基于分子印迹聚合物的SPR传感器用于牛血清蛋白的检测.pdf

文章编号：1008-9357(2023)04-0340-09DOI:10.14133/ki.1008-9357.20230307002基于分子印迹聚合物的 SPR 传感器用于牛血清蛋白的检测胡子凡，申永帅，朱良宇，陈浩，吴雨晨，王延梅（中国科学技术大学化学与材料科学学院,合肥230026）摘要：以牛血清蛋白（BSA）为模板分子、多巴胺为功能单体和交联剂、高碘酸钠为氧化剂，制备了 BSA 表面印迹表面等离子共振（SPR）生物传感器。通过聚丙烯酸（PAA）与 BSA 的氢键作用预先固定 BSA，增加印迹效率，同时在聚多巴胺表面非印迹区域修饰部分水解的聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMOXA-EI）抵抗蛋白质的非特异性吸附。通过 X 射线光电子能谱、原子力显微镜、可变角光谱椭偏仪和静态水接触角对制备的 BSA 表面印迹 SPR 生物传感器进行表征。对质量浓度为 0.110g/mL 的 BSA 水溶液进行 SPR 吸附研究，检测限和定量限分别达到了 53ng/mL和 161ng/mL。以-乳球蛋白、卵白蛋白、溶菌酶和细胞色素 C 为参比蛋白进行选择性研究，相应的选择性系数分别达到了 4.43、3.45、3.17 和 3.64。上述 5 种蛋白混合溶液中 BSA 的检测回收率为 97.5%102.5%。关键词：牛血清蛋白；表面等离子共振；分子印迹聚合物；聚丙烯酸；水解聚(2-甲基-2-噁唑啉)中图分类号：O64文献标志码：AMolecularly Imprinted Polymers for Determination of Bovine SerumAlbumin Based Surface Plasmon Resonance SensorHUZifan,SHENYongshuai,ZHULiangyu,CHENHao,WUYuchen,WANGYanmei（SchoolofChemistryandMaterialsScience,UniversityofScienceandTechnologyofChina,Hefei230026,China）Abstract:Bovineserumalbumin(BSA)molecularlyimprintedpolymer(MIP)surfaceplasmonresonance(SPR)biosensorswerepreparedusingBSAasthemodel,dopamineasthefunctionalmonomerandcross-linkerandsodiumperiodateastheoxidant.BSAmoleculeswerefixedinadvancethroughhydrogenbondviaintroducingpoly(acrylicacid)(PAA)toincreaserecognitionsites,andpartiallyhydrolyzedpoly(2-methyl-2-oxazoline)(PMOXA-EI)wasalsointroducedintothenoncavityregionsofpolydopaminetoresistnonspecificadsorptionofproteins.ThepreparedBSA-MIPSPRsensorwascharacterizedbyX-rayphotoelectronspectroscopy,atomicforcemicroscopy,variableanglespectroscopicellipsometry,andstaticwatercontactangle.SPRadsorptionstudieswerecarriedoutinaqueousBSAsolutionswiththemassconcentrationof0.110 g/mL.The limit of detection and the limit of quantification values were obtained as 53 ng/mL and 161 ng/mL,respectively.Selectivitystudieswereperformedagainst-lactoglobulin,ovalbumin,lysozyme,andcytochromeC,andthecorresponding selectivity coefficients were determined to be 4.43,3.45,3.17 and 3.64,respectively.Finally,BSA-MIPbiosensor was used to detect BSA in the mixture solution of the above five proteins.The BSA recovery rate was收稿日期：2023-03-07基金项目：国家自然科学基金（21674102）作者简介：胡子凡（1998），男，安徽池州人，硕士，主要研究方向为功能高分子。