGAAAUA AAUUUAUUUCUAGCGCCAGAAGUGUUAGUUUCAAUUACUAAAACAUCUGUCUGUCAAUCAGAAAAUUCGGGC UUAUUCCCCGAACAGUUCUUUUUGGGUGGCUGAUAAUAGCAUUAGACUUUUAAUCUAACUCAUGAUAGAC AUCUAACCCUAUCCCCGGCACGGUUUUGUGGUUGAAAUU ACAACGUCAAAUUGCAAAUUUGAAAGUGUG CAAU