E-mail：通信联系人：王延梅，E-mail：引用格式：胡子凡,申永帅,朱良宇,陈浩,吴雨晨,王延梅.基于分子印迹聚合物的 SPR 传感器用于牛血清蛋白的检测 J.功能高分子学报，2023，36（4）：340-348.Citation：HUZifan,SHENYongshuai,ZHULiangyu,CHENHao,WUYuchen,WANGYanmei.MolecularlyImprintedPolymersforDeterminationofBovineSerumAlbuminBasedSurfacePlasmonResonanceSensorJ.JournalofFunctionalPolymers,2023,36（4）:340-348.功能高分子学报Vol.36No.4340JournalofFunctionalPolymers2023年8月97.5%102.5%.Key words:bovineserumalbumin；surfaceplasmonresonance；molecularlyimprintedpolymer；poly(acrylicacid)；hydrolyzedpoly(2-methyl-2-oxazoline)牛血清蛋白（BSA）是牛血浆中最丰富的蛋白质，具有平衡渗透压和维持营养运转的功能1,2。BSA 作为胎牛血清的核心成分，通常用于疫苗生产的培养基，但是由于其可能会导致人体过敏反应，因此对 BSA 的痕量检测至关重要3。BSA 的检测方法包括气相色谱（GC）、液相色谱（LC）、毛细管电泳（CE）和酶联免疫吸附试验（ELISA）等。这些方法虽然可以提供准确的测定结果，但存在样品处理复杂、使用过程中需要消耗大量试剂与时间以及需要标记等缺点4-6。因此十分必要开发出一种便捷、快速、高效的检测方法。表面等离子共振（SPR）技术是一种光学检测技术，基于表面等离子共振原理所设计的生物传感器具有无标记、实时测量、选择性高、灵敏度高和分析时间短等特点7-10，被广泛用于食品安全11,12、环境污染物控制13,14和临床诊断15,16等多个领域。在使用 SPR 生物传感器检测分析物时，通常需要在传感器上修饰被分析物的识别元件，通过被分析物与识别元件之间的相互作用所引起的传感器表面折射率的变化，实现对分析物的检测。通常选择生物抗体作为识别元件，如 Wang 等17将鼠抗 BSA 单克隆抗体偶联于 SPR 生物传感器芯片表面用来检测 BSA。生物抗体往往昂贵且不稳定，因此发展一种稳定且成本低的人工抗体是十分必要的。近年来，分子印迹聚合物（MIP）在替代生物抗体方面表现出巨大潜力。MIP 是在模板分子存在下制备的聚合物，因为存在与模板分子大小、形状和官能团互补的印迹位点，可以特异性识别目标分子，同时具有与生物抗体相同的亲和力和选择性18,19。相比于生物抗体，MIP 具有成本低、制备简单和物理/化学稳定性更佳等优点20-22。蛋白质具有尺寸大、结构复杂等特点，因此蛋白质印迹聚合物存在洗脱困难、吸附效率低等缺点23,24。为了克服这些缺点，研究人员开发出许多新方法，其中表面印迹技术因产生的印迹位点分布在印迹层的表面或表面层附近，减弱了蛋白质分子的传质阻力，有利于大尺寸蛋白质的洗脱和再结合，从而引起较多关注25。保证印迹过程中蛋白质的构像完整性是影响印迹效率的关键因素，而 BSA 是水溶性大分子，因此在水介质中实现印迹过程是至关重要的。多巴胺（DA）可以在弱碱性水溶液中发生自聚合或在弱酸性至中性水溶液中加入氧化剂而发生聚合，并且可以黏附在不同的基材上形成聚多巴胺（PDA），因此被广泛用于分子印迹中26-28。虽然 PDA 中大量官能团有利于形成高亲和性印迹位点，但是位于非印迹区域的官能团会加剧蛋白质的非特异性吸附29,30。Li 等31提出了印迹后修饰策略以减少 PDA 的非特异性吸附，即在洗脱 BSA 之前，通过表面引发的原子转移自由基聚合，将抗蛋白质聚合物-两性离子聚（2-甲基丙烯酰氧乙基磷酸胆碱）链接枝到 BSA 印迹微球上，MIP 的印迹因子（IF）从 1.53 提高到 5.74。此方法相对复杂，且刷状抗蛋白聚合物会导致印迹层厚度增加，进而会影响模板的传质效率。Pan 等32通过水解聚（2-甲基-2-噁唑啉）（PMOXA-EI）主链上的仲胺与 PDA 之间的迈克尔加成反应，在 PDA 涂层表面接枝了 PMOXA-EI。研究表明，PMOXA-EI 不仅具有阻抗蛋白质吸附的功能，而且是以非刷状结构存在于涂层表面。相对于刷状结构，其较薄的涂层厚度将有利于模板的传质过程。本文以 BSA 为模板分子，通过聚丙烯酸（PAA）与 BSA 的氢键作用预先固定 BSA，以 DA 为功能单体及交联剂、高碘酸钠（SP）为氧化剂在金片上形成表面印迹层。之后，通过迈克尔加成反应在 PDA 非印迹区域接枝 PMOXA-EI，以减少蛋白质非特异性吸附，最后洗脱 BSA 模板分子。通过 SPR 研究 BSA 印迹聚合物（BSA-MIP）生物传感器的特异性、选择性和重复性，并在混合蛋白质溶液中进行 BSA 的检测。1 实验部分 1.1 原料和试剂丙烯酸（AA）、二甲基甲酰胺（DMF）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司，通过减压蒸馏提纯；SP、乙醇胺、乙醚、十二烷基三硫代碳酸酯、氢氧化钠（NaOH）、浓盐酸、乙酸（HAc）、十二烷基磺酸钠（SDS）：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；2-甲基-2-噁唑啉（MOXA）：分析纯，Sigma-Aldrich化学品有限公司，用氢化钙干第4期胡子凡，等：基于分子印迹聚合物的SPR传感器用于牛血清蛋白的检测341燥后蒸馏提纯；偶氮二异丁腈（AIBN）：分析纯，天津光复精细化工研究所，通过乙醇重结晶提纯；盐酸多巴胺、三氟甲磺酸甲酯（MeOTf）：分析纯，Sigma-Aldrich化学品有限公司；邻苯二甲酰亚胺钾：分析纯，阿拉丁化学试剂（上海）有限公司；BSA、细胞色素 C（CytC）、卵白蛋白（OVA）、-乳球蛋白（BLG）：生物试剂纯度，Sigma-Aldrich化学品有限公司；溶菌酶（Lyz）：生物试剂纯度，Amresco 生化试剂有限公司；本工作使用的水是由实验室水净化系统（Hhitech,China）制备的超纯水（18.2Mcm）。1.2 测试与表征核磁共振氢谱仪（1H-NMR）：瑞士 Bruker 公司 AVANCE300 型，测试频率为 300MHz，所用溶剂为重水（D2O）。X 射线光电子能谱仪（XPS）：英国 VG公司 ESCALABMK型，激发源为 Al（K）单色射线（能量1486.6eV），光电子的起始角为 90，光斑尺寸为 500m。可变角光谱椭偏仪（VASE）：美国 J.A.Woollam 公司 M-2000 型，光谱范围为 3701000nm，入射角为 70和 80，用 CompleteEasy4.81软件进行拟合，基于广义柯西层模型得到涂层厚度，每组设置 3个平行样。原子力显微镜（AFM）：德国 Bruker 公司 DimensionIcon 型，以轻敲模式进行，用 Nanoscopev9.2 软件进行数据采集和分析。接触角（CA）测量仪：美国 KINO公司 SL200KS型，使用停滴法测量芯片表面的静态水接触角（WCA），每次测量所用超纯水为 2L，样品测量前在相同 pH 和离子强度（I）的溶液中浸泡 0.5h，并立即用氮气干燥，每组设置 3个平行样。表面等离子体共振仪：美国 GEHealthcare公司 BioScienceT200型，实时研究蛋白质吸附和脱附行为，SPR 的响应信号以共振单位的变化量（R）即 SPR 响应信号在基线信号与最终吸附信号之间的差值来表示。在 SPR技术中，分子相互作用所引起的共振角变化能反映出结合在传感芯片表面的物质质量的变化，R=10RU相当于 1cm2芯片表面上蛋白质的质量变化约 1.0ng。1.3 聚合物的制备33,34以 MeOTf为引发剂引发 MOXA的阳离子开环聚合（引发剂和单体的物质的量之比为 125），加入氢氧化钠的甲醇溶液终止活性链，制得 PMOXA-OH。通过核磁共振氢谱（1H-NMR）测得 PMOXA的聚合度为 40。将制得的 PMOXA-OH 溶于 HCl 溶液（w=16.8%）中，在 100 下加热搅拌回流 50min，冷却至室温后加入氢氧化钠溶液调节 pH 至 9 附近，制得部分水解的 PMOXA（PMOXA-EI）。通过1H-NMR 测得其水解度为 36%。以 AIBN为引发剂、十二烷基三硫代碳酸酯为链转移剂、AA为单体（引发剂和单体的物质的量之比为120），通过可逆加成-断裂链转移（RAFT）聚合合成 PAA，再加入乙醇胺制得巯基封端的 PAA（PAA-SH）。通过1H-NMR 测得 PAA-SH 的聚合度为 13。1.4 BSA-MIP 芯片的制备首先将金片（Au）相继在丙酮、乙醇、水中超声清洗 30min，氮气吹干后浸入新鲜食人鱼溶液（H2SO4-H2O2，H2SO4与 H2O2的体积比为 73）于 40 下浸泡 12h，再用大量超纯水和乙醇冲洗，氮气吹干。将清洗后的芯片 Au 于 25下浸入 PAA-SH 水溶液（1mg/mL）中 24h，用超纯水冲洗，氮气吹干，得到 PAA-SH 改性的芯片（Au-PAA）。然后将 Au-PAA 芯片浸入 2mLBSA 的 PBS 溶液（0.1mg/mL，pH=5.0）中，于室温下振荡45min 固定 BSA；相继加入 2mLDA 的 PBS 溶液（2mg/mL，pH=5.0）和 0.5mLSP 的 PBS 溶液（4mg/mL，pH=5.0），于室温下振荡 40min，用超纯水冲洗芯片，氮气吹干，得到 Au-PAA-BSA-PDA 芯片。接着将芯片浸入 2mLPMOXA-EI 的 PBS 溶液（2mg/mL，pH=7.4）中于 30 下反应 4h，即得到 BSA 印迹后修饰聚合物芯片（BSA-MIPbeforeelution）。最后将 BSA-MIPbeforeelution 芯片浸入 SDS 的 HAc 溶液（10gSDS 溶于100mLHAc（=5%）溶液，pH=3.0），除去模板蛋白 BSA，即得到 BSA-MIP 芯片（图 1）。非印迹聚合物（NIP）芯片除不加 BSA 外，其他制备步骤与上述方法相同。1.5 BSA-MIP 生物传感器对 BSA 的吸附实验将生物传感器芯片安装在 SPR样品架上，用 PBS 溶液（I=10mmol/mL，pH=5.0，下同）冲洗样品 200s 以获得基线信号，将 BSA 的 PBS 溶液通过芯片表面 600s，使蛋白质在芯片表面吸附。随后再用 PBS 溶液通过芯片表面 200s，除去表面吸附不牢固的蛋白质。每组设置 4个平行样。为了消除背景溶液的影响，测试了PBS 溶液在 BSA-MIP 生物传感器芯片上引起的 SPR 共振单位的变化量，后续 BSA-MIP 生物传感器对蛋白质溶液的吸附结果均减去该 SPR 共振单位的变化量。342功能高分子学报第36卷通过 SPR 测量 BSA-MIP 生物传感器在 BSA 水溶液（0.110g/mL）中的吸附量，并绘制 BSA 水溶液质量浓度为 0.12.5g/mL 的标准曲线。检测限(LOD)和定量限（LOQ）计算公式分别为：LOD=3.3S/m，LOQ=10S/m，其中 S 为 Y 轴截距的标准偏差，m 为线性曲线斜率34。1.6 选择性实验OVA 和 Lyz 分别是用于疫苗生产的酸性蛋白和碱性蛋白35,36，因此选择了这 2 种蛋白作为参比蛋白。同时为了提高实验的可靠性和准确性，增加了酸性蛋白 BLG 和碱性蛋白 CytC 两种参比蛋白。将上述蛋白分别溶解于 PBS 缓冲液中，质量浓度固定为 10g/mL。每组设置 4个平行样。用印迹因子（IF）来评估 BSA-MIP 生物传感器的特异性结合能力，用选择性系数（k）来评估其选择性：IF=RMIP/RNIP(1)k=Rtemplate/Rcontrol(2)RMIPRNIPRtemplateRcontrol其中，和分别是同一蛋白在 BSA-MIP 和 NIP 生物传感器上 SPR 共振单位的变化量；和分别为模板蛋白和参比蛋白在同一生物传感器上 SPR 共振单位的变化量。1.7 重复性实验为了评估 BSA-MIP 生物传感器的重复性，在同一芯片上进行平衡-吸附-再生循环实验。平衡-吸附过程如 1.5 节所述，吸附过程使用 10g/mLBSA 的 PBS 溶液，再生过程使用 SDS 的 HAc 溶液流过芯片表面 60s，将芯片吸附的 BSA 去除。每组设置 4个平行样。1.8 混合蛋白质中 BSA 的检测为了评估 BSA-MIP 生物传感器在复杂背景下的应用潜力，进行了混合蛋白质中 BSA 的检测实验。制备 BSA、BLG、OVA、Lyz 和 CytC5 种蛋白的混合溶液，BLG、OVA、Lyz 和 CytC 这 4 种蛋白的质量浓度均为 0.4g/mL，改变 BSA 的质量浓度，依次为 0、0.4、0.6、0.8g/mL。每组设置 4个平行样。2 结果与讨论 2.1 生物传感器芯片的表征通过 XPS 研究 Au-PAA、BSA-MIPbeforeelution、BSA-MIP 和 NIP 芯片表面的化学组成，结果如表 1 所示。由于表面印迹获得的涂层较薄，因此在所有谱图中都能观察到 Au 的特征峰。对于 Au-PAA，观察到 C1s峰（285eV）、O1s 峰（532eV）和 S2p 峰（162eV），说明金片成功修饰了 PAA-SH。由于样品制备过程中不可避AuAu-PAABSA-MIPBSA-MIP before elutionAu-PAA-BSA-PDASPDAPAA-SHBSAElutionPMOXA-EISHOOCHOHONH2SHCOOHnSSSSSSSSSSSSSS图1BSA-MIP 生物传感器的制备示意图Fig.1SchematicillustrationofthepreparationofBSA-MIPbiosensor第4期胡子凡，等：基于分子印迹聚合物的SPR传感器用于牛血清蛋白的检测343免存在污染，也观察到了 N1s 峰（400eV）。由于 BSA 中存在 17 个二硫键和 1 个自由巯基，导致 BSA-MIPbeforeelution 的 S 信号相比 Au-PAA 略微增强，同时由于形成印迹层导致 C 和 N 信号增强。洗脱 BSA 之后，BSA-MIP 的 S 信号下降，与 NIP 基本一致。与 Au-PAA 相比，BSA-MIPbeforeelution 的 CN 与 CC 物质的量之比从 24%增加到 28.1%，说明表面印迹层成功形成。BSA-MIP 的 CN 与 CC 物质的量之比进一步增大到 34.2%，NIP 的 CN 与 CC 物质的量之比为 41.1%。这些结果表明 BSA-MIP 生物传感器成功制备。用 AFM 表征生物传感器芯片的表面形貌和表面粗糙度，结果如图 2（a）所示。裸金片的深度和均方粗糙度（Rq）分别为 3.2nm 和 0.85nm，经过 PAA-SH 修饰后，Au-PAA 的深度与 Rq分别增加至 5.4nm 和 1.23nm，表明 PAA-SH 以 SAu 键的形式成功接在芯片表面。BSA-MIP 和 NIP 的深度和 Rq都进一步增大，说明 DA 在(a)AuBSA-MIPAu-PAANIP3.203.20.61017.30.3500400300200100100200300400500500400300200100100200300400500100100200300400500100100200300400500200300400500200300400500(b)9080.848.971.454.338.835.480706050Water contact angle/()403020100AuAu-PAAAu-PAA-BSA-PDABSA-MIP before elutionBSA-MIPNIP图2SPR 生物传感器芯片的(a)AFM 图像(单位：nm)和(b)水接触角Fig.2(a)AFMimages(Unit:nm)and(b)WCAofSPRbiosensorchips表1SPR 生物传感器芯片表面的元素组成Table1ElementalcompositionsonthesurfaceofSPRbiosensorchipsSamplef/%f(N)/f(C)Au4fO1sN1sS2pC1sAu-PAA32.315.54.12.745.50.090BSA-MIPbeforeelution19.917.15.52.954.70.100BSA-MIP14.211.313.71.465.50.209NIP13.514.19.41.261.80.152f:Molarfractionofelement344功能高分子学报第36卷芯片表面发生聚合形成印迹层和非印迹层。相比于 NIP，BSA-MIP 的深度和 Rq进一步增加到 10.0nm 和2.61nm，这主要是因为其表面印迹位点的存在。通过可变角光谱椭偏仪测量传感器芯片上涂层的厚度。经过 PAA-SH 修饰后，Au-PAA 的芯片厚度增加至 1.92nm。Au-PAA-BSA-PDA 厚度达到 5.4nm，这说明成功形成了 PDA 印迹层。BSA-MIPbeforeelution 厚度达到 6.8nm，厚度仅增加 1.4nm，这主要是因为 PMOXA-EI 是非刷状结构。洗脱后，BSA-MIP 的厚度为6.1nm，这说明除了模板 BSA 外，一些松散接枝的 PMOXA-EI 也被去除。NIP 厚度为6.4nm，与 BSA-MIP 的厚度基本一致。椭偏仪测量的涂层厚度变化与 AFM 测得涂层深度变化基本一致，表明 BSA-MIP 生物传感器的成功制备。亲水性会影响生物传感器芯片对蛋白质的吸附效果，因此对芯片进行静态水接触角测量，结果如图 2（b）所示。裸金片经过食人鱼溶液清洗后，呈现出较高的疏水性。芯片表面修饰 PAA-SH 后，由于羧基的存在，WCA 从 80.8下降到 48.9。Au-PAA-BSA-PDA 的 WCA 增加至 71.4，这可能是因为此时表面裸露的 BSA 含有疏水结构，导致该表面呈现疏水性。虽然 BSA 是水溶性大分子，但是其分子结构中也含有疏水部分。这种疏水部分裸露在表面，可能导致该表面呈现较高的接触角。经过 PMOXA-EI 修饰后，BSA-MIPbeforeelution的 WCA 下降至 54.3，这主要是因为 PMOXA-EI 具有优异的亲水性。洗脱后，BSA-MIP 的 WCA 进一步下降至 38.8，与 NIP 的 WCA（35.4）基本一致。BSA-MIP 洗脱前后 WCA 发生较大改变，这主要是因为模板 BSA被洗脱掉，亲水性增加，同时也说明成功形成了印迹位点。2.2 BSA-MIP 生物传感器对 BSA 的吸附研究BSA-MIP 生物传感器对 BSA 的吸附在 10min 内就可以达到吸附平衡（图 3（a），这是因为印迹位点能与 BSA 快速结合。BSA-MIP 生物传感器的 SPR 响应信号随着 BSA 质量浓度的增加而增加，当 BSA 的质量浓度达到 5g/mL 时基本上已经达到饱和，说明此时印迹位点已经被完全占据。BSA-MIP 生物传感器在BSA 质量浓度为 0.12.5g/mL 之间呈现良好的线性关系，标准曲线的回归方程（图 3（b）为 y=214.633x+3.460，R2达到 0.9923，LOD 和 LOQ 分别为 53ng/mL 和 161ng/mL。(BSA)/(gmL1):0.10(a)0.250.501.002.505.0010.001 4001 2001 000Response change/RU8006004002000200400600t/s8001 0001 20002000.51.01.52.02.5(BSA)/(gmL1)600500400Response change/RU3002001000y=214.633x+3.460R2=0.992 3(b)图3BSA-MIP 生物传感器对 BSA 的(a)SPR 响应和(b)标准校准曲线Fig.3(a)SPRresponseand(b)standardcalibrationcurveofBSAonBSA-MIPbiosensor为了进一步研究 BSA-MIP 生物传感器对 BSA 的吸附机制，采用 Langmuir 模型、Freundlich 模型、Langmuir-Freundlich 模型对其进行吸附等温线分析37。拟合结果如表 2 所示，吸附等温线数据与 Langmuir 模型最为吻合（R2=0.9975），说明 BSA 印迹位点是单层且分布均匀的。2.3 选择性BSA-MIP 生物传感器对 4 种参比蛋白的吸附能力远低于模板蛋白 BSA，BLG、OVA、Lyz 和 CytC 的 k值（表 3），分别为 4.43、3.45、3.17 和 3.64，这说明 BSA-MIP 生物传感器具有较高选择性，能够选择性识别BSA。BLG、OVA、Lyz 和 CytC 的 IF 分别为 1.58、1.70、2.03 和 1.83，远低于 BSA 的 4.26，表明制备的 BSA-MIP 生物传感器成功形成了 BSA 的识别位点，能够特异性识别模板蛋白 BSA。与 BSA-MIP 生物传感器相比，NIP 生物传感器对所有蛋白吸附能力都较低。第4期胡子凡，等：基于分子印迹聚合物的SPR传感器用于牛血清蛋白的检测345 2.4 重复性BSA-MIP 生物传感器结合 BSA 的重复性实验结果如图 4 所示，在 6 次平衡-吸附-再生循环实验中，以第1 次测量的 SPR 响应变化量为 100%，后续相应值对第 1 次的百分比定义为重用率。由图 4 可以看出：BSA-MIP 生物传感器的信号未见明显降低，标准偏差系数（RSD）仅为 6.2%，说明分子印迹层中识别位点的结合能力没有明显改变，表明 BSA-MIP 生物传感器具有良好重复性，可重复用于 BSA 的检测。2.5 混合蛋白质中 BSA 的检测BSA-MIP 生物传感器在混合溶液中对 BSA 的检测结果如表 4 所示，传感器的 SPR 响应信号随着混合溶液中 BSA 质量浓度的增大而增大。当（BSA）=0 时（即不含 BSA），BSA-MIP 生物传感器的吸附能力较差，这是因为 BSA 尺寸较大，BSA 印迹位点可能会被小尺寸的蛋白质占领。当（BSA）为 0.40.8g/mL 时，回收率为 97.5%102.5%，这说明混合溶液中参比蛋白基本不会影响 BSA-MIP 生物传感器对 BSA 的特异性识别。100752550Reuse rate/%0123Recycles456图4BSA-MIP 生物传感器结合 BSA 的重复性实验Fig.4ReuseexperimentsoftheBSA-MIPbiosensorbindingBSA表2BSA-MIP 生物传感器的等温吸附线参数Table2IsothermparametersforBSA-MIPbiosensorModelParameterRmax/RUKA/(gmL1)KD/(mLg1)1/nR2Langmuir1)1086.960.20444.89130.9975Freundlich2)203.300.93850.9771Langmuir-Freundlich3)454.550.39292.54550.93850.9873R=Rmax/(KD+)R=Rmax1/nR=Rmax1/n/(KD+1/n)1)Langmuir:,whereRistheadsorptioncapacityofbiosensorcalculatedbymeasuringthechangeofSPRresponsesignalbetweenbaselinesignalandfinaladsorptionsignal,isthemassconcentrationoftemplateproteinBSA,KDarereverseequilibriumconstants,subscriptmaxindicatesmaximum;2）Freundlich:,1/n istheFreundlichsunmixedmarker,subscriptmaxindicatesmaximum;3)Langmuir-Freundlich:,KDandKAarereverseandforwardequilibriumconstants,respectively,subscriptmaxindicatesmaximum表3对比蛋白的选择性和相对选择性系数Table3SelectivityandrelativeselectivitycoefficientsforcompetitorproteinsProteinMwMIPNIPIFRkRkBSA6.641041242.28291.534.26BLG1.84104280.554.43177.131.651.58OVA4.45104360.483.45212.631.371.70Lyz1.43104391.553.17192.481.512.03CytC1.23104341.203.64186.801.561.83表4BSA-MIP 生物传感器在混合溶液中对 BSA 的检测Table4BSAdetectioninmixedsolutionbyBSA-MIPbiosensor(BSA)/(gmL1)(Founded)/(gmL1)Recoveryrate/%RSD/%00.050.030.40.390.0697.515.30.60.590.0698.310.10.80.820.05102.56.1346功能高分子学报第36卷因此，BSA-MIP 生物传感器具备在混合蛋白质溶液中检测 BSA 的能力。3 结论(1)结合模板前定位、表面印迹和印迹后修饰策略制备了 BSA 印迹 SPR 传感器，可用于实时检测 BSA。(2)当(BSA)=0.12.5g/mL 时，BSA-MIP 生物传感器呈现良好的线性关系，R2为 0.9923,LOD 和 LOQ分别为 53ng/mL 和 161ng/mL。(3)BSA-MIP 生物传感器表现出高度选择性和重复性。(4)BSA-MIP 生物传感器能够在混合蛋白质溶液中检测 BSA，有一定实际应用的潜力。参考文献：WANGYY,HANM,LIUGS,HOUXD,HUANGYN,WUKB,LICY.Molecularlyimprintedelectrochemicalsensinginterfacebasedonin-situ-polymerizationofamino-functionalizedionicliquidforspecificrecognitionofbovineserumalbuminJ.BiosensorsandBioelectronics，2015，74：792-798.1JAHANBAN-ESFAHLAN A,OSTADRAHIMI A,JAHANBAN-ESFAHLAN R,ROUFEGARINEJAD L,TABIBIAZAR M,AMAROWICZ R.Recent developments in the detection of bovine serum albumin J.International Journal of 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